國慶1號(hào)溫州蜜柑珠心胚苗培育及四倍體發(fā)掘

關(guān)鍵詞：柑橘；珠心胚；四倍體；流式細(xì)胞術(shù)；SSR分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S666 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）02-0309-07

溫州蜜柑為細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型[1]，果實(shí)無核，易剝皮，品質(zhì)佳，易栽培，是中國很多柑橘產(chǎn)區(qū)重要的主栽品種。國慶1 號(hào)溫州蜜柑是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)早期從龜井溫州蜜柑芽變選出的早熟品種。在生產(chǎn)中，為保持品種特性，柑橘一般采用無性繁殖，但長(zhǎng)期無性繁殖會(huì)在其體內(nèi)積累一種或多種病毒、類病毒及細(xì)菌性病害[2]，導(dǎo)致出現(xiàn)一定程度的品種退化，逐漸表現(xiàn)出生活力降低、產(chǎn)量下降和品質(zhì)衰退等現(xiàn)象，急需進(jìn)行提純復(fù)壯和品種改良。由于大多數(shù)病毒病不能通過種子傳播，柑橘珠心胚苗能脫除大多數(shù)病毒，通常表現(xiàn)為生長(zhǎng)勢(shì)比親本更旺盛，從而達(dá)到提純復(fù)壯的目的[3-4]。

基于珠心系實(shí)生變異選擇育種是柑橘的重要育種途徑。日本育種家利用珠心系變異選育出大批熟期、果型、果皮色澤各異的溫州蜜柑新品種，如興津早生、三保早生等品種就是利用溫州蜜柑的多胚性，從宮川溫州蜜柑珠心系選育而來[3，5]。黃秀等[6]以由良溫州蜜柑為母本與雞尾葡萄柚等4 個(gè)品種有性雜交，獲得溫州蜜柑種子用于珠心苗培育，以期選育符合市場(chǎng)需求的新品種。筆者在本研究中以國慶1 號(hào)溫州蜜柑為材料，采用離體播種方法培育珠心胚苗，以期為國慶1 號(hào)溫州蜜柑提純復(fù)壯、珠心胚變異發(fā)掘和相關(guān)基礎(chǔ)研究提供珍貴的種質(zhì)材料。

1 材料和方法

1.1 研究材料

國慶1 號(hào)溫州蜜柑（Citrus unshiu Marc.，簡(jiǎn)稱G1）嫁接于枳砧并定植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘育種試驗(yàn)基地，其周圍栽植有華農(nóng)本地早橘等品種，樹齡均10 a（年）以上。2021 年1 月因低溫凍害影響，國慶1號(hào)溫州蜜柑果實(shí)受凍而不可食用，全部采摘用于收集種子。

1.2 種子離體培養(yǎng)

將飽滿種子置于1 mol?L^{- 1} NaOH 溶液中浸泡15 min 去除果膠，用自來水沖洗干凈后剝?nèi)ネ夥N皮；無菌條件下，將去除外種皮的種子置于3%（φ）NaClO 溶液中浸泡消毒15 min；用無菌蒸餾水清洗至少3 次后，將種子轉(zhuǎn)移至滅菌的三角瓶；用鑷子去除內(nèi)種皮后，將其接種于播種培養(yǎng)基（MT + 25 g·L-1蔗糖，pH = 5.8）并置于培養(yǎng)室光照培養(yǎng)。培養(yǎng)室條件：溫度（25±1）℃；光照16 h。

1.3 倍性鑒定

待幼苗長(zhǎng)至有3～5 枚真葉大小時(shí)，用流式細(xì)胞儀和根尖染色體壓片2 種方法檢測(cè)植株倍性。流式細(xì)胞儀（Cyflow space，Sysmex，Japan）倍性檢測(cè)參考解凱東等[7]的方法。根尖染色體壓片參考夏強(qiáng)明[8]的方法并適當(dāng)修改。取生長(zhǎng)旺盛的根尖，飽和對(duì)二氯苯溶液室溫下預(yù)處理3 h 后，用新鮮的卡諾固定液（V _乙醇∶V _乙酸= 3∶1）固定24 h，最后轉(zhuǎn)移至75%乙醇溶液4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ破?，根尖用酶液?%果膠酶（Sigma- aldrich）、2%纖維素酶Onozuka（R- 10，Yakult）和1%果膠酶（Y-23，Yakult））37 ℃水浴處理90 min 后，用火焰干燥法進(jìn)行染色體制片，并用熒光顯微鏡（Imager. M2，Zeiss，Germany）鏡檢，染色體圖像用ZEN軟件采集。

四倍體群體發(fā)生頻率/%=四倍體植株數(shù)/群體植株總數(shù)×100。

1.4 植株移栽

將倍性分析后的所有植株移栽至裝有營養(yǎng)土（V _{進(jìn)口泥炭土}∶V _{基質(zhì)土}∶V _蛭石∶V _珍珠巖= 4∶4∶1∶1）的營養(yǎng)缽并置于生長(zhǎng)室煉苗。待幼苗長(zhǎng)至7～8 枚真葉大小時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至溫室，期間保證正常肥水管理。生長(zhǎng)室條件：溫度（25±1）℃；光照16 h。

1.5 SSR分子鑒定

基因組DNA 提取和SSR 分子標(biāo)記分別參考Cheng 等[9]和謝善鵬等[10]的方法。篩選的4 對(duì)多態(tài)性SSR 引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系10 μL：2× PCR mix 5 μL，正、反向引物各0.25 μL（10 μmol?L-1），DNA 模板1 μL，無菌水3.5 μL。PCR 反應(yīng)在ProFlex PCR 儀（ABI，USA）進(jìn)行，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物由全自動(dòng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（QIAxcel Advanced，QIAGEN）電泳分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體實(shí)生播種獲得62株國慶1號(hào)溫州蜜柑幼苗

溫州蜜柑一般表現(xiàn)為雄性不育、果實(shí)無核，種子極少見；但若花期遇高溫，育性能部分恢復(fù)，成熟果實(shí)可能偶爾有少量種子?；谠摤F(xiàn)象，筆者從國慶1 號(hào)溫州蜜柑約12 500 個(gè)成熟果實(shí)中，剝?nèi)～@得106 粒種子（圖1-A），其中80 粒為飽籽，26 粒為癟籽（圖1-B）。對(duì)所有種子離體播種培養(yǎng)，由于部分飽滿種子污染和癟籽未能萌發(fā)，最終有41 粒飽滿種子萌發(fā)，萌發(fā)率為38.7%；經(jīng)培養(yǎng)獲得再生實(shí)生幼苗62 株，平均每粒種子再生植株1.5 株（圖1-C～D）。

2.2 倍性分析發(fā)掘1株國慶1號(hào)溫州蜜柑四倍體植株

用流式細(xì)胞儀對(duì)所有62 株實(shí)生幼苗進(jìn)行倍性分析，其中61 株為二倍體（圖2-A），發(fā)掘獲得1 株四倍體植株（圖2-B），四倍體發(fā)生頻率1.61%。進(jìn)一步用根尖壓片法對(duì)獲得的四倍體進(jìn)行染色體數(shù)目分析，表明其染色體數(shù)為36 條（圖2-D），是二倍體（圖2-C）染色體數(shù)目的2 倍，驗(yàn)證了流式細(xì)胞儀倍性分析結(jié)果的可靠性。

2.3 SSR分子鑒定

將倍性分析后的所有實(shí)生幼苗移栽至溫室。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至一定大小后，選取4 對(duì)擴(kuò)增效果好的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記對(duì)隨機(jī)選取的38 株二倍體植株和1株四倍體植株進(jìn)行遺傳鑒定（圖3）。結(jié)果表明，四倍體植株帶型與其親本國慶1 號(hào)溫州蜜柑完全一致（圖3-T4），表明該四倍體可能由國慶1 號(hào)溫州蜜柑珠心細(xì)胞自然加倍形成，為雙二倍體；而38 株二倍體植株中，35 株的條帶與國慶1 號(hào)溫州蜜柑完全一致，推測(cè)由國慶1 號(hào)溫州蜜柑珠心胚發(fā)育而來；其余3 株二倍體植株（I1、O2、S3）與國慶1 號(hào)溫州蜜柑條帶不一致，為合子胚來源，可能為國慶1 號(hào)溫州蜜柑與其附近其他柑橘品種的天然有性后代。

3 討論

筆者在本研究中采用成熟種子離體播種，結(jié)合倍性分析和SSR 分子鑒定，發(fā)掘出1 株國慶1 號(hào)溫州蜜柑四倍體植株；隨機(jī)挑選的38 株二倍體實(shí)生幼苗，3 株為國慶1 號(hào)溫州蜜柑有性胚苗，其余35 株為珠心胚苗。這些種質(zhì)材料將助力國慶1 號(hào)溫州蜜柑提純復(fù)壯、珠心胚變異育種及相關(guān)基礎(chǔ)研究。

溫州蜜柑一般表現(xiàn)為雄性不育、果實(shí)無核；但若對(duì)其授粉或花期遇高溫（育性會(huì)部分恢復(fù)），其果實(shí)偶爾會(huì)產(chǎn)生種子。如黃秀等[6]發(fā)現(xiàn)自然條件下，由良溫州蜜柑果實(shí)基本無核，而用其他品種的花粉對(duì)其人工授粉，可獲得少量種子（單果種子數(shù)介于0.36～1.66 粒之間）；鄧秀新等[14]對(duì)移入25 ℃溫室的國慶1 號(hào)溫州蜜柑花粉育性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與對(duì)照相比表現(xiàn)出育性恢復(fù)現(xiàn)象，筆者在本研究中從約12 500個(gè)國慶1 號(hào)溫州蜜柑成熟果實(shí)獲得106 粒種子的結(jié)果與前人研究基本一致。推測(cè)國慶1 號(hào)溫州蜜柑種子可能由其與周圍栽植的華農(nóng)本地早橘等其他品種異花授粉形成或由于其花粉育性部分恢復(fù)后自交形成。筆者在本研究中離體播種了80 粒飽籽和26 粒癟籽，由于操作不當(dāng)，部分飽籽污染，僅41 粒飽籽萌發(fā)；而癟籽均未萌發(fā)，可能與癟籽營養(yǎng)不足或低溫受凍導(dǎo)致種子活力下降等有關(guān)。

筆者采用4 對(duì)SSR 引物對(duì)發(fā)掘的1 株四倍體和38 株二倍體實(shí)生幼苗進(jìn)行遺傳鑒定，發(fā)現(xiàn)四倍體帶型與其二倍體親本完全一致，與前人研究一致[15-17]，推測(cè)其由國慶1 號(hào)溫州蜜柑珠心細(xì)胞自然加倍形成。王江波等[18]用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)由種子萌發(fā)來的7 株蘆柑實(shí)生苗進(jìn)行遺傳鑒定，其與母本條帶完全一致均為珠心苗。筆者在本研究中隨機(jī)挑選的38 株二倍體植株中，35 株二倍體植株條帶與母本完全一致，為珠心胚苗；其余3 株二倍體植株遺傳背景與國慶1 號(hào)溫州蜜柑不一致，推測(cè)其為國慶1 號(hào)溫州蜜柑與周圍其他柑橘品種異花授粉形成的有性胚苗。日本科學(xué)家最近報(bào)道宮川溫州蜜柑四倍體與二倍體正反雜交時(shí)，均能產(chǎn)生飽滿種子和三倍體后代，說明宮川溫州蜜柑四倍體育性恢復(fù)，可以用作育種親本[17]。筆者在本研究中發(fā)掘的國慶1 號(hào)溫州蜜柑四倍體，其開花結(jié)果習(xí)性有待觀察評(píng)價(jià)，國慶1 號(hào)溫州蜜柑四倍體為細(xì)胞質(zhì)雄性不育等相關(guān)基礎(chǔ)研究和多倍體育種提供了珍貴的種質(zhì)材料；培育的國慶1號(hào)溫州蜜柑珠心胚苗將有助于該品種提純復(fù)壯和二倍體水平珠心苗變異發(fā)掘。