基于網(wǎng)絡藥理學探究小青龍湯治療新型冠狀病毒肺炎的作用機制

摘要：基于網(wǎng)絡藥理學探究小青龍湯治療新型冠狀病毒感染（COVID-19）的作用機制。應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）篩選小青龍湯8味中藥的活性成分，運用PubChem、SwissTargetPrediction和TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取中藥的潛在作用靶點；運用OMIM、DisGeNET和GeneCards 數(shù)據(jù)庫篩選COVID-19和Delta variant of COVID-19相關靶點；利用Venny 2.1在線工具篩選出小青龍湯靶點和COVID-19靶點的交集并作維恩圖；應用Cytoscape 3.7.2 軟件構建小青龍湯-成分-（COVID-19）-靶點網(wǎng)絡；利用STRING數(shù)據(jù)庫收集數(shù)據(jù)，并在線構建蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡；應用Metascape數(shù)據(jù)庫進行基因本體（gene ontology， GO）和基于京都基因與基因組百科全書 （ Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析，借助微生信在線繪圖工具繪制GO和KEGG富集分析圖。利用AutoDockTools 1.5.6軟件進行分子對接。篩選得到小青龍湯有效活性成分共169個及靶點1 363個，藥物與疾病相交靶點292個， 得到GO富集分析中生物過程共2 393條，細胞成分共168條，分子功能共264條，KGGG通路共225條。分子對接結果顯示篩選出的小青龍湯核心成分與COVID-19相關靶點結合良好。該研究揭示了小青龍湯可能通過作用于TNF、AKT1、GAPDH、IL-6、ALB、TP53、IL-1β、VEGFA、STAT3、EGFR等靶點，參與MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等通路治療COVID-19。

關鍵詞：小青龍湯；新型冠狀病毒感染；網(wǎng)絡藥理學；作用機制

中圖分類號：R285；R256.1文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2023）03-0010-08

Abstract∶This research aims to study the mechanism of Xiaoqinglong Decoction in the treatment of coronavirus disease 2019 （COVID-19） based on network pharmacology. The traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP） online tool was used to screen the active ingredients of Xiaoqinglong Decoction. PubChem， SwissTargetPrediction， and TCMSP databases were used to obtain the potential targets of eight traditional Chinese medicines. OMIM， DisGeNET， and GeneCards databases were used to obtain COVID-19 and delta variant of COVID-19 related targets. The intersecting targets of eight traditional Chinese medicines and Xiaoqinglong decoction and COVID-19 were screened using online tool Venny 2.1， and a Venn diagram was prepared. The Cytoscape 3.7.2 software was used to construct Xiaoqinglong Decoction-components-（COVID-19）-target network. After using STRING database to collect data， protein-protein interaction network was built online. Metascape database was used for gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） enrichment analysis， and the GO and KEGG enrichment analysis maps were plotted using Weishengxin online plotting tool. Molecular docking was performed using the AutoDockTools 1.5.6 software. A total of 169 active ingredients， 1 363 targets of Xiaoqinglong Decoction， and 292 intersecting targets of drugs and diseases were screened. A total of 2 393 biological process， 168 cell components， 264 molecular functions were obtained via GO enrichment analysis. A total of 225 pathways were obtained via KEGG. Molecular docking showed that the core components of Xiaoqinglong Decoction screened in this study combined well with the COVID-19 related targets. Xiaoqinglong Decoction could treat COVID-19 through TNF， AKT1， GAPDH， IL-6， ALB， TP53， IL-1β， VEGFA， STAT3， EGFR， and other targets and participate in MAPK signaling pathway， PI3K-Akt signaling pathway， AGE-RAGE signaling pathway in diabetes complications， and other pathways.

Key words∶Xiaoqinglong Decoction; COVID-19; network pharmacology; action mechanism

小青龍湯出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治中篇》，作為麻黃湯類方之一，其以散寒蠲飲功效而著稱[1]。小青龍湯的組成為麻黃、五味子、芍藥、炙甘草、細辛、干姜、桂枝、半夏，臨床上廣泛應用于治療支氣管炎、支氣管哮喘、過敏性咳嗽和一些肺部疾病[2-5]。

新型冠狀病毒感染（coronavirus disease 2019，COVID-19）是一種人體感染新型冠狀病毒引起的急性呼吸道傳染病[6]。發(fā)熱和咳嗽是COVID-19患者的主要癥狀，有的還伴有乏力、惡寒、肌痛等，這些都與小青龍湯的主治功效相符合[7]。COVID-19的病原體不斷進化和變異，產(chǎn)生新的傳播速度更快、病毒強度更強的變異株[8]。第一代新冠病毒、德爾塔變異毒株和奧密克戎變異株，其病機核心都為濕、毒、瘀、虛[9-11]。有研究表明，小青龍湯中的中藥成分對重癥肺炎患者有治療作用，可以提高患者免疫細胞的活性，對炎癥因子的表達有抑制作用，對增強肺炎患者的機體抵抗力有重要意義[12-14]。

應用網(wǎng)絡藥理學篩選小青龍湯作用靶點和疾病對應靶點，并取兩者作用交集建立藥物-靶點-通路，探究小青龍湯治療COVID-19的作用機制，為揭示小青龍湯在臨床應用中的科學內(nèi)涵奠定基礎。

1材料與方法

1.1小青龍湯活性成分的篩選

應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），以口服生物利用度（oral availability，OB）≥30%與藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18作為條件篩選小青龍湯中的8味中藥的活性成分。

1.2小青龍湯的潛在作用靶點

應用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集小青龍湯8味中藥的潛在作用靶點；通過PubChem數(shù)據(jù)庫收集SMILES（simplified molecular input line entry system）號，在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫輸入SMILES號獲得藥物成分靶點，將兩種方法獲得的靶點進行整理，刪除重復靶點。

1.3COVID-19疾病相應靶點的收集

以“COVID-19”和“Delta variant of COVID-19”為檢索詞在OMIM、DisGeNET和GeneCards三個數(shù)據(jù)庫查找與其相關的基因靶點，最后篩選得到1 323個靶點。

1.4藥物-（COVID-19）靶點交集的獲取

將小青龍湯8味中藥有效成分的靶點與COVID-19疾病的靶點導入到Venny 2.1在線工具中，篩選出藥物與疾病交集靶點，即小青龍湯有效成分直接作用COVID-19的靶點，并作維恩圖。

1.5構建蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡

將小青龍湯和COVID-19的交集靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中。通過該數(shù)據(jù)庫獲得蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析結果。將數(shù)據(jù)結果導入到Cytoscape 3.7.2 軟件中作圖。通過PPI網(wǎng)絡篩選出核心靶點，將核心靶點映射到活性成分上，得到關鍵活性成分[15]。

1.6小青龍湯-有效成分-（COVID-19）-靶點網(wǎng)絡的構建

將處理好的小青龍湯與COVID-19的數(shù)據(jù)導入 Cytoscape 3.7.2 軟件中，應用此軟件進行小青龍湯-有效成分-（COVID-19）-靶點網(wǎng)絡的構建。

1.7GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

應用Metascape數(shù)據(jù)庫對小青龍湯作用于COVID-19的生物過程及調(diào)控通路進行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，將分析所得數(shù)據(jù)處理后導入微生信在線繪圖工具繪制GO和KEGG富集分析圖。

1.8分子對接

利用AutoDockTools 1.5.6軟件進行分子對接。下載化合物的mol2格式，下載COVID-19相關靶點蛋白ACE2（PDB ID：1R4L）和PLP（PDB ID：4OVZ）的pdb格式。選取小青龍湯中排名靠前的化合物與COVID-19相關靶點蛋白進行分子對接。

2結果

2.1小青龍湯活性成分的篩選結果

應用TCMSP數(shù)據(jù)庫，按照篩選條件最后獲得麻黃23個、半夏13個、芍藥13個、桂枝7個、細辛8個、炙甘草92個、干姜5個、五味子8個活性成分。

2.2小青龍湯的潛在靶點的預測結果

本研究應用SwissTargetPrediction、TCMSP、PubChem預測小青龍湯活性成分的作用靶點，篩選后獲得干姜活性成分作用靶點454個、炙甘草活性成分作用靶點8 065個、桂枝活性成分靶點272個、五味子活性成分靶點728、半夏活性成分靶點893個、芍藥活性成分靶點716個、麻黃活性成分靶點2 164個、細辛活性成分靶點455個、小青龍湯活性成分的交集靶點1 363個，見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。

2.3COVID-19疾病相應靶點的收集結果

應用相關疾病數(shù)據(jù)庫進行COVID-19疾病相應靶點收集，篩選靶點并去掉其重復值共得到1 323個靶點。

2.4藥物-（COVID-19）靶點交集的獲取結果

將小青龍湯有效成分的靶點與COVID-19的靶點導入到微生信在線工具中，篩選出交集靶點共292個，即小青龍湯有效成分直接作用COVID-19的靶點。

2.5PPI網(wǎng)絡的構建分析

將藥物和疾病的交集基因上傳到STRING數(shù)據(jù)庫得到文本數(shù)據(jù)，Cytosccape 3.7.2軟件用于繪制網(wǎng)絡圖。以degree值，betweenness值和closeness值大于其平均值為標準來篩選小青龍湯干預COVID-19的核心靶點，篩選出242個核心靶點。根據(jù)degree值大小，挑選出小青龍湯治療COVID-19排名前10的核心作用靶點TNF、AKT1、GAPDH、IL-6、ALB、TP53、IL-1β、VEGFA、STAT3、EGFR，這些核心靶點在PPI網(wǎng)絡中起著關鍵作用，可能是小青龍湯治療COVID-19的重要靶點，見圖1。

2.6活性成分-（COVID-19）-靶點網(wǎng)絡的構建分析

應用Cytoscape 3.7.2軟件建立小青龍湯藥物活性成分-（COVID-19）-靶點網(wǎng)絡，由于獲得的潛在交集靶點較多，選取了前150個關鍵靶點作圖，網(wǎng)絡圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。該網(wǎng)絡由450個節(jié)點組成了4 067條邊；該網(wǎng)絡中最大度值81，平均度值9.603；該網(wǎng)絡中綠色長方形代表交集靶點，粉紅色橢圓形代表小青龍湯的的活性成分，藍色菱形為中藥，橙色菱形為疾病COVID-19。圖中GJ代表桂枝、GZ代表干姜、MH代表麻黃、SY代表芍藥、WWZ代表五味子、XX代表細辛、BX代表半夏、GC代表炙甘草；A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1、H1、I1、J1、K1代表中藥的交集成分。

2.7GO功能和KEGG通路富集分析

將292個小青龍湯和COVID-19的交集靶點導入到Metascape數(shù)據(jù)庫，分析小青龍湯作用于COVID-19的生物過程及調(diào)控通路，將分析所得數(shù)據(jù)處理后導入微生信在線繪圖工具繪制GO和KEGG富集分析圖。

GO富集分析中生物過程（biological process， BP）共2 393條，分子功能（molecular function，MF）共264條，細胞組成（cell component，CC）共168條，各取前10個聚類中具有代表性的通路，見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表2、圖2。

KEGG通路分析，共得到225條通路信號。依據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，選出排名前20的KEGG通路，其中PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等信號通路可能直接或間接參與小青龍湯治療COVID-19的作用，見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表3、圖3。

2.8分子對接結果分析

為了更好地說明小青龍湯有效成分與COVID-19相關靶點蛋白的關系，選取排名前15的化合物槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、兒茶素、黃芩苷、芍藥苷、甘草酚、松柏素、甘草黃酮、光甘草寧、半甘草異黃酮B、丁子香萜、豆甾醇、紫杉醇、柚皮素與COVID-19相關靶點蛋白進行分子對接。ACE2是中醫(yī)藥防治COVID-19感染的一個潛在的藥物作用靶點[16]。冠狀病毒木瓜樣蛋白酶 （PLP） 主要作用于冠狀病毒復制過程中[17]。根據(jù)打分規(guī)則，以結合能≤-5.0 kJ/mol的條件篩選作用靶蛋白[18]，本研究分子對接結果基本均滿足篩選條件，見表1。根據(jù)對接結果，選取了ACE2與黃芩苷、β-谷甾醇，PLP與黃芩苷分子對接結果進行可視化展示，見圖2。

3討論

現(xiàn)代臨床上常用小青龍湯配合西醫(yī)治療支氣管炎、肺炎等，在COVID-19的治療中，也使用了小青龍湯辨證加減，獲得了不錯的效果[19]。

本研究通過SwissTargetPrediction、TCMSP、PubChem等數(shù)據(jù)庫挑選出小青龍湯治療COVID-19的活性成分共169個，共得交集靶點1 363個，其中跟COVID-19相關的靶點292個。通過網(wǎng)絡分析可以發(fā)現(xiàn)小青龍湯治療COVID-19的主要化合物有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、黃芩苷、兒茶素和芍藥苷等。槲皮素有抗氧化、抗腫瘤、抑制炎癥、抑菌和保護心血管的藥理作用，其主要機制是調(diào)節(jié)氧化應激反應和活性氧介導下游信號通路，還可以抑制T、B細胞的增殖[20-21]。山柰酚是一種黃酮醇類化合物，具有抑炎抑菌，抑制蛋白激酶，保護神經(jīng)、心肌和肝臟等藥理作用[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素和山柰酚都可以抑制MAPK信號通路來發(fā)揮抗炎作用[23]。β-谷甾醇對炎癥、抑郁、腫瘤等有治療作用[24]。黃芩苷能夠清除氧自由基、促進細胞凋亡、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫[25]，還具有體內(nèi)外抗肺炎支原體作用[26]。兒茶素和黃芩苷對COX作用，具有抗炎解熱作用[27]。芍藥苷可以改善機體的免疫力，具有擴張血管、抗血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧化等藥理作用[28]。

PPI網(wǎng)絡篩選出TNF、AKT1、GAPDH、IL-6、ALB、TP53、IL-1β、VEGFA、STAT3、EGFR可能是在小青龍湯治療COVID-19的過程中發(fā)揮重要作用的關鍵靶點。TNF-α、IL-6和IL-1β是促炎性細胞因子。AKT1參與周期蛋白的磷酸化過程，抑制細胞凋亡，促進其增殖[29]。GAPDH是一種重要的催化酶，涉及細胞內(nèi)糖酵解代謝過程，可以與多種蛋白、RNA或者端粒DNA相互作用，在癌癥、自身免疫性疾病中有重要作用[30]。ALB是一種多效性蛋白質，有調(diào)節(jié)組織與血管之間水分的動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)炎癥基因轉錄的作用[31-32]。VEGFA是一種血管內(nèi)皮生長因子，在炎癥和腫瘤中有重要作用[33]。研究表明，肺炎支原體感染引起的呼吸道疾病可能與EGFR和FOXA2的表達有關[34]。

KEGG通路分析表明PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等信號通路可能直接或間接參與小青龍湯治療COVID-19的作用。PI3K-Akt信號通路與細胞生長、增殖、運動、代謝等過程有關[35]。PI3K-Akt信號通路參與了肺部的炎癥反應[36]。PI3K通路，特別是PI3Kd亞型，是治療氣道疾病的一個新靶點，PI3Kd抑制劑單獨或與抗組胺藥依巴斯汀聯(lián)合使用，可能是一種有前途的治療COVID-19的策略[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)COVID-19重癥患者促凝血小板的增加是由IgG抗體通過PI3K-Akt 信號通路介導的[39]。MAPK通路在IFN-I的產(chǎn)生、病毒復制、黏液產(chǎn)生和T細胞應答中起作用， MAPK信號通路的激活在血液免疫系統(tǒng)對抗SARS-CoV-2感染中發(fā)揮了關鍵作用[40]。AGE/RAGE信號通路是血管疾病，肺疾病嚴重程度的重要標志。分子對接結果顯示，小青龍湯的核心成分與COVID-19相關靶點結合結果良好，結構穩(wěn)定，說明小青龍湯中的有效成分有治療COVID-19的作用。

本研究將小青龍湯中前15個主要活性成分與COVID-19關鍵靶點ACE2、PLP進行分子對接，結果顯示小青龍湯主要活性成分與ACE2、PLP的結合能基本都≤-5.0 kJ/mol，說明小青龍湯的主要活性成分與COVID-19的受體蛋白具有較好的親和力。槲皮素可以顯著影響病毒S蛋白與ACE2受體的結合，也可以與S蛋白的RBD結構域結合，可以使受體阻斷[41]。實驗研究顯示，黃芩苷能通過調(diào)節(jié)A549細胞的增殖、下調(diào)ACE2蛋白及其mRNA的表達，發(fā)揮潛在抗新型冠狀病毒活性作用[16]。兒茶素與刺突蛋白形成有利的相互作用，并可能損害其功能，沒食子兒茶素沒食子酸酯通過干擾病毒尖峰的受體結合域（RBD）與宿主細胞的血管緊張素轉換酶2（ACE2）受體結合，在入口處阻斷感染[42-43]。這些結果都說明本研究分子對接結果具有較高可信度。

本研究通過分析揭示了小青龍湯可能通過作用于TNF、AKT1、GAPDH、IL-6、ALB、TP53、IL-1β、VEGFA、STAT3、EGFR等靶點，并參與PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等通路治療COVID-19。小青龍湯治療COVID-19是多成分、多途徑、多靶點共同作用的結果，網(wǎng)絡藥理學對小青龍湯治療COVID-19作用機制的預測還需進一步的實驗驗證。

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