葡萄抗寒機制研究進展

關(guān)鍵詞：葡萄；抗寒；低溫應答；基因功能

中圖分類號：S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0350-13

葡萄（Vitis vinifera spp.）是葡萄科葡萄屬落葉藤本植物，具有悠久的栽培歷史。葡萄可鮮食或制干，也可加工為果汁或葡萄酒，營養(yǎng)價值豐富且經(jīng)濟效益高，因此在許多國家都有栽種。中國葡萄產(chǎn)業(yè)在過去幾十年中發(fā)展迅速。根據(jù)世界糧農(nóng)組織（http：//faostat. fao.org）統(tǒng)計，在2020 年，中國的葡萄種植面積已達到76.7 萬hm²，產(chǎn)量達到了1480 萬t，居全球首位。葡萄產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為中國果樹產(chǎn)業(yè)的重要組成部分之一。

中國葡萄產(chǎn)業(yè)在迅速發(fā)展的同時也面臨著諸多挑戰(zhàn)，低溫便是其中之一。極端低溫天氣的發(fā)生導致很多葡萄園發(fā)生凍害。凍害主要發(fā)生在葡萄的越冬休眠組織和生長季節(jié)葉片及新梢。中國北方地區(qū)屬于大陸性氣候，夏季光照充足，晝夜溫差大，有利于糖分和其他風味物質(zhì)的積累，生產(chǎn)的葡萄品質(zhì)較好。但是，這些地區(qū)冬季氣候寒冷干旱，而中國主栽的葡萄品種為歐亞種和歐美雜交種，對極端低溫的耐受性較差，在越冬過程中常發(fā)生凍害，出現(xiàn)枝蔓凍傷甚至樹體死亡現(xiàn)象，其安全生產(chǎn)無法得到保證。因此，冬季需要將葡萄枝條下架后埋土，避免低溫對葡萄植株帶來的傷害和抽條現(xiàn)象的發(fā)生。然而，埋土防寒不僅加速了樹體的老化和死亡，而且使勞動力成本不斷升高，成為推高葡萄尤其是葡萄酒生產(chǎn)成本的主要原因，另外，進入來年春季，若發(fā)生“倒春寒”侵襲，葡萄容易出現(xiàn)凍芽、凍花和凍果，造成樹勢受損，產(chǎn)量下降。早春、深秋和冬季凍害的時常發(fā)生，很大程度上制約了葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。中國研究人員很早就注意到葡萄的凍害問題，并開展了一些針對性的研究。但是，對葡萄尤其是抗寒性極強的山葡萄的抗寒機制知之甚少，導致育種效率低下，育成的品種也不能滿足產(chǎn)業(yè)的需求。因此，研究葡萄尤其是高抗寒的山葡萄的抗性機制成為抗性育種的迫切需求。

近年來，隨著研究手段的進步及其在果樹研究中的廣泛應用，葡萄抗寒機制方面研究取得了一定的進展。筆者在本文中從種質(zhì)資源抗寒性評價與抗寒新品種選育、葡萄抗寒力遺傳特性、葡萄組織結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系、低溫下生理生化指標的改變、抗寒評價方法、抗寒相關(guān)基因的鑒定和功能研究進展等方面進行總結(jié)，并對今后葡萄抗寒性研究提供了展望，為進一步深入研究葡萄的抗寒機制提供參考。

1 種質(zhì)資源抗寒性評價與抗寒新品種選育

葡萄抗寒研究和抗性育種的基礎(chǔ)是開展田間葡萄“冬季低溫凍害和晚霜凍害”的抗寒性評價。賀普超等[1]在1984—1989 年間收集保存了來自全國野生葡萄種質(zhì)資源17 個種（含變種）39 個株系，并對其抗寒性進行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，中國野生葡萄資源中，山葡萄、燕山葡萄和蘡薁葡萄等具有極強的抗寒性，其中山葡萄（V. amurensis）的枝條和芽眼可抗-40～-50 ℃低溫，根系可抗-15～-16 ℃低溫[2]；此外，在美國被廣泛用作抗寒親本的美洲葡萄（V. labrusca L.）和河岸葡萄（V. riparia Michx.），其枝條也可抗-30 ℃冬季低溫[3]。生產(chǎn)中葡萄晚霜凍害的發(fā)生主要是“倒春寒”氣候的到來所致，張劍俠[4]通過田間自然鑒定野生葡萄和栽培品種（系）等81 份種質(zhì)資源在晚霜發(fā)生3 d 后的凍害表現(xiàn)，得出了葡萄抗晚霜凍害與冬季低溫的抗寒性表現(xiàn)不一致的結(jié)論，與此同時也發(fā)現(xiàn)了中國和美國野生葡萄在應對“倒春寒”現(xiàn)象產(chǎn)生的冷害時表現(xiàn)出了較強的抗性。這為以山葡萄為主要材料開展葡萄抗寒新品種選育和抗性機制研究提供了理論依據(jù)。

中國多家科研單位利用山葡萄的抗寒特質(zhì)，選育了一些能夠在中國正常越冬的抗寒品種。中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所于1973 年建立了抗寒山葡萄的種植實驗基地，并從野生資源中選出左山一、左山二和一些優(yōu)良的雌能花類型[5]。此后又陸續(xù)育成了雙優(yōu)、雙豐、雙紅等兩性花山葡萄優(yōu)良品種及品系[6-8]。之后又以左優(yōu)紅與84-26-53 為親本，雜交選育出抗寒、抗病、產(chǎn)量和品質(zhì)高的新品種北冰紅[9]。中國科學院植物研究所以山葡萄為父本、玫瑰香為母本培育出了北醇、北玫和北紅釀酒抗寒葡萄品種，不僅不需要埋土越冬，而且抗寒、抗病蟲害能力也很強[10- 11]。中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所等以河580 為母本、山葡萄為父本雜交選育出的葡萄抗寒砧木新品種鄭寒1 號，并采用恢復生長法及相對電導率測定鄭寒1 號低溫冷凍后的枝條半致死溫度為-30.78 ℃，抗寒性優(yōu)于貝達[12]。然而，這些品種還遠不能滿足產(chǎn)業(yè)的需求，產(chǎn)業(yè)上對抗寒優(yōu)質(zhì)的釀酒葡萄新品種仍有迫切的需求。

2 葡萄抗寒力遺傳特性

植物的抗寒性是復雜的數(shù)量性狀，受多個基因互作調(diào)控，并受環(huán)境因素影響。為探究葡萄植株雜交后代在種間遺傳的規(guī)律，王軍[2]對山葡萄等采用4種雜交方法，獲得82 個雜交后代組合，約8000 株雜種苗；通過對其進行抗寒力評估，發(fā)現(xiàn)AA（山）×F1（AA山×BB歐）的抗寒性強，BB（歐）×F1（AA山×BB歐）抗寒力弱。以山歐F1代與主栽品種為親本，回交可以得到抗寒性強、經(jīng)濟性能高的品種，但反交得到的結(jié)果差，其原因可能是胞質(zhì)遺傳將山葡萄品質(zhì)差抗寒優(yōu)的基因連鎖破壞，因此可以利用胞質(zhì)遺傳培育品質(zhì)高抗寒優(yōu)的F2代雜種。在此理論指導下，以栽培品種為父本，山歐F2代優(yōu)系為母本，選育了F3代抗寒優(yōu)、經(jīng)濟性好的植株品系[13]。白慶武等[14]利用山葡萄和優(yōu)良品種雜交，F(xiàn)1代抗寒性優(yōu)品質(zhì)差，但作為中間材料進一步與山葡萄雜交，F(xiàn)2代保持抗寒性且品質(zhì)升高；山葡萄雜交F2代與優(yōu)良品種雜交可提高果實品質(zhì)，但抗寒性降低，若經(jīng)過多代綜合雜交則可選育出抗寒性強和品質(zhì)高的品種。上述研究表明逐代雜交和綜合雜交是培育優(yōu)良品種的有效途徑。

3 葡萄組織結(jié)構(gòu)和抗寒性的關(guān)系

植物的組織結(jié)構(gòu)是其抵抗外界脅迫條件的基礎(chǔ)，是為適應環(huán)境而在進化過程中長期形成的。比較不同抗性材料之間的結(jié)構(gòu)差異，為材料抗性鑒定和抗性成因提供重要線索。

葡萄響應零下低溫凍害的組織結(jié)構(gòu)主要以休眠器官（根系、枝條和芽眼）為主；枝條是越冬的主要器官，王麗雪等[15]利用電子顯微鏡觀察葡萄枝條內(nèi)部352結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)抗寒的葡萄品種（如山葡萄等）枝條木栓層厚，細胞層數(shù)多，木栓化程度高；同時對不同葡萄品種的枝條結(jié)構(gòu)進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)抗寒力強的山葡萄細胞小而排列整齊，細胞壁較厚，抗寒力差的玫瑰香各組織的細胞大而松散，細胞壁薄。根系是葡萄越冬的主要器官之一，葡萄植株根系的抗寒性比枝條弱，生產(chǎn)實踐中葡萄根系往往先發(fā)生凍害，因此提高根系的抗寒性對提高植株的抗寒力尤為重要。對山葡萄及貝達、白香、龍眼等葡萄主栽品種的根系進行抗寒力鑒定，發(fā)現(xiàn)不同品種的皮層和木質(zhì)部所占比例不同，栽培品種皮層占有面積大；抗寒力強的品種（如山葡萄、黑山102 等）根系的木質(zhì)化程度高，組織緊密，細胞小，髓射線發(fā)達且有規(guī)律分布，而抗寒力差的品種（如玫瑰香、龍眼）則相反，木質(zhì)化程度低，組織疏松，細胞大[16]。在低溫處理6 種葡萄根系的抗寒力鑒定研究中，發(fā)現(xiàn)抗寒品種（貝達、龍紫寶、北玫）導管長度長，直徑大，兩端斜度小，單尾或無尾的導管所占比例顯著高于非抗寒品種，導管密度、分布范圍比非抗寒品種小[17]。這與郭修武等[18]的結(jié)論一致，即抗寒品種比非抗寒品種射線細胞大，組織緊密，皮層在根系結(jié)構(gòu)中所占比例大，導管大且密度高。Gao等[19]以12 個抗寒性梯度不同的品種根系剖面結(jié)構(gòu)為材料，研究發(fā)現(xiàn)抗寒性優(yōu)的品種根外皮層厚，韌皮部薄，木質(zhì)部比例高。這些研究表明，根系結(jié)構(gòu)作為葡萄抗寒鑒定的形態(tài)指標包括射線細胞大小、組織緊密度、皮層和木質(zhì)部所占比率以及根系導管的形態(tài)特征。

關(guān)于“倒春寒”現(xiàn)象造成的冷害問題，研究葡萄低溫效應的組織結(jié)構(gòu)多以葉片為主。在這些研究中，冷脅迫通常被應用于低的、不結(jié)冰的溫度，如4 ℃。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄葉片的結(jié)構(gòu)和植株的抗寒性之間存在聯(lián)系。尹立榮等[20]以山葡萄、山葡萄與歐亞種的雜交種為試材，發(fā)現(xiàn)抗寒力強的品種海綿組織厚，葉片也厚。研究者以貝達砧木的4～5 年生的美洲種、歐亞種和歐美雜交種的葉片解剖結(jié)構(gòu)為材料，發(fā)現(xiàn)葡萄葉片的細胞結(jié)構(gòu)緊密度（cell tense ration，CTR）值越大，柵欄組織越整齊，排列越緊密，品種的抗寒性越強[21]。這與賀普超等[1，22]的研究結(jié)論一致，即抗寒性強的品種（如山葡萄、貝達等）葉片柵欄組織厚且排列緊密，海綿組織薄且排列松弛。Sawicki 等[23]通過檢測冷脅迫下歐亞種葡萄花序的光合作用和糖含量波動，證明了花序能夠通過調(diào)節(jié)碳水化合物代謝機制來應對低溫脅迫。

4 低溫脅迫下葡萄生理變化與抗寒性的關(guān)系

4.1 低溫對細胞電解質(zhì)滲透率及胞間物質(zhì)的影響

低溫脅迫下植物細胞的質(zhì)膜透性會發(fā)生改變，電解質(zhì)發(fā)生不同程度的外滲。一般來講，抗寒性強的葡萄品種低溫下細胞滲透性弱，發(fā)生滲透性變化的細胞可逆轉(zhuǎn)恢復正常；相反，抗寒性弱的品種細胞發(fā)生嚴重冷害不易恢復正常，極易導致植株死亡。采用電導儀測定露地越冬的山葡萄、山玫瑰、黑山、抗寒雜交種實生苗等，結(jié)果表明枝條成熟度對電導率值大小有重要影響，電導率值隨溫度的升高而增加，且電導率增值與測液電導率值呈正相關(guān)[24]。晁無疾等[25]以山葡萄和玫瑰香等10 個品種的1 年生枝條為材料，研究發(fā)現(xiàn)抗寒性與枝條電阻間有密切聯(lián)系，抗寒性強的品種（如山葡萄）電阻值高。鄭曉翠等[26]以14 個葡萄砧木品種的1 年生枝條為材料，研究發(fā)現(xiàn)低溫處理下電解質(zhì)滲出率增加且呈S形曲線增長，并根據(jù)不同品種的低溫半致死溫度得出抗寒性最強的品種為貝達、華葡1 號，抗寒力最弱的品種為110R。楊豫等[27]以8 個釀酒葡萄品種的根系為材料，研究發(fā)現(xiàn)8 種葡萄根系經(jīng)不同低溫處理后，電解質(zhì)滲出率隨處理溫度的降低而升高。相似的研究得出的結(jié)論一致[28]，即葡萄品種的相對電導率隨低溫處理溫度的降低呈遞增的趨勢，電解質(zhì)滲出率呈S形曲線分布。這些研究表明，低溫處理下的相對電導率可表示葡萄細胞電解質(zhì)的外滲程度，可作為葡萄抗寒性強弱鑒定的指標。

4.2 低溫逆境對細胞膜保護酶系統(tǒng)的影響

葡萄植株在低溫逆境下，植物體內(nèi)多種保護性酶通過調(diào)控作用保護植株，減輕低溫對植株的傷害，這些酶與抗寒性有關(guān)。保護酶系統(tǒng)包括過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxidase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbic acidperoxidase，APX）等。對14 個不同抗寒力的葡萄品種抗寒力進行比較，發(fā)現(xiàn)葡萄枝芽的SOD活性與抗寒力有密切關(guān)系，入冬時隨著溫度的降低，SOD 同工酶譜帶數(shù)增加，酶活性增強[29]。王淑杰等[30]以4 個4 年生栽培品種的1 年生枝條葉片為試驗材料，發(fā)現(xiàn)抗寒力強的品種如BA1（貝達×山葡萄）的氧化酶活性高，抗寒力差的品種如玫瑰香酶活性低，且隨著溫度的下降而降低，抗寒性強的品種變化慢，抗寒性弱的品種變化快。對2 種山葡萄和楊樹的抗寒性比較研究中發(fā)現(xiàn)，植物體通過SOD、POD 和CAT 這3 種氧化酶的協(xié)同作用，使自由基保持在較低水平，防止自由基傷害，使植株正常生長[31]。盧精林等[32]針對低溫脅迫對葡萄枝條抗寒性的影響進行研究，利用貝達等4 種葡萄長勢中庸的1 年生枝條為試材，發(fā)現(xiàn)葡萄的SOD活性與抗寒力呈正相關(guān)，SOD 活性越高抗寒力越強，反之則越弱。隨著溫度的降低，POD 起到酶促降解的作用，進而消除低溫脅迫下植物產(chǎn)生的對細胞膜有害的物質(zhì)，POD 活性越高抗寒力越強，反之則越弱。這與李國等[33]的研究結(jié)果一致，即抗寒力強的品種氧化酶活性高，抗寒力差的品種氧化酶活性低；且隨著溫度持續(xù)下降，抗寒力強的品種酶活性變化慢，反之則變化快[34]。李桂榮等[35]以山葡萄等6 個品種為試驗材料，發(fā)現(xiàn)隨溫度脅迫的降低，不同葡萄枝條的SOD 和POD 酶活性出現(xiàn)出先上升后下降的變化，CAT 活性表現(xiàn)出先上升后下降再上升的趨勢，6 個品種的枝條抗寒力表現(xiàn)為山葡萄＞貝達＞北醇＞無核白＞奧迪亞＞京可晶。這些研究表明，葡萄植株抗寒性強則酶活性強，抗寒性差則酶活性弱；酶活性隨著溫度的下降而降低，且抗寒力強變化慢，抗寒力弱變化快。

4.3 低溫逆境對植物細胞膜脂過氧化的影響

低溫脅迫條件下，植物體內(nèi)細胞保護酶的活性降低，清除活性氧的能力受到抑制，導致體內(nèi)活性氧代謝（reactive oxygen specie，ROS）大量積累，加速了細胞膜脂過氧化，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，嚴重時可導致植株死亡。丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）作為高活性膜脂過氧化產(chǎn)物，不僅能交聯(lián)糖類、蛋白質(zhì)及脂類，還能夠抑制保護性酶的活性和抗氧化物的含量，因此MDA含量可作為評價膜系統(tǒng)受損的指標，具體表現(xiàn)為MDA含量高，細胞膜受損傷嚴重，植物體的耐低溫脅迫能力差。對7 個鮮食葡萄品種的抗寒性進行研究，結(jié)果表明在-20 ℃之前，降低處理溫度，MDA含量變化少，隨著處理溫度的降低，MDA含量增高且不同品種增高量不同[36]。對6 個葡萄品種的1 年生枝條抗寒性研究，發(fā)現(xiàn)隨著低溫脅迫的增加，MDA含量增長，且抗寒力強的品種相比其他品種MDA含量處在較低水平；相反抗寒力弱的品種MDA含量顯著高于其他品種[37]。利用葡萄抗寒性綜合評價方法進行分析，發(fā)現(xiàn)葡萄植株的抗寒性與枝條中的MDA含量呈負相關(guān)[38]。不同葡萄品種受到低溫傷害時，MDA含量增長不同且達到極限溫度后MDA含量下降，說明極限低溫導致細胞死亡，生理功能紊亂，代謝產(chǎn)物減少[32]。對6 個葡萄品種的1 年生枝條進行低溫處理，發(fā)現(xiàn)降低脅迫溫度，6種葡萄枝條的MDA含量升高，在-30 ℃時達到最高，MDA含量高低順序表現(xiàn)為山葡萄＞貝達＞北醇＞無核白＞奧迪亞＞京可晶，這與6 個品種的抗寒性強弱基本一致[35]。

這些研究表明，丙二醛作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，含量代表細胞膜損傷程度的生理指標和脂質(zhì)過氧化指標，反映細胞膜脂過氧化程度和葡萄植株對逆境條件的反應，因此MDA含量可作為抗寒性鑒定的生理指標。

4.4 抗寒調(diào)節(jié)物質(zhì)對抗寒性的影響

植物細胞中的一些物質(zhì)，如可溶性蛋白、可溶性糖以及游離脯氨酸等，具備調(diào)節(jié)細胞內(nèi)含物濃度的能力，由此避免植物在凍害下結(jié)冰造成不可逆?zhèn)?，提高植株的抗寒性。在低溫逆境下，植株體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類和含量均會發(fā)生變化，可溶性蛋白作為親水膠體，含量增加，作用是保護質(zhì)膜，增強原生質(zhì)膠體的吸水和持水能力，增大束縛水與自由水含量比值，進而提高抗寒性。對山葡萄、北醇和玫瑰香開展抗寒力比較分析，結(jié)果表明進入冬季時，抗寒力強的山葡萄比抗寒力差的玫瑰香可溶性蛋白形成早；在越冬期間可溶性蛋白含量比抗寒力差的玫瑰香增加多[15]。對葡萄枝條可溶性全蛋白和抗寒力關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白含量隨著溫度的降低逐漸升高且與品種本身的抗寒力強弱無關(guān)，但抗寒力強的BA1（貝達×山葡萄）含量高且增加幅度大，抗寒力差的玫瑰香含量低且增加幅度小[39]。對山葡萄等6 種葡萄的1 年生枝條的研究發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白含量與植株的抗寒力呈正相關(guān)，抗寒性強（如山葡萄）的可溶性蛋白含量高于其他品種，但蛋白質(zhì)的變化都表現(xiàn)為溫度降低，含量增加[35]。采用比較蛋白質(zhì)組學對田間低溫鍛煉下山葡萄和歐亞種京早晶葡萄休眠芽的研究表明，2 個品種共有235 個差異蛋白（DAPs），分屬于蛋白伴侶和代謝途徑，這為進一步研究抗寒性提供了新的線索[40]。

植物體在低溫脅迫下，可溶性糖含量增多；可溶354性糖可分為蔗糖、果糖和葡萄糖等，這些糖在葡萄植株的抗寒機制中不僅增加細胞滲透濃度，降低水勢，起到植株保水和降低冰點的作用，還對線粒體、原生質(zhì)體和膜上敏感偶聯(lián)因子具有保護作用，繼而使植株的抗寒性增強。葡萄枝條中可溶性糖含量的增多可避免植株低溫凍結(jié)損傷[41]。抗寒性不同的葡萄品種，可溶性糖含量增長不同，表現(xiàn)為抗寒性強的BA1 增加幅度大，抗寒性弱的玫瑰香增加幅度小[39]。以8 個釀酒葡萄品種1 年生枝條為試材進行抗寒性比較，發(fā)現(xiàn)各品種可溶性糖含量均增加，但增加幅度變化不同，抗寒力強的品種如威代爾和黑比諾可溶性糖含量增長幅度大，而抗寒力弱的品種如梅鹿輒和品麗珠增長幅度小[42]。Chai 等[43]通過冷馴化山葡萄和玫瑰香葡萄組培苗研究，發(fā)現(xiàn)山葡萄中的半乳糖醇、棉子糖、果糖、甘露糖、甘氨酸和抗壞血酸在低溫誘導下持續(xù)積累，而玫瑰香葡萄則沒有誘導，這可能是山葡萄耐寒性強的原因。

低溫脅迫下，植物體內(nèi)的游離脯氨酸積累，能增強植株內(nèi)的細胞保水能力，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，調(diào)控細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，并作碳水化合物來源的保護劑。對葡萄枝葉脯氨酸含量與抗寒性關(guān)系探究中發(fā)現(xiàn)，在秋季低溫到來時葉片結(jié)構(gòu)的脯氨酸含量升高，枝條結(jié)構(gòu)的脯氨酸含量隨冬季溫度的降低而升高；不同游離脯氨酸含量變化與不同類型的抗寒力強弱關(guān)系小，而與不同類型抗寒鍛煉密切相關(guān)[44]。何偉等[45]以貝達、左山一、雙紅和北冰紅為試驗材料，研究葡萄品種及砧木的抗寒性，發(fā)現(xiàn)4 個品種枝條的游離脯氨酸含量隨溫度的降低逐漸升高，游離脯氨酸含量高低排列順序為左山一＞雙紅＞貝達＞北冰紅，這與4 個品種的抗寒性一致。李鵬程等[46]對山葡萄2 年生扦插苗開展抗寒力鑒定，發(fā)現(xiàn)溫度降低，游離脯氨酸含量出現(xiàn)先升高后下降的變化規(guī)律。對13 個釀酒品種砧木抗寒性探究發(fā)現(xiàn)，降低處理溫度游離脯氨酸含量均升高，不同品種的增長速度和幅度變化存在顯著差異，且增長幅度變化與其抗寒力大小一致，表現(xiàn)為抗寒力強的品種（如山葡萄、貝達等）含量高且增長幅度大，反之，抗寒力差的品種（抗砧3 號、5C 等）含量較其他品種低且增長幅度小，13 個釀酒葡萄品種抗寒性高低排列順序為山葡萄＞貝達＞5BB＞520A＞110R＞3309C＞101-14＞SO4＞1103P＞420A＞140R＞5C＞抗砧3 號[47]。Król等[48]通過對不同耐寒性歐亞種葡萄葉片在持續(xù)低溫脅迫過程中次生代謝物的分析，發(fā)現(xiàn)長期低溫暴露導致所有鑒定的酚酸含量顯著降低，兩者代謝功能存在差異，抗寒性強的品種酚類化合物含量高，自由基清除能力強，還原能力強。

這些研究表明，可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量與葡萄植株的抗寒性密切相關(guān)，可作為葡萄植株抗寒力鑒定的生理指標。

5 葡萄抗寒評價方法

抗寒評價方法是研究植物抗寒機制和培育抗寒新品種的基礎(chǔ)實驗手段，葡萄的低溫抗性表現(xiàn)主要為應對晚霜凍害和冬季低溫造成的冷害問題。隨著葡萄在生理水平低溫應答規(guī)律的逐步解析，以及不同抗性材料在低溫下的變化差異比較，研究人員開發(fā)并比較了多種葡萄抗寒性評價方法，其中以晚霜后和冬季持續(xù)低溫凍害的評價方法為主。關(guān)于晚霜凍害涉及的器官主要為葉片和新梢，抗寒評價方法主要包括蒽酮法測定可溶性糖含量[49]、考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[50]、茚三酮比色法測定脯氨酸含量[51]和基于Fv/Fm 的模型評價干旱-寒冷法[52]等。上述生理指標的測定可用于葡萄抗寒力的鑒定。葡萄應對冬季持續(xù)低溫的組織器官主要是枝條、芽眼和根系，涉及這些器官的葡萄抗寒力鑒定方法包括田間凍害調(diào)查鑒定[53]、生長法[44]、電導法[28]、組織褐變法[22]、差熱分析法[54]、TTC還原法[55]、動態(tài)熱時間模型（DTTM）預測休眠葡萄芽的抗寒性法[56]以及過冷能力分析法[27]等。這些方法完善了不同品種抗寒力鑒定的全面性，提高了綜合分析能力，促進了葡萄抗寒機制和育種的研究。

6 葡萄抗寒分子機制

除了生理變化外，植物受到冷脅迫以后，許多基因在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平及翻譯后修飾等方面也會發(fā)生一系列變化。近年來，從分子層面探究葡萄植株抗寒調(diào)控機制的報道越來越多，主要歸為2 個方面：（1）解析“倒春寒”氣候?qū)χ髟云咸盐：Φ幕A(chǔ)研究；（2）以山葡萄等野生種質(zhì)資源為實驗材料，挖掘抗寒的關(guān)鍵基因。另外，根據(jù)作用方式的不同，目前挖掘到的基因可被分為2 大類：（1）調(diào)控基因：例如C-repeat binding factor（CBF）等轉(zhuǎn)錄因子、miRNA、circRNA 等，主要通過控制其下游基因的表達參與葡萄低溫應答；（2）功能基因如抗氧化酶基因等，直接參與某些生理生化過程，增強葡萄的抗寒性[57-60]。

生產(chǎn)中帶來經(jīng)濟效益的主栽葡萄品種以歐亞種和歐美雜交種為主，若從基礎(chǔ)研究層面解決主栽葡萄的晚霜凍害問題，需要探究這些品種中受冷誘導的基因通路和富集調(diào)控網(wǎng)絡分析等問題。關(guān)于冷脅迫關(guān)鍵基因CBF 及其信號通路相關(guān)基因在葡萄中已有部分報道。Xiao 等[57]從河岸葡萄、歐亞種葡萄中分離了CBF/DREB1-like 基因CBF1～4，CBF4 基因在低溫脅迫中表達水平增高，并且能夠維持在一定的水平，據(jù)此分析葡萄的抗寒性可能與此基因相關(guān)。隨后證實常溫下CBF4 基因表達量低，低溫脅迫下表達量高，與CBF1、2 和3 相比，CBF4 在成熟和幼嫩的組織中均有表達，可能在植株的越冬過程中起到更重要的調(diào)控作用[58]。HOS1 作為調(diào)控CBF信號通路的上游轉(zhuǎn)錄因子，Li 等[59]從玫瑰香中克隆了HOS1 基因，異源表達后，擬南芥的耐寒、耐旱和耐鹽性降低，并且抑制了脅迫相關(guān)基因AtRD29A和At-COR47 的表達。VvICE1a 和VvICE1b 的表達提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒性，并引起了脅迫相關(guān)基因AtRD29A和AtCOR47的上調(diào)表達。

除了經(jīng)典的CBF通路相關(guān)基因，與冷脅迫相關(guān)的其他基因也相繼在葡萄中克隆和發(fā)現(xiàn)。Wang等[60]從歐亞種葡萄基因組中鑒定出59 個VvWRKYs，并通過數(shù)據(jù)庫信息確認了15 個VvWRKYs 可能與冷脅迫有關(guān)。Hou 等[61]研究發(fā)現(xiàn)VvBAP1 在抗寒品種F-242 和左優(yōu)紅中的表達水平明顯高于在冷敏感品種赤霞珠和霞多麗中的表達水平，其編碼的蛋白通過調(diào)節(jié)和控制葡萄體內(nèi)的糖含量，激活抗氧化酶活性來增強葡萄體內(nèi)的抗氧化能力，提高葡萄抗寒能力。從葡萄生殖器官中鑒定出6 個BAM基因，其中VvBAM1 和VvBAM3 的轉(zhuǎn)錄本豐度隨溫度的降低而顯著增加，VvBAM1 在轉(zhuǎn)基因番茄中通過調(diào)節(jié)淀粉水解和促進活性氧清除來提高耐冷能力[62]。

除了基因的同源比對和克隆外，基于高通量測序等生物信息學手段，栽培葡萄中越來越多低溫應答相關(guān)的基因被相繼報道出來。Sun 等[63]從4 ℃處理的玫瑰香葡萄葉片中鑒定出44 個響應低溫脅迫的miRNA，其靶基因包括AP2、MYB、SBP、bHLH、bZIP 和GRAS等轉(zhuǎn)錄因子；Cheng 等[64]從葡萄果實中鑒定到6 個在冷熱脅迫中表達量顯著上調(diào)或下調(diào)的VvGRFs 基因；Londo 等[65]從5 個歐亞種葡萄葉片中分析得到的響應低溫和冷凍脅迫的差異表達基因參與的調(diào)控途徑不同，但都包含參與乙烯信號通路、ABA信號通路、淀粉/蔗糖/半乳糖代謝通路的基因及AP2/ERF、WRKY、NAC家族轉(zhuǎn)錄因子；Gao 等[66]鑒定到低溫脅迫下葡萄葉片中差異表達的475 個環(huán)狀RNA，初步證明了Vv-circATS1 參與響應冷脅迫。另外，在遺傳基因挖掘方面，通過對雙優(yōu)與紅地球休眠芽不同時期的轉(zhuǎn)錄組分析和種間雜交遺傳群體的抗寒性數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）定位發(fā)現(xiàn)了抗寒相關(guān)的新結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子，包括CORs （VaCOR413IM）、GSTs （VaGST- APIC、VaGST- PARB、VaGSTF9 和VaGSTF13）、ARFs（VaIAA27 和VaSAUR71）、ERFs（VaAIL1）、MYBs（VaMYBR2、VaMYBLL 和VaMYB3R- 1）和bHLHs（VaICE1 和VabHLH30）[67]；以赤霞珠×左優(yōu)紅的181個雜交后代及親本為樣本，進行限制性位點相關(guān)DNA測序（RAD），構(gòu)建了包含16 076 個、11 643 個和25 917 個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標記的高密度遺傳連鎖圖譜，鑒定出6 個QTL，定位在連鎖群LG2、LG3 和LG15 上，成為調(diào)控葡萄抗寒性的候選基因[68]。接著，Patel 等[69]通過組裝的河岸葡萄Manitoba 37 基因組與黑比諾基因組進行對比，確定了2 個品種間表型變異的遺傳關(guān)系，能為葡萄育種的分子標記開發(fā)和遺傳研究提供參考序列和基因模型。

山葡萄作為葡萄抗寒育種的主要親本，意在緩解冬季極端低溫對葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的影響，因此其抗性機制的挖掘得到了廣泛的關(guān)注。在經(jīng)典抗寒信號通路方面，雖從山葡萄中克隆到VaCBF1 和VaCBF4，并證明其在低溫逆境下表達量增加[70-72]，但到目前為止還沒有研究顯示CBF 基因的表達或序列變異與山葡萄高抗寒性有關(guān)。

在抗性基因功能解析方面，bHLH（Basic helixloop-helix）、ERF（Ethylene response factor）、WRKY（DELLA name derived from the most prominent aminoacid residues in the protein）、GRAS（GAI，gibberellinacid insensitive；RGA，repressor of GAI andSCR，scarecrow）等家族中陸續(xù)有成員被克隆和研究。Xu 等[73]從山葡萄中克隆到的bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子VabHLH1 在激活CBF 的冷信號通路，尤其是調(diào)節(jié)CBF3 和RD29A 表達方面，與在冷敏感的赤霞珠葡萄中的作用相比存在差別。Sun 等[74]發(fā)現(xiàn)乙烯參與葡萄葉片低溫應答，外源添加1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）可以顯著提高山葡萄和玫瑰香葉片的抗寒性，而添加乙烯合成抑制劑氨基乙烯基甘氨酸（AVG）卻增加了山葡萄和玫瑰香對低溫的敏感性，表明乙烯正調(diào)控葡萄對低溫脅迫的耐受性。同時相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，數(shù)個ERF 成員參與低溫應答，VaERF057 低溫下表達上調(diào)，而AVG能夠完全抑制低溫對VaERF057 的誘導作用，說明在低溫條件下VaERF057 的上調(diào)表達可能依賴于內(nèi)源乙烯的生物合成[75]；VaERF080 和VaERF087 被發(fā)現(xiàn)通過提高抗氧化酶活性和調(diào)控冷誘導相關(guān)基因的表達來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒性[76]；VaERF092 通過與VaWRKY33 的啟動子上的GCC-box 結(jié)合，增強植株對冷脅迫的耐受性[77]。GRAS 轉(zhuǎn)錄因子家族中的VaPAT1 通過與INDETERMINATE-DOMAIN3 蛋白互作來激活LIPOXYGENASE 3 基因的表達，以促進茉莉酸的生物合成，從而提高葡萄的耐冷性[78-79]。

受低溫誘導的VaWRKY12，其編碼的蛋白在常溫下定位于細胞核和細胞質(zhì)，低溫處理后定位于細胞核，過表達后能夠增強擬南芥和葡萄愈傷組織的耐寒性[80]。VaSAP15 與VaPDI1 相互作用，在無核白中過表達增強了葡萄的耐寒性[81]。從山葡萄中分離到VaMYB44 基因，其編碼蛋白能夠與VaMYC2、VaTIFY5A互作，降低轉(zhuǎn)基因擬南芥和葡萄的抗寒性[82]。對山葡萄中響應冷脅迫的TFs 中鑒定發(fā)現(xiàn)，CBF4、RAV1 和ERF104 等調(diào)控基因參與冷應激反應過表達VaRAV1，葡萄愈傷組織抗寒性提高[83]。Aleynova 等[84]通過對CML21 基因的4 種可變剪接（CML21v1、CML21v2、CML21v3 和CML21v4）表達量鑒定和擬南芥異位表達，發(fā)現(xiàn)葡萄CML21 基因在植物對冷脅迫的響應中起正向調(diào)控作用，這種mRNA變體的擴展可能有助于提高葡萄冷應激反應的多樣性。在結(jié)構(gòu)基因方面，Dong 等[85-87]從山葡萄中分離出了1 個Cold regulated gene（COR），命名為VaCOR。低溫條件下VaCOR 在山葡萄中的表達量明顯高于歐亞種葡萄，并且COR413 基因家族的成員在山葡萄與歐亞種葡萄低溫下的表達模式存在差異，其中VaCOR413-IM1 在山葡萄中表達量高[88]。此外，還有VaAQUILO、VaDof17d 和VaCPK20 通過調(diào)控棉子糖來參與山葡萄低溫應答[77，89-90]。

在抗寒基因挖掘方面，對低溫下的山葡萄葉片轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)了數(shù)個參與代謝、轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的差異基因[91-92]。米寶琴等[93]利用抑制性消減雜交技術(shù)（suppression subtractive hybridization，SSH），篩選出了與山葡萄抗寒性相關(guān)的AFPs、Haps、防御素樣蛋白、細胞色素P450 加單氧酶等多個相關(guān)的ESTs，以及14 個未知蛋白序列。對山葡萄高質(zhì)量染色體水平的基因組組裝發(fā)現(xiàn)了32 885 個編碼蛋白的基因，解析了山葡萄抗寒性強的原因可能是基因擴增的變化；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了17 個參與冷信號的基因，他們響應低溫和冷凍條件的機制不同；此外，通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了一種磷酸甘油酸激酶基因有助于提高芽在冬季的抗凍性[94]。

綜上所述，在葡萄抗寒基因的挖掘和功能解析方面取得了較大的突破。一些基于模式植物中低溫應答關(guān)鍵基因的同源克隆和功能驗證，還有一部分基因家族或成員是首次在葡萄中被發(fā)現(xiàn)與低溫相關(guān)。雖然目前僅發(fā)現(xiàn)一些基因在山葡萄展示出比歐亞種葡萄更快或者更大量的表達模式，而沒有在遺傳水平證實其與山葡萄高抗寒的關(guān)系。在這些工作的基礎(chǔ)上，將進一步突破山葡萄高抗成因并用作品種抗性改良。

7 展望

葡萄抗寒機制相關(guān)的研究工作雖然取得了一定的進展，但是也存在一些問題，筆者擬就這些問題及可能的解決方法，對進一步的研究進行展望。

（1）相關(guān)的分子生物學研究主要集中在抗性基因的挖掘和功能驗證上。但是缺乏抗性相關(guān)QTL的鑒定及基于QTL 的抗性基因挖掘。應開展以山葡萄為親本的遺傳群體構(gòu)建、遺傳圖譜繪制及抗寒性評估，鑒定山葡萄抗寒相關(guān)QTL，挖掘關(guān)聯(lián)的抗性基因，并開發(fā)分子標記用于輔助育種。

（2）目前的研究主要關(guān)注葡萄對極端低溫的應答，較少關(guān)注枝條抗抽干現(xiàn)象，而在田間這2 種危害往往協(xié)同發(fā)生。應注重低溫和抽干的發(fā)生規(guī)律及其關(guān)系，并將抽干上升到一個單獨因子的層面來開展研究。

（3）研究中多以葉片為材料，較少研究枝條、芽和根系等器官，而這些器官又是冬季田間實際遭受脅迫的組織，可能具備與葉子不同的物質(zhì)積累和脅迫應答機制。應加強這些針對不同器官的脅迫應答研究，對揭示山葡萄抗性機制更具有現(xiàn)實意義。