甜柿炭疽病病原種類及生物學(xué)特性比較

關(guān)鍵詞：甜柿；果生刺盤孢；暹羅刺盤孢；哈銳炭疽菌；系統(tǒng)發(fā)育分析；生物學(xué)特性

中圖分類號：S665.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0340-10

太秋甜柿是中晚熟甜柿品種，目前主要分布在中國南方地區(qū)，如浙江、江蘇、福建、湖北等地[1-4]。太秋甜柿具有獨特的風(fēng)味，營養(yǎng)豐富，且保脆時間較長，因此，深受廣大消費者的喜愛，也是中國的主要出口水果之一，有著良好的國際市場價值[5]。

炭疽病是柿樹的主要病害，可侵染葉片、花和果實等部位，引起果實腐爛或枝條枯死等癥狀，也是柿貯藏期的主要病害之一[6]，而因其具有較高的含糖量和蛋白質(zhì)含量的特性，更易被炭疽菌侵染，造成果實的腐爛。目前，中國已報道的柿炭疽菌主要病原菌有哈銳炭疽菌（Colletotrichum horii）[7-8]、喀斯特炭疽菌（C. karstii）[9]、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioi-des）[10]和果生刺盤孢（C. fructicola）[11]，國外報道的有尖孢炭疽菌（C. acutatum）[12]和暹羅炭疽菌（C. siamense）[13]、其中山東省甜柿炭疽病主要以哈銳炭疽菌為主，福建省以果生刺盤孢為主，各地區(qū)炭疽病病原菌種群類型差異較大。近年來，浙江省金華市永康柿園內(nèi)太秋甜柿炭疽病逐年增加，主要因為甜柿炭疽病的病原種類及規(guī)律不明確，甜柿病害發(fā)病癥狀相似，田間藥劑使用混亂，導(dǎo)致甜柿果實炭疽病發(fā)生加重，影響了甜柿產(chǎn)量及質(zhì)量。因此，弄清甜柿炭疽病炭疽菌的種類、生物學(xué)特性及發(fā)生條件，不僅可以了解甜柿炭疽病的發(fā)生及影響因素，而且可以為甜柿炭疽病提供生態(tài)防治措施。筆者在本試驗中主要對浙江永康太秋甜柿果實炭疽病種類進行確定，著重研究甜柿炭疽病不同病原小種間生物學(xué)特性和發(fā)生規(guī)律的差異，以期為甜柿炭疽病發(fā)病規(guī)律的解析及病害的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 甜柿炭疽病的發(fā)生及病原菌分離、鑒定

1.1.1 炭疽病調(diào)查、采集及分離 2021 年6—10 月，針對浙江省金華市永康市太秋甜柿果實炭疽病進行病樣采集，采集時間為每月1 次，采摘太秋甜柿果實表面和萼片上發(fā)病癥狀較明顯的樣品，采集后的樣品保存于保鮮袋內(nèi)帶回實驗室后，采用組織分離法[11]進行甜柿炭疽病病原菌分離，得到的分離物培養(yǎng)3 d 后在菌落邊緣挑取單菌絲至PDA平板內(nèi)進行純化、備用。并觀察所有分離病菌的菌落特征，統(tǒng)計太秋甜柿果實表面和萼片的炭疽病菌分離率。將純化的菌種保存至浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所。

1.1.2 分離物致病性測定 選取代表菌株進行致病性檢測，選取健康、大小和成熟度一致的太秋甜柿果實，在果實或萼片進行接種，將純化的供試菌株接種至PDA平板中，26 ℃培養(yǎng)7 d 后，在菌落菌絲最外緣打取直徑為5 mm的菌餅，將菌餅菌絲面朝寄主植物貼在果實表面或果蒂，再用含有無菌水的脫脂棉覆蓋在菌餅上，對其進行保濕培養(yǎng)，放置于26 ℃ 16 h光照、8 h 黑暗的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行保濕培養(yǎng)，接種方式為針孔洞傷口接種和無傷口直接接種，待5 d 后觀察接種情況并記錄。

1.1.3 分離物分類地位確定 將分離純化的代表菌株進行致病性測定，采用Ezup 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，利用ITS、ACT、TUB2、GAPDH、CHS1 基因序列進行擴增[14-19]，引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成并進行基因測序，結(jié)合NCBI-Blast 進行序列比對。在NCBI 基因數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)序列（表1），采用MEGA 7.0 和Bayesian對ITS、ACT、TUB2、GAPDH、CHS-1 聯(lián)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和貝葉斯法建樹（Bayesian，Bpp），Bootstrap1000 次重復(fù)。

1.2 病菌生物學(xué)特性測定

1.2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 將純化的甜柿炭疽病代表菌株轉(zhuǎn)至新的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d 后，采用打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，菌絲面一致朝下接種至供試培養(yǎng)基平板中央。供試培養(yǎng)基類型為PDA（馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基）、CA（胡蘿卜培養(yǎng)基）、CMA（玉米粉培養(yǎng)基）、RA（大米培養(yǎng)基）、OA（燕麥培養(yǎng)基）、GA（高粱培養(yǎng)基）、WA（水瓊脂培養(yǎng)基）。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，每個處理3 次重復(fù)。5 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑[20]。

產(chǎn)孢量的測定：培養(yǎng)14 d 后，加入10 mL無菌水至供試平板，將培養(yǎng)基表面孢子完全洗脫后配制成孢子懸液，在光學(xué)顯微鏡下采用血球計數(shù)法統(tǒng)計每個平板的產(chǎn)孢總量。

1.2.2 溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 采用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，菌絲面一致朝下接種至新的PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，每個處理3 次重復(fù)。5 d 后測量菌落直徑，14 d 后測量產(chǎn)孢總量，測量方法同1.2.1。

1.2.3 光照對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 將菌餅（5 mm）接種至PDA 培養(yǎng)基，分別置于光照條件為全光（24 h 光照）、全暗（24 h 黑暗）、半光照（12 h 光+12 h 暗）下培養(yǎng)，每個處理3 次重復(fù)。25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后測量菌落直徑，14 d 后測量產(chǎn)孢總量，測量方法同1.2.1。

1.2.4 pH值對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用0.1%HCl 溶液和NaOH溶液將培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)至4.01、5.03、6.09、7.03、8.02、9.03、10.09，每個處理3 次重復(fù)，在各培養(yǎng)基中央接種直徑5 mm的菌餅，密封處理后，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)，5 d 后測量菌落直徑，14 d 后測量產(chǎn)孢總量，測量方法同1.2.1。

1.2.5 病菌致死溫度的測定 將在PDA上培養(yǎng)14 d的病原菌菌板加無菌水配置為105個·mL-1的孢子懸液，吸取50 μL 孢子懸液移入PCR 管中，放入梯度PCR 儀中，分別置于40.0、40.6、41.9、43.9、46.2、47.9、49.2、50.0、51.0、52.0 ℃，恒溫處理10 min 后吸取10 μL滴在PDA平板中央進行涂板，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d 后觀察菌落生長情況，每個處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜柿炭疽病的發(fā)生及調(diào)查

2021 年6—10 月對浙江省金華市永康市太秋甜柿（共5 次樣品）果實上的病斑進行了采樣及分離，如表2 所示，侵染太秋甜柿果實炭疽病病原類型主要有Ⅲ類，其中Ⅰ類主要危害甜柿表面，形成黑色密密麻麻的微凸起小黑點，為初期發(fā)生病害，分離概率為21/66，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落灰綠色，分生孢子長圓形或圓柱形，兩端圓，單孢，無色，大?。?9.626～31.933）μm ×（3.717～4.320）μm，代表菌株為TS32-G11-E（圖1-A～C）；Ⅱ類主要危害柿蒂，常見為柿蒂先發(fā)病變褐后侵染至果實，后期果實全部腐爛，整個生育期均有發(fā)病，分離概率為54/100，病原菌在PDA 培養(yǎng)基上菌落灰綠色，分生孢子橢圓形，單孢，無色，大?。?.164～7.173）μm ×（14.202～15.568）μm，代表菌株為T3S1-E1-B（圖1-D～F）；Ⅲ類主要為萼片，也可侵染果實，后期果實表面易產(chǎn)生橘色孢子堆，分離概率為16/45，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落灰綠色，孢子橢圓形，單孢，無色，大小（4.018～4.699）μm ×（11.547～12.768）μm，代表菌株為T2S12-G-A（圖1-G、H和I）。經(jīng)形態(tài)學(xué)描述初步將3類病原菌鑒定為刺盤孢屬真菌（Colletotrichum sp.）。

2.2 分離菌株致病性測定

病原菌致病性測定結(jié)果表明，3 個甜柿炭疽病代表菌株均可侵染甜柿果實，代表菌株T2S32-G12-E 在有傷口和無傷口接種條件下均可致病，有傷口病原可侵入果肉，使組織變黑腐爛，直接接種病原可在柿果實表皮侵染形成小黑點，隨接種環(huán)境濕度升高而擴大，與田間癥狀一致（圖1-J、L）。代表菌株T2S12-G-A 僅在有傷口的情況下侵染甜柿果實，果面變軟塌陷，7 d 后在接種寄主組織上可產(chǎn)生橘色孢子液，與田間癥狀相似（圖1-K）。代表菌株T3S1-E1-B一般由果蒂侵染甜柿果實及萼片，接種發(fā)現(xiàn)該病原菌侵染速度很快，7 d 即可使整個甜柿果實腐爛，果蒂及萼片發(fā)病癥狀與田間相似（圖1-M），因此該3 類病原菌均為甜柿果實炭疽菌的致病菌。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

如圖2 所示，采用最大似然法和貝葉斯方法對代表菌株的5 個基因進行序列擴增和聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，代表菌株T2S32-G12-E 與C. horii聚在同一分支上，支持率達99%，貝葉斯概率達100%；代表菌株T3S1-E1-B與C. fructicola 聚在同一分支上，支持率達99%，貝葉斯概率達100%；代表菌株T2S12-G-A與C. siamense 聚在同一分支上，支持率達99%，貝葉斯概率達100%。因此，太秋甜柿果實上病原菌主要包含3 個不同的種，即哈銳炭疽菌（C. horii）、果生刺盤孢（C. fructicola）和暹羅刺盤孢（C. siamense），詳細分離結(jié)果見表2。

2.4 病菌生物學(xué)特性研究

2.4.1 不同培養(yǎng)基和光照對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 3種炭疽病菌在供試7 種培養(yǎng)基上均能生長（表3）。果生刺盤孢和暹羅刺盤孢菌絲生長最佳培養(yǎng)基為PDA、CMA和GA，果生刺盤孢產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基，暹羅刺盤孢產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為CMA培養(yǎng)基；哈銳炭疽菌菌絲生長最佳培養(yǎng)基為PDA和CA，產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為OA培養(yǎng)基。

2.4.2 光照對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 在光照試驗中，3 個甜柿炭疽病菌受光照條件的影響不同，哈銳炭疽菌和果生刺盤孢菌在全黑暗培養(yǎng)條件下菌絲生長最快，而暹羅刺盤孢在全光照條件下菌絲生長最快。哈銳炭疽菌在光暗交替的條件下可刺激產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量達2.27×105個·mL-1，明顯高于全光照和全黑暗培養(yǎng)條件。全光照條件可以刺激果生刺盤孢菌產(chǎn)生孢子，14 d 可達6.53×106個·mL-1。而暹羅刺盤孢受光照條件的影響無明顯差異。

2.4.3 溫度和pH 對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 由圖3-A可知，3 種甜柿炭疽病菌菌絲生長和產(chǎn)孢適宜溫度均為30～35 ℃，最適生長溫度30 ℃，果生刺盤孢和暹羅刺盤孢最適產(chǎn)孢溫度為35 ℃，哈銳炭疽菌最適產(chǎn)孢溫度為25 ℃；pH 值4～10 均適宜甜柿炭疽病菌菌絲生長（圖3-B），果生刺盤孢在pH 值5 和9 時產(chǎn)孢最佳，暹羅刺盤孢和哈銳炭疽菌在pH值9 和10時產(chǎn)孢最佳（表4）。

2.4.4 病菌致死溫度 將孢子懸液置40.0、40.6、41.9、43.9、46.2、47.9、49.2、50.0、51.0、52.0 ℃恒溫處理5、10、20 min后涂板。由表5可知，恒溫處理10 min，哈銳炭疽菌和暹羅刺盤孢的致死溫度為49.2 ℃，果生刺盤孢的致死溫度為47.9 ℃。

3 討論

3.1 甜柿炭疽病病原種類及發(fā)生情況

炭疽病是柿果實的主要病害之一，引起柿果實腐爛或表面病斑，極大影響了甜柿果實的商品價值。刺盤孢屬真菌作為柿炭疽病的主要病原菌，其種類較多且遺傳差異較大，因不同的氣候條件導(dǎo)致不同地區(qū)柿炭疽病的病原種類不一致。目前中國山東省報道的引起甜柿炭疽病的病原主要以哈銳炭疽菌為主，福建省的果實炭疽病主要以果生刺盤孢為主[8，14]。結(jié)果表明，引起浙江省金華市永康市太秋甜柿炭疽病的主要有3 大類，分別為哈銳炭疽菌、果生刺盤孢和暹羅刺盤孢，其中哈銳炭疽菌為前期炭疽病主要病原菌，一般在6—7 月發(fā)生，后期主要是果生刺盤孢引起的炭疽病，一般在8—10 月均有發(fā)生，在7—8 月份為該病原侵染高峰期。哈銳炭疽菌引起的炭疽病主要為早期果斑病，結(jié)合致病性測定結(jié)果分析，該病原在有傷口的時候可以快速引起甜柿的果腐病，但在無傷口的情況下也可直接在果面上形成小黑斑，在環(huán)境條件適宜時，擴展成片果腐和果斑病，因此在甜柿果實初期應(yīng)主要對哈銳炭疽菌引起的果斑病進行防治，以防病原菌擴散形成初侵染來源。室內(nèi)致病性測定結(jié)果表明，果生刺盤孢和暹羅刺盤孢都不能直接侵染甜柿，必須在有傷口的情況下才能侵染甜柿，這與田間采集在萼片上分離的病原菌數(shù)量多于果面上有直接關(guān)系，因此，適當給甜柿果實套袋，減少果面的損傷可以降低果生刺盤孢和暹羅刺盤孢引起的甜柿果實炭疽病。另外，果生刺盤孢菌在甜柿的萼片上分離率高于果面，因此，在萼片生長期是果生炭疽菌防治的主要時期。

3.2 不同甜柿炭疽病病原菌生物學(xué)特性比較分析

炭疽菌是一類重要的植物病原真菌，具有豐富的形態(tài)學(xué)及遺傳多樣性，筆者在本研究中針對3種甜柿炭疽菌的生物學(xué)特性進行了比較研究，結(jié)果表明，3 種甜柿炭疽病菌（C. horii、C. siamense 和C. fructicola）菌絲生長和產(chǎn)孢適宜溫度均為30～35 ℃，最適生長溫度30 ℃。哈銳炭疽菌最適產(chǎn)孢溫度為25 ℃，該結(jié)果說明哈銳炭疽菌引起的炭疽病為偏低溫病害，適宜低溫可刺激該病原菌大量產(chǎn)孢，為后期侵染提供初侵染來源，這與浙江省6 月份柿果實初期即受到哈銳炭疽菌危害直接相關(guān)。產(chǎn)孢試驗結(jié)果表明，果生刺盤孢和暹羅刺盤孢最適產(chǎn)孢溫度為35 ℃，這與果生刺盤孢和暹羅刺盤孢為甜柿生長中后期主要病害有關(guān)，也與浙江省氣候氣溫相關(guān)[21]。果生刺盤孢和暹羅刺盤孢菌絲生長最佳培養(yǎng)基為PDA、CMA和GA，果生刺盤孢產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基，暹羅刺盤孢產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為CMA培養(yǎng)基；哈銳炭疽菌菌絲生長最佳培養(yǎng)基為PDA和CA，產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為OA培養(yǎng)基。說明不同炭疽菌小種在菌絲生長所需養(yǎng)分存在差異，且培養(yǎng)基的成分直接影響病原菌的產(chǎn)孢情況[22]。pH 值4～10 均適宜甜柿炭疽病菌菌絲生長，并且無顯著差異，說明該病害的發(fā)生與環(huán)境pH無關(guān)。果生刺盤孢在pH值5 和9 時產(chǎn)孢最佳，暹羅刺盤孢和哈銳炭疽菌在pH 9 和10 時產(chǎn)孢最佳，說明在較差環(huán)境下可以刺激各炭疽病菌產(chǎn)孢；各甜柿炭疽病菌菌絲生長對光照均不敏感，但對其產(chǎn)孢的影響較大，持續(xù)光照有利于果生刺盤孢分生孢子的形成和產(chǎn)生，產(chǎn)孢量顯著高于暗培養(yǎng)條件，在光暗交替的條件下可刺激哈銳炭疽菌產(chǎn)孢，暹羅刺盤孢產(chǎn)孢對光照不敏感，這一研究結(jié)果表明適當?shù)恼陉柼幚砜梢詼p低該病害的傳播速度[23]。果生炭疽菌病菌分生孢子的致死溫度為51 ℃ 5 min，哈銳炭疽菌分生孢子的致死溫度為50 ℃ 5 min，暹羅刺盤孢菌分生孢子的致死溫度為52 ℃ 5 min。上述研究結(jié)果將為該病害的發(fā)生規(guī)律及病害防治提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對浙江金華永康太秋甜柿炭疽菌種類的調(diào)查、致病性測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了太秋甜柿的炭疽病病原主要有哈銳炭疽菌、果生刺盤孢和暹羅刺盤孢，其中暹羅刺盤孢引起太秋甜柿炭疽病為國內(nèi)首次報道。對病原菌生物學(xué)特性研究，首次比較了3 個不同太秋甜柿炭疽病病原小種的最適培養(yǎng)溫度、pH值、光照條件和孢子致死溫度，為太秋甜柿炭疽病科學(xué)防治提供了科學(xué)依據(jù)。