沙田柚×枳雜交群體創(chuàng)建與InDel標(biāo)記鑒定

關(guān)鍵詞：沙田柚；枳；雜交；InDel鑒定

中圖分類號(hào)：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）02-0223-07

雜交育種是選育柑橘新品種的主要途徑，而選育出優(yōu)良砧木也是提高柑橘產(chǎn)量、品質(zhì)的重要措施，砧木資源研究與利用情況是衡量一個(gè)國(guó)家柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r的重要標(biāo)志[1-2]。在中國(guó)果樹(shù)生產(chǎn)中，95%以上砧木來(lái)源于野生資源的種子或者其無(wú)性系品系和品種[3]。目前柑橘主要的砧木類型有枳、枳橙、香橙、酸橘、紅橘、酸柚等[4-5]，同時(shí)從國(guó)外引進(jìn)了施文格枳柚（Swingle citrumelo）、卡里佐（Carrizo）枳橙、特羅亞（Troyer）枳橙、蘭卜來(lái)檬（Rangpur lime）、奔騰枳橙（Benton citrange）、Rusk 枳橙等[6]，其中枳的應(yīng)用歷史最久，范圍最廣，面積最大，數(shù)量最多[7]。

枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]起源于我國(guó)，抗寒性強(qiáng)，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病、柑橘衰退病、流膠病等也具有較強(qiáng)的抗性或耐性，并且以它為砧木的柑橘表現(xiàn)出早結(jié)實(shí)、豐產(chǎn)特性，因此在中國(guó)、日本和其他許多國(guó)家（地區(qū)）被廣泛用作柑橘砧木[8-9]。枳是柑橘砧木育種中重要功能基因和抗性基因的重要來(lái)源，被廣泛用作砧木遺傳改良重要親本和抗性基因研究的主要材料。在已經(jīng)報(bào)道的柑橘砧木新品種中，美國(guó)的卡里佐枳橙、US系列，西班牙的FA系列等均是以枳為雜交親本所獲得[10]。

柚類在我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)中穩(wěn)步發(fā)展，主栽品種為沙田柚、琯溪蜜柚。由于柚具單胚特性，在實(shí)生繁殖條件下，很容易發(fā)生自然種間雜交和實(shí)生變異，經(jīng)過(guò)數(shù)千年來(lái)遺傳演化，我國(guó)柚類種質(zhì)資源已形成龐大的群體，種群分布豐富多彩[11]。

我國(guó)主栽柚類品種主要以枳和酸柚作砧木。但枳作砧木不適合所有柚類品種，石健泉等[12]認(rèn)為枳砧沙田柚具有良好的豐產(chǎn)性，但歐召華等[13]認(rèn)為枳砧無(wú)核柚、金香柚、墊江柚葉片黃化、樹(shù)早衰、產(chǎn)量低、不親和。而用酸柚作為柚的砧木，植株表現(xiàn)大根多、根深、須根少，嫁接親和性好，適宜在土層深厚、肥沃、排水良好的土壤栽培；但酸柚砧抗寒性較枳砧差，同時(shí)由于樹(shù)型過(guò)于高大，不符合現(xiàn)代矮化管理理念[14]。

目前，國(guó)外使用的枳柚并非真正的柚′枳雜交后代，而是美國(guó)在1907 年通過(guò)葡萄柚′枳的雜交后代—施文格枳柚（Swingle citrumelo），其綜合性狀優(yōu)于酸橙，耐寒（強(qiáng)于卡里佐枳橙）、耐鹽、耐旱，抗衰退病、根腐病、木質(zhì)陷點(diǎn)病和裂皮病，抗線蟲(chóng)；目前，佛羅里達(dá)州50%以上的柑橘和巴西部分地區(qū)的寬皮柑橘使用它作砧木[15]。施文格枳柚抗性雖強(qiáng)，但也有缺點(diǎn)，如用此砧的接穗生長(zhǎng)瘦弱，在pH 8.0 以上的堿性土壤中，常出現(xiàn)失綠病。與其他枳的雜交種一樣，作砧木常表現(xiàn)出大腳現(xiàn)象，并且實(shí)生苗生長(zhǎng)慢，比酸橙苗更難管理[16]。

沙田柚是我國(guó)柚類重要品種之一，具有種子多、單胚特性，常規(guī)有性雜交容易得到雜種后代[17]。筆者在本研究中采用沙田柚′枳雜交，擬篩選出具有枳優(yōu)良特性如矮化、抗逆性強(qiáng)等，且與我國(guó)主栽柚類親和性較強(qiáng)的砧木品種。

InDel 標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，是一種分布廣泛、密度高、變異穩(wěn)定性強(qiáng)的分子標(biāo)記，具有基因型判別簡(jiǎn)單、快速，適合于高密度分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等優(yōu)點(diǎn)[18]。通過(guò)雜交后代形態(tài)學(xué)觀察，并結(jié)合InDel 標(biāo)記的方式，篩選出真正的雜交F1代，為我國(guó)柑橘砧木新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以廣西桂林陽(yáng)朔5 株15 a（年）樹(shù)齡沙田柚為母本，湖南邵陽(yáng)洞口枳為父本（前期篩選出的枳優(yōu)系），2018—2021 年持續(xù)開(kāi)展雜交工作，待果實(shí)成熟后取種播種，得到雜交后代群體。

1.2 方法

1.2.1 采集花粉采集湖南邵陽(yáng)洞口枳花粉，充分干燥，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雜交授粉由于枳開(kāi)花較其他柑橘品種要早，在湖南地區(qū)枳開(kāi)花時(shí)，本地沙田柚尚未進(jìn)入花期，因此選擇廣西桂林的陽(yáng)朔縣開(kāi)展雜交試驗(yàn)；摘除母本花序上未開(kāi)放和已經(jīng)開(kāi)放的花，保留1 朵或2 朵即將開(kāi)放的花，去除雄蕊，授粉后套袋，共授粉8892朵。

1.2.3 獲得果實(shí)、取種播種待果實(shí)成熟后采集果實(shí)保存，分批取種，并分類統(tǒng)計(jì)；同時(shí)播種50 株枳、50 株沙田柚（由于沙田柚自花不實(shí)，父本為酸柚），作為對(duì)照。

1.2.4 形態(tài)學(xué)鑒定種子形態(tài)對(duì)比。將授粉后的果實(shí)種子與枳、沙田柚（沙田柚′酸柚后代）的種子進(jìn)行形態(tài)對(duì)比，將其種子分成飽滿、敗育2 種類型，分別統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。

葉片形態(tài)對(duì)比。將播種后的后代葉片與枳、沙田柚（沙田柚′酸柚后代）的葉片進(jìn)行形態(tài)對(duì)比，將其葉片按照三出復(fù)葉、單身復(fù)葉進(jìn)行分類對(duì)比[19]。

1.2.5 雜交后代群體DNA 的提取采用改良CTAB法提取子代葉片基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量[20]。

1.2.6 InDel 標(biāo)記引物篩選及雜交后代群體鑒定根據(jù)枳全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出4 對(duì)在父母本上具有多態(tài)性且便于擴(kuò)增與辨別條帶的InDel 標(biāo)記引物（未發(fā)表），由北京擎科生物科技有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 授粉后種子的形態(tài)特性及發(fā)芽率

10 月底，從5 株母本沙田柚樹(shù)共采集274 個(gè)授粉果實(shí)，坐果率為3.08%；對(duì)70 個(gè)果進(jìn)行取種、播種，共獲得8612 粒種子，平均每個(gè)果實(shí)123 粒種子，含飽滿、敗育2 種類型，其飽滿種子：敗育種子≈1：2.64，雜交后代單果種子數(shù)量及形態(tài)與母本沙田柚相似（圖1）。

在相同培養(yǎng)條件下對(duì)沙田柚、枳和授粉后的種子催芽，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率存在差異，但不顯著。枳發(fā)芽率最高，為94%；沙田柚次之，發(fā)芽率為92%；雜交種子發(fā)芽率最低，為81.33%。

2.2 雜交后代形態(tài)學(xué)鑒定

70 個(gè)雜交果實(shí)以單果播種的形式繁育雜種群體，雜種后代在幼苗期葉片發(fā)生顯著分離。其中28個(gè)雜交果實(shí)繁育群體的葉片均為三出復(fù)葉，共計(jì)551 株；42 個(gè)雜交果實(shí)繁育群體的葉片均為單身復(fù)葉，共計(jì)1279 株。三出復(fù)葉、單身復(fù)葉2 種株系在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葉片表型表現(xiàn)穩(wěn)定，僅有部分三出復(fù)葉單株的少量葉片在幼苗期偶爾表現(xiàn)出四出復(fù)葉和五出復(fù)葉變異情況。

從三出復(fù)葉形態(tài)看，與父本枳相似，但葉片較枳大，稍長(zhǎng)；邊緣鋸齒不如枳明顯，較圓潤(rùn)；從單身復(fù)葉形態(tài)看，與母本沙田柚相似（圖2，圖3）。

2.3 雜交苗的InDel分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

用寬皮柑橘、椪柑、甜橙、金柑、枸櫞、枳、柚等不同種質(zhì)的嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，用4 對(duì)枳InDel 引物進(jìn)行篩選，其中PT-P13 無(wú)法區(qū)分枳和柚，PT-P38 無(wú)法擴(kuò)增出柚特異性條帶，PT-P51 雖然能區(qū)分枳和柚，但無(wú)法區(qū)分枳和寬皮柑橘，PT-P54 能區(qū)分枳和柚，同時(shí)能區(qū)分枳和其他柑橘種質(zhì)（圖4）。因此，使用PT-P54 對(duì)雜交后代群體進(jìn)行鑒定，其中三出復(fù)葉所有植株均擴(kuò)增出顯著的差異性條帶，單身復(fù)葉部分植株擴(kuò)增出顯著的差異性條帶（圖5）。

通過(guò)InDel 分子標(biāo)記鑒定出三出復(fù)葉單株共計(jì)551 株均為有性雜交后代，單身復(fù)葉單株共計(jì)147 株為有性雜交后代，目前共得到有性雜交后代698 株，雜種率為38.14%（表2）。

3 討論

從雜交坐果率看，僅為274/8892=3.1%，偏低。麥適秋等[21]通過(guò)人工授粉發(fā)現(xiàn)，沙田柚自花授粉坐果率僅1.99%，但人工異花授粉坐果率為22.78%～31.71%，說(shuō)明沙田柚人工異花授粉可提高產(chǎn)量；王丹等[22]通過(guò)枳砧梁平柚、晚白柚、蘆柑、宜昌橙、三寶柑、錦橙、檸檬等材料進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)柚類作母本時(shí)親合力最高，可能與其胚珠數(shù)在柑橘種質(zhì)中最多有關(guān)。本試驗(yàn)坐果率低可能與父本枳的花粉從湖南邵陽(yáng)洞口運(yùn)輸?shù)綇V西桂林陽(yáng)朔，路途較長(zhǎng)，造成花粉部分失活；也可能與后期?；ū９患延嘘P(guān)；還可能與枳與沙田柚本身的親和性有關(guān)，需進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)親和性分析。

劉繼紅等[23]認(rèn)為，枳的三葉對(duì)單葉是顯性，可以用于雜種苗的鑒定，但由于大多數(shù)枳屬植株為雜合體，該方法并非完全可靠；Toxopeus[24]研究發(fā)現(xiàn)，柚與馬蜂柑的葉片均為單身復(fù)葉，但雜交后代約有1/3為三出復(fù)葉；美國(guó)加利福尼亞州將克里邁丁橘′枳、柚橙′枳2 個(gè)雜合組合的F₁代進(jìn)行自交或相互雜交，F(xiàn)₂代出現(xiàn)部分單葉植株，而且在F₂和回交后代中都還出現(xiàn)具有單葉和三葉混合葉型植株[25]；均表明三出復(fù)葉可能為2 個(gè)互補(bǔ)的顯性基因控制；王丹等[26]發(fā)現(xiàn)柚雜交一年生幼苗植株性狀以及葉片性狀均有不同程度變異，說(shuō)明沙田柚雜種一代可以表現(xiàn)出較顯著變異。這與雜交后代部分表現(xiàn)單身復(fù)葉，以及出現(xiàn)部分四出復(fù)葉、五出復(fù)葉等特異型株系結(jié)論一致。

利用InDel 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)親本雜種苗進(jìn)行鑒定時(shí)，雜種苗中同時(shí)出現(xiàn)雙親的特異性條帶，則為雜種苗，反之則為假雜種苗。利用這一規(guī)律可以對(duì)柑橘F₁代的親子關(guān)系進(jìn)行鑒定分析，縮短育種年限。Noda 等[27]根據(jù)溫州蜜柑基因組信息開(kāi)發(fā)了61 個(gè)可用于分析溫州蜜柑雜種苗基因型的InDel 標(biāo)記，同時(shí)能作為溫州蜜柑品種以外的柑橘屬雜種標(biāo)記；Curk等[28]采用8 個(gè)InDel 標(biāo)記和96 個(gè)SNP 標(biāo)記來(lái)揭示不同酸橙和檸檬種質(zhì)的種間結(jié)構(gòu)差異，并對(duì)酸橙和檸檬種質(zhì)資源的多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和起源進(jìn)行擴(kuò)展分析。筆者在本研究中根據(jù)枳全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出4 對(duì)在父母本上具有多態(tài)性且便于擴(kuò)增與辨別條帶的InDel 標(biāo)記引物（未發(fā)表），通過(guò)對(duì)不同柑橘種質(zhì)鑒定對(duì)比，最終選定1 對(duì)適合沙田柚′枳雜交后代鑒定的引物，鑒定出后代中551 株三出復(fù)葉單株均為雜交后代，147 株單身復(fù)葉單株雖不具備父本枳的三出復(fù)葉特征，但仍為雜交后代；其余1132 株單身復(fù)葉單株可能為：（1）沙田柚′酸柚的雜交后代，由于沙田柚具自交不親和特性，果農(nóng)用酸柚花粉授粉沙田柚，可能造成酸柚花粉混入；（2）真正沙田柚′枳的雜交后代，需增加InDel 引物的篩選，提高鑒定的精度，進(jìn)行重復(fù)鑒定。

4 結(jié)論

沙田柚′枳雜交后代雖然可通過(guò)父本枳的三出復(fù)葉這一顯性遺傳性狀區(qū)別非雜交苗，但形態(tài)學(xué)鑒定有一定的局限性，單身復(fù)葉仍可能為有性雜交后代，需結(jié)合分子標(biāo)記進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定。