棘孢木霉152-42誘導(dǎo)多年生黑麥草抗褐斑病的機理初探

摘要：為探究棘孢木霉（Trichoderma asperellum）誘導(dǎo)多年生黑麥草（Lolium perenne L.）抗褐斑病的機理，本研究以多年生黑麥草為材料，通過棘孢木霉和玉蜀黍絲核菌（Rhizoctonia zeae）平板對抗、盆栽多年生黑麥草木霉灌根誘導(dǎo)后接種玉蜀黍絲核菌，檢測棘孢木霉菌株152-42對玉蜀黍絲核菌引起的褐斑病的防治效果，分析其防病機理。結(jié)果表明：共培養(yǎng)7 d時棘孢木霉152-42對玉蜀黍絲核菌的抑制率達到100%；棘孢木霉152-42顯著降低了盆栽多年生黑麥草褐斑病的發(fā)病率；相較于未經(jīng)木霉誘導(dǎo)的染病葉片，木霉誘導(dǎo)處理的染病葉片超氧化物歧化酶活性顯著升高，丙二醛含量顯著降低，抗病相關(guān)基因PR-1和PR-5的表達量顯著提高。因此，棘孢木霉152-42不僅能顯著抑制玉蜀黍絲核菌生長，而且可以誘導(dǎo)多年生黑麥草通過提高抗病相關(guān)酶活性，調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達等提高抗病性，是一種極具開發(fā)潛力的草坪病害生防真菌。

關(guān)鍵詞：棘孢木霉；玉蜀黍絲核菌；多年生黑麥草；生物防治；褐斑病

中圖分類號：S543+.6文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）05-1314-08

Preliminary Study on Resistance Mechanism of Perennial Ryegrass Induced by

Trichoderma asperellum 152-42 Against Brown Patch

TANG Ruo-yi WANG Bai-sen DONG Chun-xin NIU Qi-chen YIN Shu-xia

（1. School of Grassland Science， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China; 2. School of Landscape Architecture，

Beijing Forestry University， Beijing 100083， China）

Abstract：In order to explore the resistance mechanism of perennial ryegrass （Lolium perenne L.），induced by Trichoderma asperellum strain 152-42 against to brown patch，this study used both plateco-culture test and pot infection test to check the biocontrol effects of T. asperellum strain 152-42 against perennial ryegrass brown patch caused by Rhizoctonia zeae，and further analyze the resistance mechanism. The results showed that T. asperellum 152-42 could totally inhibit the R. zeae when they co-cultured at 7 days on PDA medium. Moreover，T. asperellum 152-42 significantly reduced the incidence of brown patch to perennial ryegrass. Compared to treatments that inoculated R. zeae but non-treated with T. asperellum 152-42，the diseased leaves treated with T. asperellum 152-42 displayed a significant increment of the superoxide dismutase（SOD） activity and a significant decrease of the Malondialdehyde （MDA） content，and higher expression of disease-resistance genes PR-1 and PR-5. In conclusion，T. asperellum 152-42 was able not only to significantly inhibit the growth of R. zeae，but also induced perennial ryegrass to improve resistance against the brown patch by increasing the activity of related enzymes and regulating related genes of disease-resistance. Therefore，the T. asperellum 152-42 is an excellent potential biocontrol fungus that can be used to control turf diseases of brown patch.

Key words：Trichoderma asperellum;Rhizoctonia zeae;Perennial ryegrass;Biological control;Turf brown patch

隨著我國城市化進程和綠地面積的增加，草坪業(yè)快速發(fā)展，草坪養(yǎng)護要求不斷提高，而草坪草病害嚴重影響草坪觀賞價值與使用價值［1］。多年生黑麥草（Lolium perenne L.）是一種優(yōu)質(zhì)的冷季型草坪草，具有建坪速度快、分蘗能力強等特點，是我國北方重要的草坪草種［2］。真菌病害是多年生黑麥草生產(chǎn)與利用的主要限制因素之一［3］。玉蜀黍絲核菌（Rhizoctonia zeae）引起多年生黑麥草褐斑病，感染的葉片起初會出現(xiàn)輕微的褪綠現(xiàn)象，水浸染后出現(xiàn)白色氣生菌絲體，隨著病情的加重，受感染植株的莖基部和葉下部觀察到褐色損傷，根部褐色病變，葉子壞死［4］，嚴重影響草坪的景觀及綠化質(zhì)量［5］。目前防治草坪褐斑病的主要手段仍以化學(xué)防治為主，但化學(xué)藥劑的大量使用會引起環(huán)境污染、病原菌抗藥性提升等問題，草坪病害防治亟需探尋一條更為安全有效的途徑。

木霉（Trichoderma spp.）是重要的生物防治微生物［6］，可以通過生存競爭、抗生、重寄生、誘導(dǎo)植物抗性及促進植物生長等多種途徑減少植物病害的發(fā)生［7-9］。研究表明，木霉對許多植物病害病原菌都有防治效果，如玉蜀黍絲核菌、炭疽菌（Colletotrichum spp.）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）等［10-12］。

目前關(guān)于木霉與草坪草病原菌拮抗作用的相關(guān)報道較少。本課題組前期從草坪根際土壤中分離得到了一株對絲核菌屬真菌具有顯著拮抗作用的木霉菌株：棘孢木霉152-42［13］。但該菌株誘導(dǎo)草坪草抗病的生理分子變化尚不清楚。

本研究以棘孢木霉菌株152-42為材料，通過平板對抗試驗檢測其對玉蜀黍絲核菌的拮抗作用，通過木霉灌根誘導(dǎo)盆栽多年生黑麥草后接種玉蜀黍絲核菌，評價其對草坪褐斑病的防治效果，并檢測多年生黑麥草葉片超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalaninammo-nialyase，PAL）的含量以及抗病相關(guān)基因PR-1和PR-5的表達量，分析該菌株誘導(dǎo)多年生黑麥草抗病機理，為開發(fā)其作為生防菌劑提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

玉蜀黍絲核菌和棘孢木霉152-42來自北京林業(yè)大學(xué)草地保護實驗室保存的病原菌樣本和生防菌樣本；供試植物為多年生黑麥草‘泰綠’（Lolium perenne L. ‘Greatgreen’），種子購自北京正道種業(yè)有限公司；供試培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂葡萄糖（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖水（Potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)液。PDA培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20 g，瓊脂20 g，馬鈴薯浸粉6 g，加蒸餾水溶解并在2 L燒杯中定容至1 L，轉(zhuǎn)移至1L試劑瓶中，置于121℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌15 min。PDB培養(yǎng)液配方為：葡萄糖20 g，馬鈴薯浸粉6 g，加蒸餾水溶解并在2L燒杯中定容至1 L，分裝至250 mL錐形瓶中，每瓶分裝量為100 mL，置于121℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌15 min。

木霉孢子懸浮液制備：棘孢木霉152-42于PDA培養(yǎng)基上活化5 d后，用無菌水洗脫木霉孢子，制成木霉孢子懸浮液，以血細胞計數(shù)法確定濃度為2×10⁹cfu·mL^-1，用無菌水稀釋至其終濃度為1×10⁸ cfu·mL^-1。

病原菌菌液的制備：玉蜀黍絲核菌在PDA培養(yǎng)基上活化5 d后，選擇培養(yǎng)皿邊緣菌落取直徑9 mm的菌餅，每5個菌餅接種至一瓶100 mL的PDB培養(yǎng)基中，于25℃搖床中以150 r·min^-1的速率培養(yǎng)48 h后，用研缽將菌餅?zāi)ニ椋?00 mL無菌水制成病原菌菌劑，用無菌水稀釋100倍。

1.2試驗方法

1.2.1木霉與玉蜀黍絲核菌平板對抗試驗分別從培養(yǎng)3 d的棘孢木霉和玉蜀黍絲核菌培養(yǎng)基邊緣取直徑為9 mm的菌塊，對稱接種至PDA培養(yǎng)基兩端，以只在培養(yǎng)基的一端接種病原菌作為對照。處理重復(fù)3次，置于25℃條件下恒溫培養(yǎng)。棘孢木霉與玉蜀黍絲核菌對抗生長7 d時，測量不同處理下的病原菌菌落直徑并計算抑制率，觀察拮抗效果。

1.2.2種苗培育選取顆粒飽滿的多年生黑麥草種子，種植于含營養(yǎng)土（營養(yǎng)土∶蛭石∶沙＝1∶1∶1）的育苗缽（7 cm×7 cm×10 cm）中，每盆3 g。培養(yǎng)條件為白天28℃，夜間23℃，光照強度24 000 lx，相對濕度80%。

1.2.3多年生黑麥草處理待多年生黑麥草植株長出第3片真葉時，選取長勢均一的植株，分別進行4種處理（表1），每個處理4次重復(fù)。其中T3處理是每盆澆灌10 mL木霉孢子懸浮液進行誘導(dǎo)，10 d后接種病原菌菌液。在木霉誘導(dǎo)后10 d（接種病原菌前）和接種病原菌后7 d采集樣品用于測定分析。

1.2.4病情指數(shù)及防治效果接種病原菌后第7 d，統(tǒng)計病葉率并計算病情指數(shù)，多年生黑麥草褐斑病分級標準參考許天委等的葉部病害分類方法［14］。

1.2.5抗氧化酶活性測定稱取多年生黑麥草葉片0.1 g放入研缽中，加入液氮研磨至組織破碎后，加1.8 mL濃度為0.05 mol·L^-1，pH7.0的磷酸鹽緩沖液，研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，渦旋混合5 min，放入離心機4℃，13 000 g下離心30 min。上清液即為粗酶液，收集上清液用于抗氧化酶的活性和抗氧化物質(zhì)含量測定。超氧化物歧化酶活性采用氮藍四唑顯色法（Nitro blue tetrazolium chloride mono-hydrate，NBT）測定［15］；多酚氧化酶活性采用鄰苯二酚法測定［16］；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定［16］。苯丙氨酸解氨酶活性采用苯丙氨酸法測定［16］。

1.2.6抗病相關(guān)基因的相對表達水平測定分別采集木霉處理0 d，10 d，17 d的葉片樣品100 mg，立刻放入液氮，使用組織研磨機研磨樣品，采用Omega公司的RNA提取試劑盒提取樣品中的總RNA，使用Omega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，放于-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用實時熒光定量PCR儀進行實時定量PCR擴增。以eEF1A（s）基因為內(nèi)參，基因特異性引物見表2［17］。反應(yīng)體系和程序按照康為世紀UltraSYBR Mixture試劑操作方法進行，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)4次技術(shù)重復(fù)，采用2^-ΔΔCt方法［18］計算基因相對表達量。

1.3數(shù)據(jù)分析利用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用SPSS 25.0軟件中的單因素方差分析檢驗不同處理下盆栽試驗發(fā)病率及病情指數(shù)，采用Duncan模型分析比較不同處理間差異顯著性（Plt;0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1棘孢木霉對玉蜀黍絲核菌的抑制作用棘孢木霉152-42在PDA培養(yǎng)基上對玉蜀黍絲核菌的抑制作用如圖1所示。對峙培養(yǎng)7 d時，玉蜀黍絲核菌菌落幾乎完全被棘孢木霉152-42菌絲覆蓋，抑制率達到100%。因此，棘孢木霉152-42對玉蜀黍絲核菌具有強烈的拮抗作用。

2.2發(fā)病率與病情指數(shù)多年生黑麥草接種玉蜀黍絲核菌7 d后發(fā)病率及病情指數(shù)如圖2所示。接種病原菌7 d后，無木霉誘導(dǎo)的T1發(fā)病率為80.50%，木霉誘導(dǎo)的T3發(fā)病率為61.33%，二者具有極顯著差異（Plt;0.01）。從病情指數(shù)來看，T1病情指數(shù)為48.51，而木霉處理的T3病情指數(shù)稍低，為39.97，但二者差異不顯著。

圖3為接種病原菌后7 d的多年生黑麥草，T1大部分葉片黃化枯萎，發(fā)病狀況較嚴重，T3發(fā)病較輕。T2與CK長勢較好。T1和T3的發(fā)病狀況與發(fā)病率、病情指數(shù)相符，說明木霉處理可以有效誘導(dǎo)多年生黑麥草抗褐斑病。

2.3抗病相關(guān)酶活性變化多年生黑麥草接種病原菌前后體內(nèi)抗病相關(guān)酶活性測定結(jié)果如圖4所示。木霉誘導(dǎo)（T2和T3）10 d后，多年生黑麥草體內(nèi)MDA含量顯著低于未進行木霉誘導(dǎo)的處理（CK和T1）（Plt;0.05），說明木霉定植期間多年生黑麥草體內(nèi)MDA水平顯著降低，但PAL及PPO，SOD活性變化不大。木霉誘導(dǎo)（T2和T3）17 d后，此時T1和T3接種病原菌7 d，T3處理的SOD活性顯著高于未經(jīng)木霉誘導(dǎo)但接種病原菌的T1處理（Plt;0.05），T3的MDA含量也顯著低于T1（Plt;0.05），而T1與T3處理的PPO及PAL活性差異不顯著。

2.4多年生黑麥草體內(nèi)抗病相關(guān)基因表達量的變化

多年生黑麥草接種病原菌前后體內(nèi)抗病相關(guān)基因（PR）表達量如圖5所示。

木霉誘導(dǎo)10 d后，T2和T3處理植株體內(nèi)PR-1表達量顯著高于未經(jīng)木霉誘導(dǎo)的CK和T1處理（Plt;0.05），而PR-5表達量無明顯差異，表明木霉定植提高了多年生黑麥草PR-1表達量，對PR-5無明顯影響。接種病原菌7 d后，經(jīng)木霉152-42誘導(dǎo)處理的T3的PR-1及PR-5表達量均顯著高于未經(jīng)木霉誘導(dǎo)的T1處理（Plt;0.05），表明木霉誘導(dǎo)后，多年生黑麥草在受到病菌侵染時體內(nèi)抗病相關(guān)基因PR-1，PR-5表達量顯著升高。未經(jīng)木霉誘導(dǎo)但接種了病原菌的T1處理，7 d后PR-1，PR-5表達量與CK沒有顯著差異。

3討論

3.1棘孢木霉152-42對玉蜀黍絲核菌的拮抗作用

大量研究表明，木霉對病原菌的拮抗與其空間競爭能力、重寄生能力及抗生等能力有關(guān)［19-23］。棘孢木霉152-42與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、幣斑病菌（Clarireedia monteithiana）在平板對抗生長7 d后，兩種病原菌的菌絲生長受到強烈抑制［13］。本研究結(jié)果表明，棘孢木霉152-42對供試的玉蜀黍絲核菌同樣具有顯著抑制作用，共培養(yǎng)7 d后抑制率達到100%，說明該菌株對立枯絲核菌、幣斑病菌和玉蜀黍絲核菌均具有極強的抑制作用。

3.2棘孢木霉152-42對多年生黑麥草抗病相關(guān)酶活性的影響

當植物受到一些誘導(dǎo)因子的刺激后，天然防御機制被激活，對隨后的病原菌侵染表現(xiàn)出快速而強烈的防衛(wèi)反應(yīng)，使植物免受病原物危害或減輕危害，這種反應(yīng)稱為植物誘導(dǎo)抗病性［24］。前人研究表明，木霉可以通過誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性和局部抗性發(fā)揮間接防病作用［25］。在病原菌侵入植物組織時，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）如過氧化氫（H₂O₂）、超氧陰離子（O^2-）和羥基自由基（OH^-）［26］等抵御病原菌的入侵，這引發(fā)了許多下游過程，植物啟動動態(tài)防御反應(yīng)，通過抗毒素形成、胼胝質(zhì)沉積、細胞壁強化、次生代謝物和發(fā)病相關(guān)蛋白（PR）的合成來抑制入侵病原菌的生長［25，27-28］。ROS爆發(fā)會造成膜脂過氧化，進而產(chǎn)生丙二醛。植物體內(nèi)積累丙二醛越多，受到脅迫越嚴重［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)，接種玉蜀黍絲核菌后多年生黑麥草體內(nèi)MDA含量升高，表明病菌侵染使多年生黑麥草細胞膜脂過氧化加劇。在受到病原菌侵害后，經(jīng)棘孢木霉處理的植株MDA含量顯著低于未經(jīng)棘孢木霉處理的植株，表明木霉處理能夠在病菌侵染期抑制MDA含量的上升，降低膜脂過氧化程度。

ROS對植物損害極大，為減少ROS爆發(fā)對植物細胞造成的損傷，植物體內(nèi)抗氧化酶活性升高以清除ROS，形成適當?shù)募毎麅?nèi)平衡［31］。SOD是抵御活性氧的第一道防線，能夠清除自由基O^2-，快速將O^2-轉(zhuǎn)化為H₂O₂和O₂，保護細胞免受氧化損害［32］。許多研究均證實，木霉誘導(dǎo)后植株在病原菌侵染時SOD活性大幅度增加［33-34］。本研究也顯示，經(jīng)棘孢木霉152-42誘導(dǎo)的多年生黑麥草在受到病害脅迫時，體內(nèi)SOD活性顯著增加，且顯著高于未經(jīng)木霉處理的植株，說明病害脅迫下，經(jīng)木霉處理的植株體內(nèi)SOD活性大量增加以清除體內(nèi)ROS，穩(wěn)定植物狀態(tài)，達到有效抗病和保護細胞的雙重效果。

3.3棘孢木霉152-42對多年生黑麥草體內(nèi)抗病相關(guān)基因表達量的影響

受到病原菌攻擊時，抗病相關(guān)基因表達量通常上調(diào)，與植物抗病有密切的聯(lián)系，其在植物-真菌病原物相互作用中的重要性已經(jīng)得到證實［35-36］，PR-1基因通常被認為是植物抗病性和系統(tǒng)獲得性抗性的標志基因，PR-5是植物中有效的抗真菌蛋白基因［37-38］。大量研究表明，PR-1及PR-5能夠參與植物防御多種病原菌攻擊，與植物抗病能力息息相關(guān)［39-42］。前人研究表明，棘孢木霉能誘導(dǎo)植物上調(diào)抗病相關(guān)基因，增強對病原菌的防御能力，如在辣椒（Capsicum annuum L.）和水稻（Oryza sativa L.）中，棘孢木霉均可上調(diào)植株體內(nèi)抗病相關(guān)基因的表達量，增強了對辣椒炭疽病、水稻葉斑病的抗性［43-44］。本研究中，在受到玉蜀黍絲核菌侵染后，植株體內(nèi)PR-1，PR-5基因表達量沒有顯著變化，而經(jīng)木霉誘導(dǎo)的多年生黑麥草T3的PR-1，PR-5基因表達量較T1顯著上調(diào)，表明木霉通過增加抗病相關(guān)基因的表達量進而增強了植株的抗病能力。

4結(jié)論

來源于草坪根際的土壤棘孢木霉152-42在PDA培養(yǎng)基上對玉蜀黍絲核菌有極強的抑制作用。以棘孢木霉152-42灌根誘導(dǎo)的多年生黑麥草，在病原菌侵染后植株體內(nèi)SOD活性上升、MDA含量降低，抗病相關(guān)基因PR-1，PR-5表達量上調(diào)，草坪褐斑病發(fā)病程度明顯降低，表現(xiàn)出顯著的植物抗病性誘導(dǎo)作用。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）