缺鐵脅迫下葡萄試管苗對(duì)外源褪黑素的生長和生理響應(yīng)

關(guān)鍵詞：葡萄試管苗；缺鐵脅迫；褪黑素；生理響應(yīng)

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）02-0300-09

葡萄（Vitis vinifera L.）是一種富含各類維生素、膳食纖維等較高營養(yǎng)物質(zhì)的漿果類水果[1]，在世界五大洲均有種植，2018 年全球葡萄總產(chǎn)量達(dá)7780 萬t，其中鮮食葡萄占36%，而中國鮮食葡萄產(chǎn)量已位居世界首位[2]。在植物的新陳代謝中，鐵是植物生長必需的微量元素之一，參與葉綠素及呼吸酶的合成、氮代謝、活性氧代謝等[3]過程。褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺，Melatonin，MT）是色氨酸吲哚類衍生物，為新型植物生長調(diào)節(jié)劑[4]。然而不合理的施肥方式、栽培管理措施導(dǎo)致設(shè)施土壤鹽漬化[5-6]，許多的微量元素不能被足量吸收，不能滿足作物生長的需求，導(dǎo)致植物發(fā)生缺鐵性失綠癥，影響植物正常生長及發(fā)育[7-8]。近年來，外源供給能夠提高植物細(xì)胞的抗逆性并緩解逆境脅迫，這已成為全球農(nóng)業(yè)研究的熱點(diǎn)[9]。探索分析其他領(lǐng)域中的外源供給物質(zhì)和使用劑量及在葡萄試管苗缺鐵脅迫上的生長表現(xiàn)和生理響應(yīng)，為葡萄抗逆境脅迫的外源供給物質(zhì)庫添磚加瓦，成為研究的指南針。目前研究調(diào)控植物逆境的外源物質(zhì)眾多[10]。如：Noor 等[11]研究的茉莉酸酯等在短生長周期作物的抗逆境生物學(xué)響應(yīng)，Mfarrej等[12]研究了外源NO和H2S對(duì)小麥內(nèi)澇的緩解作用，外源曲霉提高多年生黑麥草的耐旱性和耐熱性[13]及外源鄰苯二甲酸對(duì)西瓜種子萌發(fā)、根系生理特性及礦質(zhì)元素吸收的影響[14]等。但是在果樹的抗逆境研究中外源物質(zhì)的使用較少，存在某外源物質(zhì)對(duì)提高葡萄的逆境抗性不明顯。油菜素內(nèi)酯（BR）、水楊酸（SA）、NO、外源硅、外源Ca²⁺和MT能夠通過提高葉片中葉綠素的含量，降低作物葉片的黃化面積，促進(jìn)抗氧化酶[1（5] SOD等）的活性，降低超氧陰離子累積效應(yīng)的損傷程度，促進(jìn)葡萄果實(shí)中可溶性糖和可溶性蛋白的合成[16]，提高在氨基酸上的代謝、合成水平，協(xié)助作物提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（Pro、SS和SP）含量以抵御逆境，有效緩解作物（華山松[17]、番茄[18]、小白菜[19]、黃瓜[20-21]、葡萄[16，22-23]等）缺鐵黃化癥狀，減輕逆境對(duì)植株生長的傷害，但未見明確描述外源MT對(duì)葡萄試管苗缺鐵逆境的響應(yīng)。缺鐵脅迫下植株會(huì)表現(xiàn)出葉片黃化的現(xiàn)象，影響單株的生物合成量及長勢，外源MT處理可以有效緩解許多作物的脅迫癥狀，使作物能夠抵抗逆境并短時(shí)間脫離鹽害或缺素環(huán)境。然而在葡萄試管苗的缺鐵脅迫研究中，并未明確外源褪黑素對(duì)植株的生長表現(xiàn)影響和生理響應(yīng)如何。筆者在本試驗(yàn)中以實(shí)驗(yàn)室組培苗繁殖技術(shù)提供的克瑞森無核葡萄試管苗為材料，在缺鐵脅迫下添加外源褪黑素，觀察各處理葡萄的生長情況，并從生理層面上研究褪黑素對(duì)缺鐵脅迫的緩解效應(yīng)，確定外源褪黑素對(duì)缺鐵脅迫下的葡萄緩解效果是否顯著，以期增添農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中葡萄抗缺鐵脅迫調(diào)控的外源物質(zhì)種類。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為繼代保存的克瑞森無核葡萄試管苗，采用改良B5 固體培養(yǎng)基擴(kuò)繁，選擇長勢均勻且生長健壯的試管苗，剪成長1.0～1.5 cm的單芽莖段，轉(zhuǎn)接至添加了不同處理的B5 培養(yǎng)基上，置于溫度（27±1）℃，光照度3000 lx，光、暗期比2∶1 的環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)處理

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置鐵濃度為30 μmol·L^-1（輕度脅迫），外源褪黑素處理濃度為140 μmol·L^-1，試驗(yàn)處理如表1 所示。每個(gè)處理轉(zhuǎn)接20 瓶試管苗，共3次重復(fù)，總計(jì)60瓶。

1.3 測定指標(biāo)與方法

處理后定期觀察葡萄長勢，接種后50 d 時(shí)，采樣測定相關(guān)指標(biāo)。

將植株從三角瓶中小心取出，測定株高、莖粗、植株干鮮質(zhì)量、葉面積及根系指標(biāo)。葉面積和根系指標(biāo)用Epson 根系掃描儀（STD 4800 型）掃描，用根系分析軟件（Win RHIZO 5.0，Canada）進(jìn)行分析。

葉綠素含量采用95%乙醇浸提法測定，葉片丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色法測定，脯氨酸含量用茚三酮法測定，SOD活性用氮藍(lán)四唑光化學(xué)還原法測定，POD活性用愈創(chuàng)木酚法[24]測定；根系活力采用氯化三苯基四氮唑法[25]測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法[26]測定；可溶性糖含量采用蒽酮法[27]測定；硝酸還原酶活性采用磺胺比色法[28]測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用IBM SPSS 24 軟件進(jìn)行差異顯著性分析（Ducan法），用Origin 9.1 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對(duì)缺鐵脅迫下葡萄生長的影響

2.1.1 外源褪黑素對(duì)缺鐵脅迫下葡萄植株形態(tài)及生物量的影響 各處理葡萄植株形態(tài)如圖1所示，CK+MT處理植株葉片鮮綠，莖稈粗壯，長勢最強(qiáng)；-Fe處理植株矮小，莖稈纖細(xì)，長勢最弱，在幼葉部位出現(xiàn)了明顯的黃化現(xiàn)象；然而較-Fe 處理植株，-Fe+MT處理植株長勢略顯優(yōu)勢，莖稈較粗，黃葉數(shù)量顯然減少。由表2 可知，試管苗的株高和莖粗，對(duì)照組顯著高于缺鐵處理，但-Fe 和-Fe+MT處理間差異不顯著；CK+MT 株高較CK、- Fe 和- Fe +MT 分別高21.98%、75.88% 、51.53% ，莖粗分別高21.96% 、75.85% 、51.52%。全株鮮質(zhì)量CK+MT較CK高19.09%，差異顯著；-Fe+MT較-Fe高33.29%，差異顯著；CK和-Fe+MT差異不顯著。對(duì)照組植株干質(zhì)量顯著大于缺鐵處理，-Fe 干質(zhì)量較CK低53.63%，但CK和CK+MT間、-Fe 和-Fe+MT間差異不顯著?？梢?，MT對(duì)植株生長具有一定促進(jìn)作用，對(duì)于輕度缺鐵脅迫下的植株有良好的保護(hù)作用，使植株脅迫癥狀得到緩解。

2.1.2 外源褪黑素對(duì)缺鐵脅迫下葡萄根系和葉片生長的影響 由表3 可知，CK+MT的總根長、平均根系直徑、根系表面積、根系投影面積、根系總體積和葉面積顯著高于其他處理，平均值最高，-Fe 最低。-Fe+MT 較CK 平均根系直徑、根系表面積、根系投影面積、根系總體積和葉面積差異顯著，分別下降8.60%、39.84%、42.70%、26.00%和26.80%；-Fe+MT的葉投影面積較-Fe 顯著上升147.78%。通過分析發(fā)現(xiàn)，加入外源MT，對(duì)CK的根系建成和葉面積增加有促進(jìn)效果，對(duì)-Fe 地上地下的脅迫癥狀有緩解作用，保證植株的正常生長。

2.2 外源褪黑素對(duì)缺鐵脅迫下葡萄生理指標(biāo)的影響

2.2.1 外源褪黑素對(duì)缺鐵脅迫下葡萄葉綠素含量的影響 葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量，CK和CK+MT之間、-Fe 和-Fe+MT及CK和-Fe+MT之間差異均顯著（表4）。葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量對(duì)比中，CK+MT 較CK 分別上升18.46%、142.94%、16.24%；-Fe+MT較-Fe 分別上升55.07%、57.14%、63.77%；-Fe+MT 較CK 分別下降28.20%、33.94%、21.35%。而在總?cè)~綠素含量中，CK與CK+MT之間、-Fe 與-Fe+MT之間差異不顯著，-Fe+MT較CK下降了23.37%，差異顯著。

2.2.2 外源褪黑素對(duì)缺鐵脅迫下葡萄MDA和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響 由表5 可知，-Fe 處理的MDA、Pro、可溶性糖和可溶性蛋白含量明顯高于其他處理。在CK 與CK+MT和-Fe 與-Fe+MT之間，MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量差異不顯著，-Fe+MT較CK 分別上升9.68%、3.08%、9.38%，差異顯著；CK+MT脯氨酸含量較CK顯著下降36.56%，-Fe 較CK 顯著上升29.37%。綜上可知，MDA、Pro、可溶性糖和可溶性蛋白含量由高到低均為：CK+MT＞-Fe＞-Fe+MT＞CK。

2.2.3 外源褪黑素對(duì)缺鐵脅迫下葡萄葉片酶活性和根系活力的影響 從表6 可知，-Fe 與-Fe+MT、CK與CK+MT 的葉片SOD 活性差異不顯著，CK+MT較- Fe 的下降5.12%，差異顯著（p＜0.05）；CK 與CK+MT的POD活性差異不顯著，-Fe 較-Fe+MT的顯著下降36.56%。-Fe 較-Fe+MT和CK較CK+MT的根系活力差異顯著，其中CK+MT的根系活力值最高，-Fe 的最低，CK與CK+MT較-Fe 與-Fe+MT的都高。-Fe的NR活性最低，較CK、CK+MT和-Fe+MT呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，分別下降了47.51%、53.2%和21.49%；在MT處理后，CK+MT與-Fe+MT較CK與-Fe，NR活性整體有明顯的上升趨勢，同比于未施MT的處理CK與-Fe分別上升了12.15%、27.37%。NR活性由高到低為：CK+MT＞CK＞-Fe+MT＞-Fe。

3 討論

3.1 缺鐵脅迫下葡萄響應(yīng)外源褪黑素處理的生長效應(yīng)

有研究者發(fā)現(xiàn)，在輕度缺鐵脅迫下，葡萄頂葉表現(xiàn)失綠或黃白色，光合代謝受到抑制；MT能調(diào)節(jié)細(xì)胞壁延伸的物理過程以誘導(dǎo)植物根系生長，使根系投影面積，總根長和根系總體積增加[29]。本試驗(yàn)中，缺鐵脅迫下，葡萄呈現(xiàn)長勢不良、株高不均，葉片黃化，莖稈細(xì)小，根系發(fā)育不良等狀況；添加MT后，植株生長狀況有較好的恢復(fù)，各項(xiàng)指標(biāo)明顯優(yōu)于缺鐵處理。外源褪黑素可能通過參加必需物質(zhì)的合成途徑、調(diào)節(jié)植物激素的合成量和充當(dāng)各類酶的輔基，促進(jìn)蛋白質(zhì)的表達(dá)[30]，改善葡萄根系的生長環(huán)境，促進(jìn)正常處理的植株生長，提高葡萄對(duì)逆境的抗性。

3.2 缺鐵脅迫下葡萄響應(yīng)外源褪黑素處理的生理效應(yīng)

植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)是光合作用，葉片是植物光合作用的主要器官，光合色素是評(píng)價(jià)植株光合特性的重要指標(biāo)之一，光合色素的含量直接影響光合作用的強(qiáng)弱以及植物的生長[31]。試驗(yàn)表明：在CK與-Fe 均加入外源褪黑素后，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量都有明顯回升，對(duì)-Fe 處理的緩解效果最明顯，說明外源褪黑素可能會(huì)加速受損的葉綠素分解，促進(jìn)合成吲哚胺延緩葉綠素分解，增強(qiáng)了葉綠素的從頭合成[32-34]，對(duì)缺鐵脅迫下葡萄葉片的葉綠素結(jié)構(gòu)有很好的保護(hù)作用。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度的重要診斷指標(biāo)，其含量體現(xiàn)植物對(duì)缺鐵的反應(yīng)程度大小[35]；而植物遭受逆境脅迫，細(xì)胞膜氧化程度升高，細(xì)胞的膜透性增強(qiáng)。與徐寧等[4]研究的外源褪黑素對(duì)硝酸鹽的緩沖機(jī)制相似，逆境使細(xì)胞內(nèi)部的氧化能力提高，過氧化物質(zhì)和超氧離子單位面積含量等急劇升高，機(jī)體將會(huì)打開防御機(jī)制，對(duì)逆境進(jìn)行主動(dòng)或被動(dòng)調(diào)節(jié)，抗氧化防御系統(tǒng)（SOD-POD抗氧化防御系統(tǒng)）被激活，會(huì)引起POD活性下降，SOD活性上升[36]，主要清除細(xì)胞體內(nèi)的超氧自由基和過氧化產(chǎn)物[35]。本試驗(yàn)中，缺鐵脅迫下，葡萄的SOD活性、Pro 和MDA含量較CK處理顯著升高，POD活性下降；加入外源MT后，POD活性有所上升，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量和SOD活性快速下降。說明缺鐵脅迫下添加MT，可激活SOD-POD 抗氧化防御系統(tǒng)，減輕鹽脅迫下過量的自由基對(duì)植物細(xì)胞的鹽害作用[37] ，提升了葡萄的抗逆性能。

Pro、SP和SS是植物逆境滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，反映植物對(duì)逆境的抵抗能力。在輕度缺鐵脅迫下，CK與-Fe 相比，-Fe 處理下葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著高于CK，而CK與-Fe 添加MT后，能有效降低脅迫處理（-Fe）的Pro、可溶性蛋白和可溶性糖含量，CK的降幅不大。外源褪黑素可能通過促進(jìn)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和糖類的合成，提高葡萄的抗逆境能力[37]，提高了滲透調(diào)節(jié)的能力，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性[4，38]，減少內(nèi)含物質(zhì)的丟失，也是為SOD-POD防御機(jī)制開啟第二道防線，有效地緩解了缺鐵脅迫對(duì)細(xì)胞膜的損傷。

根系活力表示植株的根系細(xì)胞活性，即對(duì)土壤營養(yǎng)元素的吸收能力[39]。且NR是一類關(guān)于氮元素在植物體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化的活性酶，其作用是催化NO3-轉(zhuǎn)化為NO2-來進(jìn)行氮代謝的調(diào)控[40]，其活性反映氮代謝的強(qiáng)弱，活性越強(qiáng)，硝酸鹽的累積量就越少，植物氮代謝能力越強(qiáng)。本試驗(yàn)中，-Fe 處理的NR活性較低，但較其他處理試管苗的硝酸鹽累積量高，-Fe+MT處理NR活性值上升。缺鐵脅迫可能導(dǎo)致NR活性值降低，從而降低了植物對(duì)硝酸鹽的利用率[40]，導(dǎo)致植株對(duì)氮元素的吸收減少而體內(nèi)累積硝酸鹽，根系的生長和吸收能力受阻，導(dǎo)致植株長勢不良。硝酸鹽的累積又會(huì)導(dǎo)致根系活力的降低，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，植物體電解質(zhì)滲透率提高，細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)越來越低，活性氧代謝加強(qiáng)，MDA含量上升，葉綠素分解加劇，在雙脅迫的壓力下，植株長勢矮小，莖稈纖細(xì)。再加入MT 后，由于自身親水，進(jìn)入細(xì)胞通暢，進(jìn)一步提高了幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和游離氨基酸含量，從維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的運(yùn)輸能力，同時(shí)緩解缺鐵脅迫和硝酸鹽累積脅迫[4，41]。

4 結(jié)論

在輕度缺鐵脅迫下，加入MT后，葡萄試管苗根系體積和葉面積增大，植株生長狀態(tài)良好；葉片光合色素含量、POD 活性、NR 活性和根系活力顯著上升，MDA含量、Pro 含量、SOD活性、SS 含量和SP 含量顯著下降。140 μmol·L-1 MT處理能有效緩解葡萄試管苗的缺鐵癥狀，保護(hù)植株在生理方面免受傷害，保證植株的正常生長發(fā)育。