20份紫花苜蓿種質(zhì)對黃萎病的抗性評價

摘要：為鑒定國內(nèi)主要苜蓿品種對黃萎病的抗性，本研究選取15個我國廣泛栽培的國產(chǎn)品種、3個國外品種和2個對照品種，使用人工接種病菌法進行處理，于發(fā)病期測定病情指數(shù)、生物量、株高3個表觀指標和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）等4種防御酶活性。結(jié)果表明：不同品種間的病情指數(shù)有顯著差異；與對照組相比，接菌處理后各品種的株高、地上生物量分別平均下降36.55%和67.26%；多數(shù)品種的防御酶活性有一定的提升，但變化趨勢不明顯；基于隸屬函數(shù)法計算的病情指數(shù)指標與生物量、株高和SOD酶活性指標均呈顯著相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）。綜合評價分級結(jié)果顯示，國外品種‘WL440HQ’‘阿爾岡金’‘驚喜’均為高抗，國內(nèi)品種‘敖漢’為高抗，‘中苜5號’‘北林201’‘草原3號’‘保定’‘公農(nóng)2號’‘龍牧806’為中抗。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；黃萎病；抗性鑒定；綜合評價法

中圖分類號：S602.4文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）05-1425-10

Evaluation on the Resistance of 20 Germplasms of Medicago sativa

to Verticillium Wilt

CHEN Chao-chao， LI He-yang， YAN Yu-xin， SONG Qing， HUANG You，

REZIYA·Aili， ZHANG Tie-jun

（College of Grassland Science， Beijing Forestry University， Beijing 100083，China）

Abstract：To identify the resistance of major domestic cultivars of alfalfa （Madicago sativa L.） to verticillium wilt，this study selected 15 widely used domestic cultivars，3 foreign cultivars，and 2 control cultivars in China，and used artificial verticillium wilt inoculation method as treatment. The morphological and physiological indicators were measured during the pathogenic period，such as disease infection index，biomass，plant height， activities of phenylalanine ammonia lyase （PAL） and other 3 defense enzymes. The results showed that there were significant differences in disease infection index among different cultivars. Compared with the control group，the plant height and aboveground biomass of the 20 cultivars of alfalfa decreased by 36.55% and 67.26% respectively after verticillium wilt inoculation. The activities of defense enzymes of most alfalfa cultivars increased after the inoculation，but the change trend was not obvious. Based on the membership function method，disease infection index was significantly correlated with biomass，plant height and SOD enzyme activity （Plt;0.05）. The comprehensive evaluation and grading results showed that the foreign cultivars ‘WL440HQ’‘Algonkin’ and ‘Surprise’ were all highly resistant，the domestic cultivars ‘Aohan’ highly resistant as well;the cultivars of ‘Zhongmu 5’‘Beilin 201’‘Caoyuan 3’‘Baoding’‘Gongnong 2’ and ‘Longmu 806’ medium resistant.

Key words：Alfalfa;Verticillium wilt;Resistance identification;Comprehensive evaluation method

紫花苜蓿（Madicago sativa）是一種廣泛栽培于世界各地的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，由于其具有產(chǎn)量高、適口性好、營養(yǎng)價值高、適應(yīng)性強等優(yōu)點［1-2］，被譽為“牧草之王”。2012年“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”以來，我國的苜蓿栽種面積和產(chǎn)量迅速提升。2020年，全國種植苜蓿面積54.67萬hm2，產(chǎn)量達400萬t［3-4］，其中，優(yōu)質(zhì)苜蓿160萬t。由于苜蓿尤其是高品質(zhì)苜蓿在奶業(yè)中的重要地位，苜蓿的需求量隨乳畜行業(yè)的強勢快速發(fā)展而迅速增加，出現(xiàn)了供不應(yīng)求的局面，需要大量從國外進口。2020年苜蓿草進口169.4萬t，較2019年增長6%，進口來源主要為美國［5］，占比70%，且主要進口優(yōu)級苜蓿干草［6］，優(yōu)質(zhì)苜蓿的進口量與國內(nèi)產(chǎn)量大致相當，據(jù)統(tǒng)計，未來幾年我國仍有至少120萬t的缺口。

紫花苜蓿黃萎病是一種世界性分布的毀滅性病害，由苜蓿輪枝菌（Verticillium alfalfae）引起［7］，可使苜蓿草產(chǎn)量降低15%～50%，甚至絕收，曾給北美苜蓿產(chǎn)業(yè)造成巨大損失［8］。該病菌的侵染方式有表面入侵和種子帶菌兩種［9］。黃萎病是典型的土傳病害，寄主范圍廣，防控難度極大，迄今沒有有效的化學防治方法［10］。據(jù)報道，帶菌種子播種當年，大部分植株會出現(xiàn)黃化、矮縮等癥狀，并于2～3年內(nèi)陸續(xù)死亡［11］。由于病菌可在土壤中長期生存，苜蓿黃萎病一旦發(fā)生便難以清除［12］，且發(fā)病嚴重程度隨植物年齡增加而增大［13］，造成苜蓿干草及種子嚴重減產(chǎn)，大大縮短苜蓿田地利用年限［14］，甚至影響豆科牧草的出口等，導(dǎo)致苜蓿產(chǎn)業(yè)收益降低、生產(chǎn)成本上升，對畜牧業(yè)、奶業(yè)等產(chǎn)業(yè)造成沖擊。我國最早于1996年在新疆報道發(fā)現(xiàn)苜蓿黃萎病［15］。2007年，該病菌被我國列入《進境檢疫有害生物名錄》。當前，隨著我國苜蓿進口量快速增加，苜蓿黃萎病隨苜蓿草產(chǎn)品和種子進境風險也大大增加。2001年，江蘇出入境檢疫局從一批美國進口苜蓿中檢測到苜蓿黃萎病菌［16］，2014年，甘肅張掖報道發(fā)生苜蓿黃萎病［17］，2020年，甘肅河西走廊4個地區(qū)報道黃萎病的發(fā)生［18］。研究如何有效抵御苜蓿黃萎病入侵，防止其侵染擴散，是苜蓿行業(yè)健康發(fā)展的重要保障。

在防治苜蓿黃萎病途徑當中，選育和使用抗病品種是最經(jīng)濟、安全和有效的措施［19］。美國加拿大自20世紀90年代以來，通過選育推廣抗病品種為主的一系列措施，有效控制了黃萎病發(fā)生。黃萎病抗性也是北美苜蓿品種登記時的必要鑒定指標。2016至2020年，美國登記的235個苜蓿品種中，高抗品種為197個，占比高達83.8%［20］。而當前我國苜蓿品種審定中，未強制要求開展黃萎病抗病性鑒定。1999年加拿大農(nóng)業(yè)部萊斯布里奇研究中心與中國農(nóng)科院草原所研究評價了26個我國苜蓿品種對北美黃萎病的抗病性，結(jié)果顯示25個品種為感病品種［21］。目前，我國科學家針對苜蓿黃萎病的抗病育種研究較少，多數(shù)苜蓿品種的抗病性不明，抗性育種的研究基礎(chǔ)不足。本研究選取國內(nèi)苜蓿主產(chǎn)區(qū)廣泛栽培的15個代表性紫花苜蓿品種，以及3個國外品種和2個對照材料，通過苗期人工接種的方法，進行病害觀察，于病期鑒定其形態(tài)指標和生理指標，建立以病情指數(shù)為基礎(chǔ)的綜合評價方式，對各個苜蓿品種的抗病性進行評價和分類，發(fā)掘優(yōu)異的苜蓿黃萎病抗性品種，為抗病品種的推廣種植和新品種選育提供一定參考價值。

1材料與方法

1.1材料來源

1.1.1供試苜蓿品種供試紫花苜蓿品種（材料）20個，其中15個為國內(nèi)培育的主栽品種，3個為國外培育品種，‘Oneida VR’和‘Saranac’分別為抗病和感病對照材料［22-23］。品種名稱和來源見表1。

1.1.2苜蓿黃萎病菌株供試菌株采用苜蓿輪枝孢菌株（Verticillium alfalfae），從甘肅省河西走廊地區(qū)田間苜蓿病株通過分離純化獲得。接種材料為分生孢子，用無菌水配制成濃度約為 1.0×107個·mL-1分生孢子懸浮液。發(fā)病苜蓿植株由蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院李彥忠教授課題組提供。

1.2試驗方法

1.2.1群體構(gòu)建與培養(yǎng)20個苜蓿品種，每個品種選取120粒均勻、飽滿的種子，用3%的NaClO消毒2 min，蒸餾水沖洗5次，待濾紙吸干。后將種子均勻放至墊有一層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿放置約40粒種子，每個品種放置于3個培養(yǎng)皿，重復(fù)3次。加蒸餾水使培養(yǎng)皿的濾紙吸滿水分，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕催芽。待幼根長至1～2 cm后，選取長勢良好的幼苗，移栽至裝有滅菌蛭石的長寬高均為10 cm的塑料花盆中，每個花盆15～20株，一個花盆為一個重復(fù)，每個品種重復(fù)3次。將其置于人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，設(shè)置溫度25℃，光周期16 h/8 h（光/暗），空氣濕度65%～70%，定期施用營養(yǎng)液（采用花多多一號20-20-20配置）?；ㄅ鑳?nèi)土壤含水量保持在田間持水量的60%～70%。

1.2.2病菌接種及接種后培養(yǎng)幼苗培養(yǎng)6周后，進行移栽和接種處理。使用傷根法［22］接種病菌：將植物從蛭石中取出，用清水洗凈，每個品種挑取長勢一致、健康的30個植株，使用剪刀將植株根頸以上部分（地上部分）剪至10 cm，根頸以下部分（地下部分）剪至5 cm。用橡膠皮筋將植株以5株一捆捆綁，共6捆。其中，隨機選擇3捆在分生孢子懸浮液中浸泡30 min，進行接種，作為處理組；剩余3捆在蒸餾水中浸泡30 min，作為對照。完成接菌處理后，將植株移栽至新的裝有滅菌蛭石的花盆中，每個花盆5個植株，均勻種植，施加充足的水分和基肥。

將處理組和對照組的紫花苜蓿，分別放入不同的人工氣候箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱的參數(shù)設(shè)置保持一致。培養(yǎng)箱的光周期為16 h/8 h（光/暗），溫度為（20±1）℃，濕度為 65%～80%?；ㄅ鑳?nèi)土壤含水量保持在田間持水量的60%～80%。繼續(xù)培養(yǎng)6周。

1.2.3鑒定指標測定內(nèi)容及方法接種后培養(yǎng)約6周，植株出現(xiàn)程度不一的發(fā)病狀況，此時測定病情指數(shù)、株高、生物量以及4種防御酶的活性包括植物苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、植物多酚氧化酶（Plant polyphenol oxidase，PPO）、植物超氧化物歧化酶（Plant superoxide dismutase，SOD）和植物過氧化物酶（Plant peroxidase，POD）［24］等共7項指標，對植株受脅迫的程度進行評估。

（1）病情指數(shù)

參考北美苜蓿改良大會NAAIC推薦的溫室內(nèi)黃萎病抗性評價方法［22，25］進行抗性測定（表2）。對所有植株逐一進行打分，以發(fā)病嚴重度的平均值代表該苜蓿品種的病情指數(shù)。依據(jù)公式：

（2）株高

用直尺測量所有植株地上部分高度，計算每個花盆5個苜蓿植株平均高度，計算處理組株高相比于對照組的降幅，參照公式：

（3）生物量將各品種苜蓿植株從蛭石中取出洗凈，剪去根部，保留根頸以上部分，每個花盆分別裝入牛皮紙袋，在烘箱中105℃殺青30 min后80℃烘干48 h。用天平稱重，測定每個苜蓿單株的地上生物量，計算處理組地上生物量相比于對照組的降幅，參照公式：

（4）防御酶活性對苜蓿植株上部的葉片取樣，每個品種取約0.5 g鮮重的葉片，對照組和處理組分別取樣。將樣品放入錫紙，并迅速浸入液氮中冷凍，置于-80℃冰箱保存。測定每份樣品中PAL，PPO，SOD，POD四種防御酶活性，由江蘇酶免實業(yè)有限公司采用ELISA方法測定，具體試劑盒貨號為PAL （MM-0899O2），PPO（MM-32699O2），SOD（MM-35915O2）和POD（MM-35960O2）。計算處理組酶活相比于對照組的升高值，參照公式：

1.2.4數(shù)據(jù)分析與綜合評價

2結(jié)果與分析

2.1鑒定指標差異顯著性分析

對測定的各個指標進行方差分析，F(xiàn)檢驗結(jié)果表示，黃萎病接種處理下，各個品種的3個表觀指標和4個生化指標均具有極顯著差異（Plt;0.01），具體結(jié)果參考表3。

2.2不同苜蓿品種病情指數(shù)、株高和地上生物量的差異

2.2.1病情指數(shù)分析根據(jù)紫花苜蓿生長及發(fā)病狀況，計算病情指數(shù)并分級，結(jié)果如表4所示。其中，‘Oneida VR’‘驚喜’和‘阿爾岡金’3個國外品種的病情指數(shù)為1級，表現(xiàn)為高抗。‘WL440HQ’‘北林201’‘敖漢’和‘草原3號’次之，出現(xiàn)了少量的葉片黃化癥狀，但是主干表現(xiàn)健康?！r(nóng)1號’‘中蘭2號’這2個品種，較多植株出現(xiàn)明顯的主干系統(tǒng)性黃化現(xiàn)象?！甋aranac’則表現(xiàn)出明顯的黃化、凋萎，表現(xiàn)為高感?？傮w來看，15個國內(nèi)苜蓿品種的病情指數(shù)在2.27～3.60之間，80%的品種為低抗（級別3）或中感（級別4）品種。

2.2.2黃萎病脅迫對株高的影響不同紫花苜蓿品種的株高在黃萎病脅迫條件下降幅差異較大，降幅范圍在7.36%～70.40%（表5）。其中，表現(xiàn)最好的是國產(chǎn)品種‘公農(nóng)1號’，株高與對照組相比由平均33.08 cm下降至30.65 cm，降幅僅7.36%；‘保定’‘中苜5號’‘敖漢’‘草原3號’與對照組相比降幅均在20%以內(nèi)，表現(xiàn)較好；國產(chǎn)品種‘中苜1號’‘中蘭2號’‘公農(nóng)1號’‘龍牧803’降幅均達到50%以上。4個國外品種‘Oneida VR’‘驚喜’‘阿爾岡金’‘WL440HQ’處于6～9名，降幅在23.38%～31.97%，感病對照品種‘Saranac’的降幅最大，株高由平均35.90 cm下降為10.63 cm，降幅達到70.4%，明顯高于所有其他品種。

2.2.3黃萎病脅迫對地上生物量的影響由表5可知，與對照組相比，接菌處理后各個苜蓿品種地上生物量都有極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）的下降。其中，國產(chǎn)苜蓿品種‘草原3號’‘中苜5號’‘公農(nóng)2號’降幅低于50%，表現(xiàn)較好；國外品種‘驚喜’‘WL440HQ’‘阿爾岡金’‘Oneida’的地上生物量降幅分別達到50.74%，52.03%，70.33%和76.85%。國產(chǎn)品種‘中苜1號’‘東苜2號’和‘中蘭2號’降幅均超過80%；感病對照品種‘Saranac’降幅最高，達到89.06%。

2.3防御酶活性分析在接種處理后第六周，20個紫花苜蓿品種對照組和處理組的POD，PPO，PAL和SOD酶活性用酶活力單位表示，上升幅度具體數(shù)值參考表6。多數(shù)苜蓿品種的防御酶活性在接種處理后有一定的提升，但少數(shù)品種的防御酶活性在接種處理后呈下降趨勢。其中，抗性對照‘Oneida VR’的四種防御酶活性均有較大的提升，‘驚喜’‘阿爾岡金’的三種防御酶活性呈上升趨勢，但PPO酶活性有一定程度的下降。

2.4苜蓿黃萎病抗性綜合評價

2.4.1計算隸屬函數(shù)值

2.4.2各指標相關(guān)性分析

2.4.3綜合評價分級綜合考慮隸屬函數(shù)D值總和及病情指數(shù)分析結(jié)果，分別劃定高抗（HR），中抗（MR），低感（LS），中感（MS）和高感（HS）5個等級，對于試驗的20個苜蓿品種，進行分級，并標注國內(nèi)品種占國內(nèi)品種總數(shù)量的占比，分級標準和結(jié)果如表10和表11所示。結(jié)果表明，苜蓿黃萎病高抗（HR）的品種5個，分別為‘Oneida VR’‘驚喜’‘阿爾岡金’‘WL440HQ’和‘敖漢’；中抗（MR）品種6個，分別為‘中苜5號’‘北林201’‘草原3號’‘保定’‘公農(nóng)2號’和‘龍牧806’；高感（HS）品種1個，為‘Saranac’?？傮w來看，3個國外培育品種‘驚喜’‘WL440HQ’和‘阿爾岡金’均為高抗（HR）等級；15個國內(nèi)品種中有7個品種為高抗（HR）或中抗（MR）等級，占國內(nèi)品種總數(shù)量的46.7%，8個品種為低抗（LR）或中感（MS）等級，占國內(nèi)品種總數(shù)量的53.3%。

3討論

3.1黃萎病脅迫對紫花苜蓿幼苗形態(tài)與生理特征的影響

研究表明，苜蓿黃萎病病癥的主要表現(xiàn)為整個小葉變黃并逐漸失水變干，變干的小葉常呈現(xiàn)出粉紅色或橙棕色，而且容易脫落［26］，但莖稈在長時間內(nèi)會依然保持綠色和完整［27］，小葉頂端出現(xiàn)“V”型黃變壞死斑塊［28］。本研究中，各品種苜蓿接種后出現(xiàn)程度不一的發(fā)病癥狀，未發(fā)現(xiàn)免疫品種。其中，感病對照‘Saranac’發(fā)病后呈現(xiàn)嚴重的黃化、壞死和小葉扭曲的癥狀，且僅存1～2個分蘗枝，多數(shù)植株死亡；抗病對照‘Oneida VR’接種后多數(shù)植株僅下部葉片發(fā)生黃化，表觀癥狀較輕。多數(shù)國產(chǎn)低抗品種也表現(xiàn)出明顯的典型癥狀。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，接種后的苜蓿普遍出現(xiàn)莖稈細弱、易倒伏的特點，表明黃萎病對苜蓿主干維管束造成一定損傷。

Gondran等［29］研究表明，苜蓿黃萎病會導(dǎo)致紫花苜蓿生物量急劇下降，對苜蓿干草造成極為嚴重的損失。本研究中，接種處理后，20個品種紫花苜蓿生物量均表現(xiàn)出極顯著下降（P＜0.01），平均下降67.26%。其中，抗病對照‘Oneida VR’同樣出現(xiàn)76.85%的大幅度下降，感病對照‘Saranac’降幅高達89.06%。高抗品種‘驚喜’‘WL168HQ’地上生物量分別下降50.7%和52.0%，中感品種‘中苜1號’‘中蘭2號’分別下降80.05%和84.97%。本研究結(jié)果可進一步說明黃萎病可使苜蓿嚴重減產(chǎn)。黃萎病同樣會導(dǎo)致苜蓿株高的下降，李芳［18］對30份苜蓿開展的黃萎病抗性評價研究中，有18個苜蓿品種株高顯著下降（P＜0.05）。在本研究中，所有苜蓿品種株高均呈現(xiàn)下降趨勢，平均降低36.55%。20個品種中有15個出現(xiàn)顯著或極顯著（Plt;0.05或Plt;0.01）的下降，抗性對照‘Oneida VR’降幅為29.8%，感病對照‘Saranac’降幅為70.4%，國產(chǎn)中抗品種‘公農(nóng)2號’‘保定’‘中苜5號’降幅較低，分別為7.36%，11.41%和15.84%。以生物量和株高下降程度的表現(xiàn)來看，感病對照‘Saranac’的下降幅度均最高，但抗病對照‘Oneida VR’下降幅度也相對較大，未體現(xiàn)明顯的抗病特點，這可能與試驗中處理時間、培養(yǎng)條件等有關(guān)，有待后續(xù)實驗補充證明。

感染黃萎病會加速植物的誘導(dǎo)抗病過程，其中關(guān)鍵因子就是催化反應(yīng)的酶［30］。方婷等［31］研究表明，防御酶活性是體現(xiàn)植物抗病性的重要指標，隨著植株對病菌的抵抗，防御酶活性呈明顯上升趨勢。本研究中，抗病對照‘Oneida VR’接種后POD，PPO，PAL和SOD酶活性相比對照組分別上升15.5%，4.90%，10.90% 和15.6%，感病對照‘Saranac’分別上升7.9%，-11.1%，1.30%和-1.20%，區(qū)別較明顯，但部分高抗品種的酶活性上升趨勢不明顯，如高抗品種‘驚喜’‘阿爾岡金’的PPO酶活性反而分別下降15.6%和13.6%，高抗品種‘敖漢’的PAL酶活性下降8.3%。各防御酶活性的相對變化與植物對黃萎病抗性的關(guān)系有待后續(xù)研究。本研究中，隸屬函數(shù)法計算的病情指數(shù)指標與SOD酶活性指標顯著相關(guān)（Plt;0.05），表明在本實驗條件下，SOD酶活性指標能較好地反映苜蓿對黃萎病的抗性。李芳［18］研究結(jié)果中，接種后感病品種和抗病品種的SOD酶活性都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，發(fā)病后期抗病對照酶活性的下降幅度更低，與本研究結(jié)果相似。

3.2紫花苜蓿對黃萎病抗性綜合評價指標的選擇

本研究采取綜合評價方式對紫花苜蓿的黃萎病抗性進行評價分級，綜合考慮病情指數(shù)、生長參數(shù)和生化指標，不同于僅以發(fā)病率或病情指數(shù)為標準的單一指標評價分級方法，如美國官方種子認證機構(gòu)協(xié)會（AOSCA）和全國紫花苜蓿品種評審委員會（NAVRB）報告的規(guī)定，以各苜蓿品種的發(fā)病率進行分級，gt;50%，31%～50%，15%～30%比例的植株表現(xiàn)抗性，分別對應(yīng)為高抗（HR），抗性（R）和中抗（MR）［32］。隸屬函數(shù)分析法將表征抗性的各項指標進行標準化處理，評價較為客觀［33-34］。

由于黃萎病對紫花苜蓿造成嚴重的減產(chǎn)和凋萎，因此綜合評價指標重點考慮黃萎病對苜蓿的生物量和株高的影響。為消除不同苜蓿品種本身存在的一定的產(chǎn)量和高度差異，設(shè)置對照組，將生物量和株高的指標分別設(shè)置為地上部分生物量相對降低值和株高相對降低值。同時，SOD防御酶活性與植物抗逆性關(guān)系密切［35］，本研究中這一結(jié)論也得到證實，因此將SOD酶活性指標作為綜合評價體系的組成部分。最終建立以病情指數(shù)、地上部分生物量干重相對降低值、株高相對降低值和SOD酶活性相對上升值為基礎(chǔ)的綜合評價體系。

3.3紫花苜蓿對黃萎病抗性綜合評價結(jié)果

準確評價篩選抗病苜蓿品種或種質(zhì)，是防控黃萎病的最有效、經(jīng)濟的手段。在本研究的評價分級結(jié)果中，國外標準對照品種‘Oneida VR’為高抗，而‘Saranac’表現(xiàn)出感病的特點，與NAAIC評價等級結(jié)果一致。‘阿爾岡金’‘WL440HQ’‘驚喜’三個品種為高抗，該研究結(jié)果與3個國外品種登記時對黃萎病抗性的評價結(jié)論相同。

國內(nèi)苜蓿品種對黃萎病抗性的研究中，李芳［18］使用種子接種的處理方法，基于抗病植株占比評價各品種的抗病性，認為‘中苜1號’為高抗品種，‘甘農(nóng)9號’‘甘農(nóng)3號’‘敖漢’為中抗品種，‘中苜3號’為抗性品種。而本研究中‘敖漢’為高抗品種，‘中苜5號’（‘中苜3號’的雜交親本）為中抗品種，‘甘農(nóng)9號’‘甘農(nóng)3號’為低抗品種，與其研究結(jié)果基本一致。但是，本研究認為‘中苜1號’為低感品種，與其結(jié)果不同，這可能說明，種子接種和傷根法接種病菌后，評價苜蓿對黃萎病抗性存在差異。Huang等［36］使用傷根接種法，測定‘公農(nóng)1號’抗病植株占比7.3%，‘公農(nóng)2號’占比8.9%，‘敖漢’占比7.6%，‘東苜2號’占比10.1%，均顯示出感病或低抗的特點。本研究中‘公農(nóng)1號’和‘東苜2號’分別為中感和低抗，與其結(jié)果較相近，而‘敖漢’在本研究結(jié)果為高抗，‘公農(nóng)2號’為中抗，與其結(jié)果有一定差異。楊家榮［37］通過傷根接種法，測定‘公農(nóng)2號’抗病植株比例為88.9%，呈現(xiàn)出高抗的特點，本研究‘公農(nóng)2號’為中抗；侯天爵［38］同樣使用傷根法接種，得出‘公農(nóng)1號’抗病植株僅占6.7%，呈現(xiàn)出感病或低抗的特征，本研究結(jié)果與其相一致。張園園等［12］使用蘸根接種法（未剪根），基于病情指數(shù)進行評價，得出‘公農(nóng)1號’‘中苜1號’‘中草3號’‘驚喜’‘阿爾岡金’分別為高感、中抗、中抗、高抗和高抗，本研究結(jié)果分別為中感、中感、低抗、高抗和高抗，結(jié)果相近。部分品種的抗病性與前人研究結(jié)果具有一定的差異，除本研究綜合評價的方法不同外，植株培養(yǎng)條件、接種方法、發(fā)病周期以及菌株種類等因素的不同，都可能產(chǎn)生差異。

總結(jié)而言，病情指數(shù)仍然是判斷苜蓿品種黃萎病抗性的關(guān)鍵指標。但是，為了有效消除單一指標、主觀觀察等因素造成的差異，可采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對地上生物量、株高、防御性酶活性等重要指標進行標準化處理和綜合分析?；诓煌俎Ｆ贩N的病情指數(shù)和隸屬函數(shù)D值，采用綜合評價分級方法，有助于做出更加客觀的評價結(jié)果，也可為后續(xù)抗性育種、病理和組學分析等提供一定科學參考。

4結(jié)論

在黃萎病傷根法接種的條件下，20份紫花苜蓿品種出現(xiàn)了不同程度的典型發(fā)病癥狀，病情指數(shù)范圍在1.80～4.07不等；株高平均下降36.55%，地上部分生物量平均下降67.26%。POD，SOD，PAL和PPO四種防御酶活性有一定上升趨勢，高抗苜蓿品種的防御酶活性上升幅度普遍高于感病的品種?；陔`屬函數(shù)法計算的病情指數(shù)指標與株高指標呈極顯著相關(guān)（Plt;0.01），與生物量指標和SOD酶活性指標均顯著相關(guān)（Plt;0.05），由此基于這4個指標構(gòu)建綜合評價體系。綜合評價分級結(jié)果表明，3個國外品種‘驚喜’‘阿爾岡金’‘WL440HQ’均為高抗，國內(nèi)苜蓿品種‘敖漢’為高抗，‘中苜5號’‘北林201’‘草原3號’‘保定’‘公農(nóng)2號’和‘龍牧806’為中抗。

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（責任編輯 劉婷婷）