基于二次回歸正交旋轉(zhuǎn)探究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)3種葡萄砧木莖段快繁的影響

關(guān)鍵詞：葡萄砧木；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；莖段快繁；二次回歸正交旋轉(zhuǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）02-0286-14

葡萄（Vitis vinifera L.）是葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis L.）多年生木質(zhì)藤本植物，可鮮食、制干、制汁、藥用等，因其適應(yīng)性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益高，廣泛種植在世界各地[1-2]。新疆作為中國(guó)最大的葡萄產(chǎn)區(qū)，因其光熱資源豐富，葡萄品質(zhì)獨(dú)特而聞名中外。在傳統(tǒng)種植過(guò)程中，多以自根苗繁育，無(wú)法避免土壤干旱[3]、鹽漬化[4]等生態(tài)脆弱的問(wèn)題，這嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，采用抗性砧木成為解決這一問(wèn)題的有效措施之一。5BB、1103P、SO₄、貝達(dá)、山河1 號(hào)等葡萄砧木具有較強(qiáng)抗旱、抗鹽堿能力，且生根和嫁接狀況良好[5-6]。但在實(shí)際生產(chǎn)中，砧木通過(guò)扦插等方式繁殖數(shù)量有限，且易感染病毒[7]。莖段快繁作為植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)之一，具有取材方便、不易污染、繁殖系數(shù)高的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)苗木脫毒、離體再生，已成為歐美地區(qū)葡萄栽培的主流方式[8- 9]。Yildirim 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MS 培養(yǎng)基比WPM、QL、DWK培養(yǎng)基所培養(yǎng)的?küzg?zü 葡萄和Bo?azkere葡萄生長(zhǎng)效果好；蔡文博等[11]對(duì)夏黑、紅地球、巨峰和玫瑰香進(jìn)行增殖培養(yǎng)和生根誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，WPM培養(yǎng)基比1/2MS培養(yǎng)基中的葡萄莖段萌發(fā)率高，且葉片長(zhǎng)勢(shì)好，生根量多，更利于組培苗擴(kuò)繁。多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的相互作用對(duì)植株快繁會(huì)產(chǎn)生一定的積極作用。林茜等[12]對(duì)陽(yáng)光玫瑰的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，1.50 mg·L^-1 6-BA和0.20 mg·L^-1 NAA的相互作用可得到最高的萌芽率。農(nóng)艷豐等[13]發(fā)現(xiàn)，在陽(yáng)光玫瑰繼代培養(yǎng)時(shí)添加1.50 mg·L^-1 KT和0.10 mg·L-1IAA 的無(wú)菌芽較為粗壯，葉色更深。蘇玲等[14]在貴妃玫瑰的生根培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，以1/2MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加0.50 mg·L^-1 IBA 時(shí)，其生根率達(dá)到最高，根系生長(zhǎng)狀況最優(yōu)。中國(guó)大部分研究集中在鮮食和釀酒葡萄上，對(duì)砧木研究較少，且不同的葡萄品種對(duì)培養(yǎng)基中各成分的響應(yīng)各不相同[15]，探究不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)繁殖系數(shù)的影響已成為建立高效莖段快繁體系的關(guān)鍵所在。筆者在本研究中旨在通過(guò)對(duì)5BB、1103P、SO₄ 葡萄砧木在初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)過(guò)程中不同培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的篩選，以期為葡萄砧木的快速繁殖和生產(chǎn)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪教學(xué)實(shí)踐基地的5BB、1103P、SO4 一年生苗，其中5BB砧木親本為V. berlandieri×V. riparia，1103P砧木親本為V. berlandieri‘Rességuier’×V. rupestris‘Du Lot’，SO4 砧木親本為V. berlandieri×V. riparia‘No.4’[16]，將其種植在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院特色果樹(shù)研究中心室內(nèi)陽(yáng)臺(tái)，進(jìn)行盆栽苗培養(yǎng)，每個(gè)品種30 盆。約60 d 后，取直徑為1～2 mm粗半木質(zhì)化的新梢進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒 將新梢剪成2～3 cm 長(zhǎng)的單芽莖段，放在燒杯中，蓋上紗布，用流水沖洗1 h，去除表面污漬。隨后在超凈工作臺(tái)上，以75%乙醇浸泡30 s，用0.10% HgCl 溶液消毒8 min，隨后用無(wú)菌水沖洗3～5 次，去除外植體表面消毒劑殘留，最后將莖段置于已滅菌的接種盤(pán)中備用。

1.2.2 初代培養(yǎng) 以B5、MS、WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加2.00 mg · L^{- 1} 6-BA、0.20 mg · L- 1IBA、0.20 mg·L^-1 GA3、30 g·L^-1蔗糖、7 g·L^-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.80。在超凈工作臺(tái)上，剪去外植體兩端浸染過(guò)消毒劑的部分，留取長(zhǎng)1.50～2.00 cm 帶腋芽的莖段，接種于培養(yǎng)基上，每瓶接1 個(gè)莖段，每種培養(yǎng)基10 瓶，3 次重復(fù)。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和腋芽萌發(fā)率。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照度2000～2500 lx，光照時(shí)間12 h·d^-1。

污染率/%=（污染數(shù)/接種數(shù)）×100；

死亡率/%=（死亡數(shù)/接種數(shù)）×100；

腋芽萌發(fā)率/%=（萌芽數(shù)/接種數(shù)）×100。

1.2.3 繼代培養(yǎng) 外植體培養(yǎng)30 d 后，待萌發(fā)的叢生芽生長(zhǎng)至長(zhǎng)度為5～6 cm時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。剪切萌發(fā)的叢生芽，去除葉片后剪成單芽莖段（長(zhǎng)10～15mm）。繼代培養(yǎng)選用三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以初代培養(yǎng)所篩選的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加不同質(zhì)量濃度的3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-BA、IBA、GA3）、30 g ·L^{- 1} 蔗糖、7 g ·L^{- 1} 瓊脂，調(diào)節(jié)pH 為5.80。

參照高林等[17]的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)6-BA質(zhì)量濃度為1～3.00 mg·L^-1、IBA 質(zhì)量濃度為0～0.50 mg·L^-1、GA3質(zhì)量濃度為0～1.00 mg·L^-1，3 種激素各設(shè)5 個(gè)濃度水平進(jìn)行組合試驗(yàn)。各水平編碼值與濃度詳見(jiàn)表1。

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化后的水平編碼值與激素質(zhì)量濃度如表2 所示。其中，X₁、X₂、X₃分別代表6-BA、IBA、GA₃的處理濃度。每個(gè)處理接種3 瓶，每瓶接種一個(gè)叢生芽，3 組重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖情況，計(jì)算增殖系數(shù)（分別以Y1、Y2、Y3 代表5BB、1103P 和SO4 葡萄砧木的增殖系數(shù)）。培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)條件相同。

增殖系數(shù)=總芽數(shù)/接種芽數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將繼代培養(yǎng)中長(zhǎng)勢(shì)相近的叢生芽切下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上。以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的IBA（0、0.50 mg·L^-1、1.00 mg·L^-1、1.50 mg·L^-1）和Ac（0、0.10 g·L^-1、0.20 g·L^-1），并附加30 g·L^-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH 為5.80，共12 個(gè)處理，每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶1 株，重復(fù)3組。接種后先進(jìn)行一段時(shí)間的暗培養(yǎng)（0 d、3 d、7 d），隨后進(jìn)行12 h·d^-1光周期培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)和生根系數(shù)。培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)條件相同。

生根系數(shù)=總生根數(shù)/總接種苗數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，DPS軟件進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（Duncan法，p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)莖段初代培養(yǎng)的影響

由表3 可知，不同培養(yǎng)基對(duì)3 種葡萄砧木莖段初代培養(yǎng)的腋芽萌發(fā)率和平均株高存在顯著差異（p＜0.05）。5BB砧木中，MS培養(yǎng)基的腋芽萌發(fā)率達(dá)到100%，株高達(dá)到最大為25.20 mm，且莖段無(wú)污染死亡，B5 培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基的腋芽萌發(fā)率均為96.67%，但B5 培養(yǎng)基叢生芽的株高略大于WPM培養(yǎng)基，且WPM培養(yǎng)基的死亡率較高。1103P砧木的3種培養(yǎng)基的腋芽萌發(fā)率均達(dá)到100%，且莖段無(wú)污染死亡，但MS培養(yǎng)基的平均株高達(dá)到最大，為20.90 mm。SO₄ 砧木中的MS和WPM培養(yǎng)基的腋芽萌發(fā)率達(dá)到100%，且莖段無(wú)污染死亡，但MS培養(yǎng)基的株高略高于WPM為22.43 mm，B5 培養(yǎng)基的腋芽萌發(fā)率最低（96.67%），且污染率為3.33%。各砧木在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況如圖1 所示。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)增殖系數(shù)的影響

對(duì)3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之間相互作用的影響效果進(jìn)行比較分析，由圖3 可知，當(dāng)6-BA和IBA 均處于最高濃度水平時(shí)，5BB、SO4 的增殖系數(shù)達(dá)到最大；當(dāng)6-BA處于最高質(zhì)量濃度水平，IBA 最低質(zhì)量濃度水平處時(shí)，1103P增殖系數(shù)達(dá)到最大。

由圖4 可知，當(dāng)6-BA和GA₃處于高質(zhì)量濃度水平或低質(zhì)量濃度水平時(shí)，對(duì)5BB、1103P 的增殖系數(shù)并無(wú)明顯影響；當(dāng)6-BA處于最高質(zhì)量濃度水平，GA3最低質(zhì)量濃度水平處時(shí)，SO4增殖系數(shù)達(dá)到最大。

由圖5可知，當(dāng)IBA和GA₃均處于最高質(zhì)量濃度水平時(shí)，5BB、SO4的增殖系數(shù)達(dá)到最大；當(dāng)IBA最低質(zhì)量濃度水平，GA₃處于最高質(zhì)量濃度水平或最低質(zhì)量濃度水平時(shí)，1103P增殖系數(shù)均可達(dá)到最大。

2.2.4 頻率分析法模擬最優(yōu)值 5BB砧木優(yōu)化方案中各變量取值的頻率分布如表7 所示，增殖系數(shù)大于1.35 的方案有112 個(gè)，其中95%的試驗(yàn)方案中，6-BA適宜的編碼值范圍為-0.45～4.45，IBA 適宜的編碼值范圍為-0.38～0.88，GA₃ 適宜的編碼值范圍為-0.73～1.73，取平均值為最適濃度所對(duì)應(yīng)的編碼值，即當(dāng)6-BA的質(zhì)量濃度為2.00 mg·L^-1、IBA 的質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1、GA₃的質(zhì)量濃度為0.50 mg·L^-1時(shí)，增殖培養(yǎng)的效果可達(dá)到最優(yōu)（圖6-A）。

1103P 砧木優(yōu)化方案中各變量取值的頻率分布如表8 所示，增殖系數(shù)大于1.31 的方案有114 個(gè)，其中95%的試驗(yàn)方案中，6-BA 適宜的編碼值范圍為-0.51～4.51，IBA適宜的編碼值范圍為-0.27～0.77，GA₃適宜的編碼值范圍為-0.73～1.73，取平均值為最適質(zhì)量濃度所對(duì)應(yīng)的編碼值，即當(dāng)6-BA的質(zhì)量濃度為2.00 mg·L^-1、IBA 的質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1、GA3的質(zhì)量濃度為0.50 mg·L^-1時(shí)，增殖培養(yǎng)的效果可達(dá)到最優(yōu)（圖6-B）。

SO4 砧木優(yōu)化方案中各變量取值的頻率分布如表9 所示，增殖系數(shù)大于1.22 的方案有111 個(gè)，其中95%的試驗(yàn)方案中，6-BA 適宜的編碼值范圍為-1.03～4.07，IBA適宜的編碼值范圍為-0.38～0.88，GA₃適宜的編碼值范圍為-0.86～1.58，取平均值為最適質(zhì)量濃度所對(duì)應(yīng)的編碼值，即當(dāng)6-BA的質(zhì)量濃度為1.52 mg·L^-1、IBA 的質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1、GA3的質(zhì)量濃度為0.36 mg·L^-1時(shí)，增殖培養(yǎng)的效果可達(dá)到最優(yōu)（圖6-C）。

2.3 不同濃度IBA和Ac對(duì)生根培養(yǎng)的影響

由表10～表12 可知，不同質(zhì)量濃度的IBA 和Ac在不同時(shí)間的暗處理下對(duì)不同砧木根長(zhǎng)及生根系數(shù)的影響程度各不相同，各處理間存在顯著差異（p＜0.05），以暗培養(yǎng)7 d、0.10 g ·L^-1的Ac 更有利于根的生長(zhǎng)。5BB和SO4 砧木的根長(zhǎng)和生根系數(shù)整體隨著暗培養(yǎng)時(shí)間、IBA 質(zhì)量濃度的增加而增加，IBA 質(zhì)量濃度為1.50 mg · L^{- 1} 時(shí)，5BB 砧木的生根系數(shù)可達(dá)2.60，生長(zhǎng)狀況如圖7-A所示，SO4 砧木的生根系數(shù)可達(dá)1.47，生長(zhǎng)狀況如圖7-C所示。1103P砧木隨著IBA 質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為1.00 mg·L-1時(shí)，生根系數(shù)可達(dá)2.30，生長(zhǎng)狀況如圖7-B所示。

3 討論

3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)莖段初代培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基是外植體賴(lài)以生存和發(fā)展的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，其無(wú)機(jī)物、有機(jī)物含量的差異會(huì)對(duì)芽的誘導(dǎo)造成不同的影響[18]。楊光等[19]對(duì)狀元紅葡萄研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，相比MS培養(yǎng)基和B5 培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基可獲得更高的莖段腋芽萌發(fā)率，這可能是因?yàn)?/2MS培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽含量較少，低鹽反而促進(jìn)了芽的萌發(fā)。B5 培養(yǎng)基為高硝酸鉀培養(yǎng)基，銨鹽較少，對(duì)試管苗的生長(zhǎng)抑制作用較小，有利于芽的萌發(fā)[20]。Mozafari等[21]研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基比WPM培養(yǎng)基更適合Khoshnav、Farkhi、Bidaneh Sefid 葡萄外植體的培養(yǎng)，更利于芽的生長(zhǎng)。這與本研究結(jié)果一致，即MS培養(yǎng)基更利于莖段腋芽的萌發(fā)。

3.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)增殖系數(shù)的影響

繼代培養(yǎng)是試管苗增殖擴(kuò)繁的重要環(huán)節(jié)之一，除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還可通過(guò)多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑協(xié)同作用共同促進(jìn)試管苗生長(zhǎng)，從而提高增殖效果[22]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度范圍過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響外植體的生長(zhǎng)，而利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，可進(jìn)一步優(yōu)化各個(gè)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度范圍，從而更準(zhǔn)確地計(jì)算出適宜不同品種所需的濃度范圍[23]。Alizadeh 等[24]對(duì)4 個(gè)遺傳不同的葡萄砧木Dogridge、SO4、H-144和3309C研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，6-BA和NAA的聯(lián)合使用更利于促進(jìn)芽的增殖，即當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.00 mg·L^-1，NAA質(zhì)量濃度為0.20 mg·L^-1更利于芽的增殖，并且在一定程度上可以縮短培養(yǎng)周期。Batukaev 等[25] 研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.50 mg · L^{- 1} 6-BA 和2.00 mg·L^-1 KT有利于提高復(fù)雜抗性葡萄品種芽的增殖效果。Kinfe 等[26]研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的BAP 和IBA 能促進(jìn)芽的增殖，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.00 mg·L^-1，IBA質(zhì)量濃度為0.10 mg·L^-1時(shí)，Cheninblanc 葡萄和Canonannon 葡萄的增殖效果最好，在6-BA質(zhì)量濃度為2.00 mg·L^-1，IBA 質(zhì)量濃度為0.10mg·L^-1時(shí)，Ugni blanc 葡萄的增殖效果最好。Khan等[27]對(duì)King’s Ruby葡萄研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在1.00 mg·L-16-BA和0.10 mg·L^-1 GA3組合優(yōu)化的培養(yǎng)基中，芽數(shù)量和長(zhǎng)度最大。6-BA和KT是較為穩(wěn)定的細(xì)胞分裂素，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，在增殖培養(yǎng)階段，NAA增殖效果略強(qiáng)于IBA，GA3可以打破休眠從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[28]。由此可知，對(duì)于不同品種，選擇合適的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度是提高增殖系數(shù)的關(guān)鍵所在[29]。

3.3 不同濃度IBA和Ac對(duì)生根培養(yǎng)的影響

生根培養(yǎng)是植株成苗的關(guān)鍵，除了受植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響外，還與環(huán)境等多種因素的影響有關(guān)[30]。本研究表明，適宜5BB、SO4 葡萄砧木生根培養(yǎng)的IBA 質(zhì)量濃度為1.50 mg·L^-1，適宜1103P 葡萄砧木生根培養(yǎng)的IBA 質(zhì)量濃度為1.00 mg · L^{- 1}。Amiri 等[31]對(duì)Sultanine 葡萄研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在1/2MS培養(yǎng)基中添加1.00 mg · L^{- 1} IBA 生根率最高，可達(dá)95%。IBA作為常見(jiàn)的生長(zhǎng)素對(duì)誘導(dǎo)不定根的生長(zhǎng)具有一定的特異性[32]，同時(shí)，在生根培養(yǎng)基中加入一定質(zhì)量濃度的Ac會(huì)增加根長(zhǎng)和生根頻率，對(duì)提高根系質(zhì)量至關(guān)重要[33]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，添加Ac的處理中，試管苗的生根情況均優(yōu)于未添加Ac的處理。Lazo等[34]對(duì)火焰無(wú)核的研究中發(fā)現(xiàn)，在1/2MS培養(yǎng)基中添加2.00 mg·L^-1 IBA、0.20 g·L^-1Ac，根系可獲得較好的發(fā)育。由此可知，適量的活性炭可通過(guò)吸附作用在創(chuàng)造黑暗環(huán)境的同時(shí)促進(jìn)試管苗生根[35]。

4 結(jié)論

本研究表明，最適宜3 種葡萄砧木初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基均為MS 培養(yǎng)基，萌發(fā)率均可達(dá)100%。最適宜5BB 和1103P 葡萄砧木的6-BA 質(zhì)量濃度為2.00 mg·L^-1、IBA 質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1、GA3質(zhì)量濃度為0.50 mg·L^-1；最適宜SO4 葡萄砧木的6-BA質(zhì)量濃度為1.52 mg·L^-1、IBA質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1、GA3質(zhì)量濃度為0.36 mg·L-1。最適宜3 種葡萄砧木生根培養(yǎng)的暗培養(yǎng)時(shí)間均為7 d，Ac 質(zhì)量濃度均為0.10 g ·L^-1，最適宜5BB、SO4 葡萄砧木生根培養(yǎng)的IBA 質(zhì)量濃度為1.50 mg·L^-1，5BB 葡萄砧木的生根系數(shù)可達(dá)2.60，SO4 葡萄砧木的生根系數(shù)可達(dá)1.47；最適宜1103P 葡萄砧木生根培養(yǎng)的IBA質(zhì)量濃度為1.00 mg·L^-1，生根系數(shù)可達(dá)2.30。