歐李NAC基因家族的鑒定及表達(dá)分析

關(guān)鍵詞：歐李；ChNAC基因家族；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式

中圖分類號：S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0206-17

歐李（Cerasus humilis）屬于薔薇科櫻桃屬植物[1]，作為我國特有的矮生灌木果樹資源，是實施“退耕還林”的重要樹種之一。歐李樹種適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱、耐貧瘠、耐鹽堿，對生長環(huán)境要求較低，具有短期內(nèi)速生繁殖等優(yōu)點[2]。目前，歐李在我國中西部干旱和半干旱地區(qū)以及一些退化工礦用地推廣應(yīng)用，不僅作用于改良土壤結(jié)構(gòu)，還具有一定的經(jīng)濟(jì)效益[3]。

植物在生長發(fā)育過程中會受到非生物性脅迫和生物性脅迫的危害。在長期進(jìn)化過程中，為了更好的生存，植物產(chǎn)生了一系列生理生化機(jī)制來適應(yīng)、抵御不良環(huán)境的影響[4-5]?；虮磉_(dá)調(diào)控是一種重要的防御機(jī)制[6-7]。

NAC基因家族是植物中最大的基因家族之一，且是植物所特有的基因家族[8]。NAC轉(zhuǎn)錄因子的命名取自矮牽牛（Petunia hybrida）的NAM（no apicalmeristem）基因、擬南芥（Arabidopsis thaliana）的ATAF1/ATAF2 基因、以及CUC2（cup-shaped cotyledon）基因的首字母[9]。1996 年，Souer 等[10]從矮牽牛中克隆出第一個NAC家族成員NAM。NAC基因家族參與植物的根、莖、葉、花等器官的生長發(fā)育、果實成熟、激素調(diào)控[11-14]。同時，NAC基因也參與植物激素調(diào)控，如擬南芥ATAF1、水稻OsNAP，水稻SNAC2[15- 17] 被證明參與ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；ANAC072 基因參與MeJA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，細(xì)胞分裂素、乙烯、赤霉素等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也有NAC基因的參與[13， 18-19]。NAC基因在植物抗干旱、冷害、高溫、高鹽等非生物脅迫中同樣發(fā)揮著重要作用。Tran等[20] 過表達(dá)3 個NAC 基因（ANAC019、ANAC055、ANAC072），使擬南芥的抗旱能力顯著提高。Jeong等[21]發(fā)現(xiàn)干旱處理中OsNAC10 基因在水稻根和穗中的表達(dá)量顯著提高，當(dāng)該基因過表達(dá)時，可促進(jìn)根生長，顯著提高水稻產(chǎn)量。Lu等[22]將NAC家族中的ATAF1 基因敲除后，擬南芥ataf1-1 和ataf1-2 突變體在干旱響應(yīng)試驗中的恢復(fù)率相比于野生型，提高了6 倍左右。Hao等[23]發(fā)現(xiàn)大豆中的GmNAC11 基因和GmNAC20 基因響應(yīng)冷害脅迫，基因過表達(dá)植株對低溫的耐受性顯著提高，Hegedus 等[24]在歐洲油菜中也證明NAC基因作用于冷害脅迫。Mao 等[25]將小麥中的TaNAC2 基因在擬南芥中過表達(dá)，其與對照組相比抗低溫能力顯著提高。Dong 等[26]發(fā)現(xiàn)玉米NAC家族中的NUT1 基因調(diào)控水分轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響玉米的高溫表型，而NUT1 基因表達(dá)的時空特異性有利于農(nóng)作物應(yīng)對田間水分的不斷變化，NUT1 基因可作為未來農(nóng)作物抗高溫脅迫的重要標(biāo)靶。梁曉慶[27]對番茄進(jìn)行高溫脅迫，結(jié)果表明抑制SINAC1 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株相比于正常植株抗高溫能力顯著降低，即證明SINAC1 基因正向調(diào)控番茄對高溫的抗性。Li 等[28]在擬南芥和大豆毛狀根中過表達(dá)GmNAC06 基因，植株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，表明GmNAC06 基因在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。Zheng等[29]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)OsNAC45 基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性。近年來，NAC基因家族在病害、蟲害等生物性脅迫方面的研究也取得重要成果[30-36]。

基于已發(fā)表的歐李全基因組數(shù)據(jù)，筆者在本研究中采用生物信息學(xué)分析方法，對歐李NAC基因家族進(jìn)行鑒定，并對其家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、共線性、啟動子進(jìn)行分析。同時，對不同脅迫處理下ChNAC基因成員的表達(dá)量進(jìn)行分析，旨在挖掘脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵ChNAC基因，為歐李抗逆品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 歐李NAC基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

歐李的全基因組數(shù)據(jù)來自Wang 等[37]的報道，從pafm（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫中獲得桃NAC基因的Hmmer文件，對歐李全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地BLAST。并結(jié)合NCBI 在線網(wǎng)站（ttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中桃、扁桃等相近物種的NAC序列對歐李的NAC基因進(jìn)行補(bǔ)充、完善并剔除重復(fù)。利用ExPASy 網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）分析歐李NAC基因的氨基酸數(shù)量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)。利用PSORT在線網(wǎng)站（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。利用SOPMA在線網(wǎng)站（https：//prabi.ibcp.fr/htm/site/web）對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[38-39]。

1.2 歐李NAC基因家族分類

從TAIR 在線網(wǎng)站中（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥NAC基因家族的蛋白質(zhì)序列與歐李NAC 基因家族的蛋白序列進(jìn)行比對。使用MEGA7 軟件，將Bootstrap 重復(fù)值設(shè)定為1000，其他參數(shù)均為默認(rèn)值，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[38-39]。

1.3 歐李NAC基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME 在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme）對NAC 蛋白的motif 基序進(jìn)行預(yù)測，整合NAC 蛋白的位置信息，利用Tbtools 軟件繪圖并分析[38-39]。

1.4 歐李NAC基因家族染色體定位和共線性分析

對歐李的NAC蛋白的位置信息和所處的染色體進(jìn)行編號整理。利用Tbtools軟件繪制圖表[38-39]。

1.5 歐李NAC基因家族啟動子分析

從歐李全基因組數(shù)據(jù)庫中查找各NAC轉(zhuǎn)錄因子ATG 密碼子前2000 bp 的序列，利用PlantCARE在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webTbtools/plantcare/html/）對其功能進(jìn)行預(yù)測、整理。利用Origin軟件繪制功能分布柱狀圖[38-39]。

1.6 歐李NAC基因組織特異性分析

采歐李品種農(nóng)大4 號成熟期果實、葉片、根狀莖、種仁及一年生根送往Biomarker 公司，提取各樣品的總RNA，對RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測，檢測合格后構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行Illumina HiSeq 平臺高通量測序。獲得不同組織基因的轉(zhuǎn)錄組文件后，利用注釋信息對NAC基因進(jìn)行篩選、整理。用Tbtool 軟件繪制基因表達(dá)熱圖[38-39]。

1.7 歐李NAC基因家族在脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析

以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李種質(zhì)資源圃歐李品種農(nóng)大4 號嫩枝扦插苗做材料。待扦插苗長至株高25 cm、具有10 枚葉片時，選擇根系發(fā)育旺盛的材料移至霍格蘭溶液中進(jìn)行水培。將植株分別置于加入了200 mmol·L-1 NaCl 溶液或20% PEG6000 溶液的霍格蘭溶液中，25 ℃處理48 h 作為鹽處理及干旱處理，將植株置于加入等量清水的霍格蘭溶液中，25 ℃處理48 h，作為對照。將植株置于霍格蘭溶液培養(yǎng)，分別進(jìn)行4 ℃處理48 h 做低溫處理或40 ℃處理48 h 做高溫處理，以25 ℃處理48 h，作為對照。每個處理設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)，48 h后分別在每株上采集植株中部3 枚葉片，液氮處理后送往Biomarker公司，取各樣品的總RNA，對RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測，檢測合格后構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行Illumina HiSeq 平臺高通量測序。獲得不同組織基因的轉(zhuǎn)錄組文件后，利用注釋信息對NAC基因進(jìn)行篩選、整理。最后使用Tbtools軟件繪制歐李NAC基因表達(dá)熱圖[40-42]。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李NAC基因家族的理化性質(zhì)分析

通過本地BLAST 和NCBI 網(wǎng)站與桃等相近物種進(jìn)行比對，利用NCBI預(yù)測其結(jié)構(gòu)域，共篩選得到76 條NAC 基因，根據(jù)歐李的拉丁文種名（Cerasushumilis），按照基因位置信息依次編號為ChNAC01-ChNAC76（表1）。

歐李NAC 基因的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，歐李NAC 基因中氨基酸最少的為ChNAC23 基因，僅有85 個氨基酸，其相對分子質(zhì)量為10 398.78 ku；最多的為ChNAC65 基因，有854 個氨基酸，其相對分子質(zhì)量為95 216.85 ku。55 個ChNAC 基因的氨基酸數(shù)量集中在200～400 個之間。ChNAC 蛋白的等電點值在4.28～9.63 之間，其中堿性蛋白33 個，酸性蛋白17 個，中性蛋白26 個。ChNAC蛋白多為不穩(wěn)定蛋白，僅有15 個NAC蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白。其余61 個NAC 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40 為不穩(wěn)定蛋白。ChNAC蛋白的總平均疏水指數(shù)為-0.381～-1.023，均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：ChNAC33 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；ChNAC55 蛋白定位于囊泡中；ChNAC02、ChNAC09、ChNAC11 等15 個蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中；其余ChNAC蛋白均定位于細(xì)胞核中。亞細(xì)胞定位結(jié)果的多樣性，表明ChNAC蛋白在細(xì)胞的不同部位，不同細(xì)胞器中行使不同的功能，為植物體的正常生命活動提供保障。

為進(jìn)一步明確ChNAC蛋白的空間結(jié)構(gòu)，利用在線網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/）分別對76條ChNAC蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，分析了其α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲所占的比例。其中，α-螺旋所占比例在10.85%～45.05%之間；延伸鏈所占比例在9.69%～25.27%之間；β-轉(zhuǎn)角所占比例在0～9.65%之間；無規(guī)程卷曲所占比例在38.29%～70.60%之間（表2）。

2.2 歐李NAC基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

研究利用擬南芥的NAC基因序列做對照，參考Hisako 等[8]的研究結(jié)果將ChNAC 基因分為17 個亞族。不同的亞族在功能及進(jìn)化關(guān)系上存在差異[43]。ONAC01 亞族中不含有ChNAC 基因，說明ONAC001 亞族中的擬南芥NAC 基因與ChNAC 基因無進(jìn)化關(guān)系，其余亞族中均存在數(shù)量不等的ChNAC基因。ChNAC成員數(shù)量超過10 個的有2 個亞族。ANAC001 亞族中的家族成員數(shù)量最多，有15 個家族成員。ONAC003 亞族中含有11 個家族成員。研究表明，ANAC001 亞族作用于植物的生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答過程[44]，ONAC003 亞族參與調(diào)節(jié)開花時節(jié)[45]，推測歐李NAC基因多具備以上功能。其余亞族中的成員數(shù)量均小于10 個：TIP 亞族中有8 個家族成員；NAC2 亞族和OsNAC7 亞族中均有7 個家族成員；ONAC022 亞族中有6 個家族成員；NAP 亞族中有5 個家族成員；ANAC063 亞族中有3 個家族成員；ATAF亞族，NAM亞族，SENU5 亞族，TERN亞族，ANAC011 亞族及OsNAC8 亞族中都有2 個家族成員。AtNAC3 亞族，NAC1 亞族中僅具有1 個家族成員（圖1）。

2.3 歐李NAC基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

ChNAC基因CDS片段數(shù)量在1～8 個之間，多數(shù)CDS 片段數(shù)量為3～6 個，ChNAC15、ChNAC23 基因均為一整段的CDS 序列，其中沒有內(nèi)含子插入。ChNAC65 基因由8 個CDS片段組成，CDS片段數(shù)量最多（圖2）。

使用MEME在線網(wǎng)站將Motif 值設(shè)置為20，對歐李的NAC 基因進(jìn)行顯示分析。結(jié)果表明，ChNAC 基因的Motif 數(shù)量并不完全一致。Motif1、Motif2、Motif7 出現(xiàn)的次數(shù)最多，且Motif2 總出現(xiàn)在序列的最前端，有35 個ChNAC 基因均由Motif2、Motif8、Motif4、Motif5、Motif3、Motif6、Motif1、Motif7組成，有11 個ChNAC 基因是在上述Motif 后端插入了其他一個或幾個Motif 組成，有10 個ChNAC基因是在上述基礎(chǔ)上少了一個或幾個Motif 組成，ChNAC08 基因和ChNAC23 基因都僅含有2 個Motif，Motif13 只在ChNAC26 基因中出現(xiàn)了1 次，ChNAC43 基因中的Motif11、Motif18 連續(xù)出現(xiàn)了2次（圖2）。

2.4 歐李NAC基因家族染色體分布及種內(nèi)共線性分析

利用ChNAC 基因的注釋信息和Tbtools 繪圖軟件，可以清楚直觀地了解ChNAC 基因在歐李8條染色體上的分布情況。如圖3 所示，ChNAC基因在染色體上的分布是不均勻的。第五條染色體上（Chr5）ChNAC基因的數(shù)量最多，有19 個家族成員，且多集中于染色體的前端。其次是第一條染色體（Chr1） 上，有12 個ChNAC 家族成員且分布較均勻。第三條染色體（Chr3）和第七條染色體（Chr7）上家族成員的數(shù)量是一致的，都有9 個家族成員。第四條染色體（Chr4）上家族成員數(shù)量最少，僅有4個家族成員。

為了進(jìn)一步明確ChNAC基因在染色體上的分布情況，對ChNAC基因的種內(nèi)共線性進(jìn)行了注釋和分析，結(jié)果表明（圖4），ChNAC基因家族中存在8 對共線性基因：ChNAC12- ChNAC08、ChNAC11-ChNAC49、ChNAC73-ChNAC75、ChNAC20-ChNAC01、ChNAC20-ChNAC64、ChNAC01-ChNAC64、ChNAC25-ChNAC65、ChNAC27- ChNAC66，其中ChNAC01、ChNAC20、ChNAC64 這3 條基因是互為共線性，推測以上8 對基因可能是由染色體大片段復(fù)制而成的。

2.5 歐李NAC基因啟動子分析

為便于預(yù)測ChNAC基因可能所具有的潛在功能，對ChNAC基因起始密碼子前2000 bp 的序列進(jìn)行分析，并利用繪圖軟件進(jìn)行整理并繪圖。結(jié)果如圖5 所示。ChNAC 基因順式作用元件中除了CAAT、TATA等保證基因家族進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄活動所需的組成型轉(zhuǎn)錄元件外，還含有植物激素類響應(yīng)元件：TGA-element（生長素響應(yīng)元件）、TCA-element（水楊酸響應(yīng)元件）、P-box（赤霉素響應(yīng)元件）、ABRE（脫落酸響應(yīng)元件）、TGACG-motif（茉莉酸甲酯響應(yīng)元件）；植物生長發(fā)育響應(yīng)元件：MSA-like（細(xì)胞周期響應(yīng)元件）、circadian（晝夜節(jié)律控制響應(yīng)元件）、RY-element （種子特異性響應(yīng)元件）、O2-site（玉米醇溶蛋白代謝元件）、CAT-box（分生組織的表達(dá)元件）、GCN4-motif （胚乳發(fā)育元件）、HD-Zip 1（參與柵欄葉肉細(xì)胞分化的元素元件）；結(jié)合位點MBS（MYB結(jié)合位點元件）、HD-Zip 3（蛋白質(zhì)結(jié)合位點元件）、Box 4（光響應(yīng)元件）、LTR（低溫脅迫響應(yīng)元件）、ARE（厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件）、TC-rich repeats（參與防御和應(yīng)激反應(yīng)響應(yīng)元件）等。其中，占比較大的是組成型轉(zhuǎn)錄元件、植物激素類響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件。

2.6 歐李NAC基因組織特異性分析

歐李農(nóng)大4 號不同組織中，ChNAC基因的表達(dá)量存在差異（圖6）。ChNAC01、ChNAC07、ChNAC08等16 個基因在果實中的表達(dá)量最高，且ChNAC07基因僅在果實中表達(dá)；ChNAC50、ChNAC53、ChNAC63 等15 個基因在葉片中的表達(dá)量最高，且ChNAC13、ChNAC53、ChNAC63 基因僅在葉片中表達(dá)；ChNAC17、ChNAC66、ChNAC62 等15 個基因在根狀莖中表達(dá)量最高，且ChNAC17、ChNAC59、ChNAC68 基因僅在根狀莖中表達(dá)；ChNAC15、ChNAC46 等16 個基因在真根中的表達(dá)量最高；ChNAC36、ChNAC37 等10個基因在種仁中的表達(dá)量最高。ChNAC23、ChNAC45、ChNAC47、ChNAC54 這4 個基因在上述組織中均不表達(dá)，推測其可能在花或其他器官中表達(dá)。ChNAC基因表達(dá)量在不同組織中存在差異，表明不同的ChNAC基因調(diào)控不同組織的生長發(fā)育，即ChNAC基因的功能存在多樣性，具有不同的生物學(xué)作用，ChNAC基因在歐李的生長發(fā)育中發(fā)揮著巨大作用。

2.7 歐李NAC基因在非生物脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析

對60 個ChNAC 基因在脅迫中的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明（ 圖7）：在鹽脅迫中，ChNAC15、ChNAC65、ChNAC74 等40 個基因的表達(dá)量上調(diào)，ChNAC24、ChNAC26、ChNAC27 等14 個基因的表達(dá)量下降，ChNAC36、ChNAC37、ChNAC39 等6 個基因的表達(dá)量處理前后均差距不大；在模擬干旱脅迫中ChNAC01、ChNAC03、ChNAC18 等38 個基因的表達(dá)量上調(diào)，ChNAC24、ChNAC11、ChNAC13 等13 個基因的表達(dá)量下降，ChNAC09、ChNAC10、ChNAC34 等9 個基因的表達(dá)量處理前后差距不大；在高溫脅迫中，ChNAC08、ChNAC09、ChNAC10 等38 個基因的表達(dá)量上調(diào)，ChNAC01、ChNAC13、ChNAC25 等19 個基因的表達(dá)量下降。ChNAC41、ChNAC62、ChNAC63 這3 個基因的表達(dá)量處理前后差距不大；在低溫脅迫中，ChNAC24、ChNAC25、ChNAC35 等40 個基因的表達(dá)量上調(diào)，ChNAC01、ChNAC03、ChNAC13 等18 個基因的表達(dá)量下調(diào)，ChNAC15、ChNAC63 這2 個基因的表達(dá)量在處理前后差距不大。綜上，大多數(shù)NAC基因在脅迫條件下，通過正向調(diào)控來激活抗逆機(jī)制的運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)而維持植物正常的生長發(fā)育。

在脅迫處理下，一些基因的表達(dá)模式基本相似，如：ChNAC24 基因和ChNAC25 基因在低溫脅迫下均為上調(diào)表達(dá)；在鹽脅迫、模擬干旱及高溫脅迫下均下調(diào)表達(dá)。ChNAC31 基因、ChNAC32 基因和ChNAC33基因在上述4 種脅迫下表達(dá)量均上調(diào)。

ChNAC49 基因在上述脅迫下表達(dá)量均顯著升高。在鹽脅迫下，ChNAC49 基因表達(dá)量與對照組相比上調(diào)了477 倍；在模擬干旱脅迫下，ChNAC49 基因表達(dá)量與對照組相比上調(diào)了124 倍；在低溫脅迫下，ChNAC49 基因與對照組相比表達(dá)量上調(diào)了28倍。ChNAC08 基因在高溫脅迫下的表達(dá)量上調(diào)值最大，與對照組相比上調(diào)了70.6 倍。ChNAC49 基因在高溫脅迫下表達(dá)量的上調(diào)值僅次于ChNAC08 基因，與對照組相比其上調(diào)了27.95 倍。ChNAC64 基因在鹽脅迫下的表達(dá)量下降幅度最多，僅為對照組的14.29%；ChNAC17 基因在模擬干旱脅迫下表達(dá)量的下降幅度最多，僅為對照組的15.96%；ChNAC01 基因的表達(dá)量在高溫脅迫下的下降幅度最多，表達(dá)量僅為對照組的16.01%；ChNAC11 基因的表達(dá)量在高溫脅迫下的下降幅度最多，表達(dá)量僅為對照組的26.14%。說明這幾個基因在上述4 種脅迫下發(fā)揮著更重要的作用，是保證脅迫環(huán)境中植株正常生長發(fā)育的關(guān)鍵，對其表達(dá)量進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)處理，可能會獲得所需的抗性植株。

3 討論

通過生物信息學(xué)分析首次從歐李基因組中篩選出76 個NAC基因家族成員。ChNAC基因家族成員數(shù)量低于水稻（151）[8]、核桃（121）[41]、甘蔗（85）[46]、龍眼（114）[47]、西瓜（104）[48]等，高于黑麥草（72）[49]等，綜合來看，ChNAC 家族成員數(shù)量相比于其他物種較少，可能是基因組中沒有大規(guī)模的片段復(fù)制且相對保守造成的[50]。

Ooka 等[8]首次根據(jù)NAC 基因的結(jié)構(gòu)與功能將水稻和擬南芥的NAC基因家族分為17 個亞族，大多數(shù)學(xué)者多用此方法作為NAC基因家族的分類標(biāo)準(zhǔn)。筆者在本研究中以擬南芥NAC基因作為參照將ChNAC 基因家族分為17 個亞族，各亞族所包含的ChNAC家族成員數(shù)量不同，其功能也可能存在差異。Clercq 等[51]證明擬南芥NAC2 亞族基因參與植物氧化的應(yīng)激反應(yīng)。Fujiwara 等[45]認(rèn)為ONAC003亞族基因參與開花調(diào)節(jié)。依據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的同源關(guān)系，可以推測ChNAC對應(yīng)亞族中的基因可能具有相似功能。NAM亞族及NAC1 亞族中的擬南芥基因，被證明與擬南芥的形態(tài)發(fā)生有關(guān)[52]，由此推測ChNAC52 基因、ChNAC62 基因、ChNAC68 基因中的一種或者幾種，可能作用于歐李的形態(tài)發(fā)生過程中。ATAF、AtNAC3 亞族參與擬南芥的應(yīng)激反應(yīng)[53]，與其同源性高的ChNAC基因，可能在歐李的抗旱、抗鹽堿方面發(fā)揮著重要的作用。

啟動子是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，多數(shù)位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點的上游，關(guān)系到基因的時空表達(dá)，是基因的開關(guān)，影響基因的表達(dá)程度。對啟動子元件進(jìn)行分析，可以推測其潛在功能[54- 58]。ChNAC68、ChNAC72、ChNAC76 等基因存在種子特異性作用元件，推測其可能在歐李種子胚乳的發(fā)育中具有重要作用；ChNAC03、ChNAC05 等基因存在胚乳表達(dá)元件，提示這些基因可能作用于種子表達(dá)或者種子萌發(fā)時期；ChNAC04、ChNAC05、ChNAC06 等基因含有分生組織表達(dá)的相關(guān)作用元件，其可能作用于植物分生組織的形成；ChNAC03、ChNAC72 等基因的作用元件表明其可能誘導(dǎo)參與柵欄葉肉細(xì)胞分化的元素形成；O2-site 是一種代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控有關(guān)的作用元件，ChNAC03、ChNAC04、ChNAC05 等基因存在這種啟動子元件說明這些基因可能參與玉米醇溶蛋白代謝途徑；ChNAC基因的啟動子中含有許多響應(yīng)激素調(diào)控的作用元件（TGA-elemet 響應(yīng)生長素調(diào)控，P-box響應(yīng)赤霉素調(diào)控，TCA-elemet 響應(yīng)水楊酸調(diào)控，ABRE 響應(yīng)脫落酸調(diào)控，TGACG-motif 響應(yīng)茉莉酸甲酯調(diào)控）防御基因和應(yīng)激反應(yīng)作用元件提示基因在應(yīng)對脅迫方面有重大作用，如ChNAC03、ChNAC04、ChNAC05 等基因。啟動子分析結(jié)果表明ChNAC基因家族作用于歐李的生長、發(fā)育、組織分化、抗逆等多個方面，這與其他物種中NAC基因家族的研究結(jié)果相一致[59-61]。

當(dāng)植物感受到外界刺激時，通過信號傳導(dǎo)途徑傳遞給脅迫應(yīng)答因子，從而激活植物的抗逆反應(yīng)，減少植物受到的損傷，NAC基因在這個過程中扮演著重要角色。鹽脅迫被認(rèn)為是一種滲透脅迫[62]，有學(xué)者認(rèn)為，NAC基因在鹽脅迫時作用于植物ABA、乙烯、GA等代謝途徑，促進(jìn)這些激素的合成，從而提高植物的抗鹽性[63-64]；也有學(xué)者認(rèn)為，鹽脅迫時可通過NA+、K+離子的改變，或可溶性糖、游離脯氨酸等低分子滲透調(diào)節(jié)物的增加來維持體內(nèi)的滲透壓，進(jìn)而抵御鹽脅迫，維持植物正常生長發(fā)育[65-66]。后續(xù)可對鹽脅迫下歐李NAC轉(zhuǎn)基因植株中上述物質(zhì)的含量進(jìn)行測定，進(jìn)而來驗證這一猜想。溫度脅迫時，NAC基因主要通過調(diào)節(jié)溫度應(yīng)激基因啟動子的表達(dá)及合成，進(jìn)而來激發(fā)植物的抗逆機(jī)制的運(yùn)作[67-68]。干旱脅迫時，一類NAC轉(zhuǎn)錄因子與MYC-like 元件結(jié)合，在脅迫應(yīng)答中起作用[20]，另一類NAC基因[69]主要在氣孔的保衛(wèi)組織中表達(dá)，當(dāng)植物感受到外界刺激時，會促進(jìn)氣孔關(guān)閉，從而使植株的抗旱性提高。Wang 等[70]在擬南芥中對ChNAC06 基因過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在干旱脅迫下表達(dá)量升高，根系中ABA敏感性升高，抗干旱能力顯著提高。筆者在干旱脅迫下所獲得的結(jié)果與之相一致。尤其是ChNAC49 基因，在鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫下的表達(dá)量上調(diào)幅度均最大，在高溫脅迫下的表達(dá)量上調(diào)幅度僅次于ChNAC08 基因。推測其可能在更多的脅迫下同樣發(fā)揮著重要的作用，對歐李的抗性研究可能是一種“關(guān)鍵基因”。且該基因在葉片、根狀莖、根中均表達(dá)。可對該基因進(jìn)行基因過表達(dá)處理，獲得轉(zhuǎn)基因植物，以期挖掘出ChNAC 基因家族更多的潛在功能，為歐李抗性植株的培育做貢獻(xiàn)，也可根據(jù)不同品種ChNAC基因家族的表達(dá)量，初步篩選出具有特殊抗性的歐李品種。

4 結(jié)論

筆者在本研究中首次鑒定并分析了76 個歐李NAC 基因家族成員，明確了脅迫條件下各ChNAC基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)ChNAC49 基因在各脅迫處理下表達(dá)量的變化幅度顯著高于其他基因，后期可對ChNAC49 基因進(jìn)行克隆，培育出抗性更強(qiáng)的歐李轉(zhuǎn)基因株系，為ChNAC基因家族的功能驗證奠定了理論基礎(chǔ)。