紫花苜蓿胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖的研究

摘要：為在不同栽培苜蓿（Medicago sativa）品種上，建立穩(wěn)定、快速且高效的組織培養(yǎng)體系，本試驗(yàn)以品種‘游客’、‘Paola’和‘Sardi7’為研究材料，探究了苜蓿外植體、激素配比及金屬離子（Cu²⁺、Ag⁺），對(duì)其胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果。結(jié)果表明：下胚軸為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體；MS+1 mg·L^-12，4-D+0.2 mg·L^-1 KT為培養(yǎng)基時(shí)‘游客’和‘Paola’胚性愈傷誘導(dǎo)率分別為24.7%，16.7%；MS+2 mg·L^-12，4-D+0.2 mg·L^-1 KT為培養(yǎng)基時(shí)‘Sardi7’胚性愈傷誘導(dǎo)效果最佳為27.3%；1 μmol·L^-1 和5 μmol·L^-1 Cu²⁺均能顯著促進(jìn)‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’愈傷組織的誘導(dǎo)；5 μmol·L^-1 Ag⁺顯著誘導(dǎo)‘游客’和‘Paola’形成胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率分別提高25.3%，46.7%（Plt;0.05）。本研究探索了誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織的最佳外植體及其培養(yǎng)條件、金屬離子促進(jìn)不同苜蓿品種再生的作用，為突破同源四倍體栽培苜蓿品種基因型上的限制、提高胚性愈傷組織出愈率提供了思路。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；下胚軸；金屬離子；胚性愈傷；顯微觀察

中圖分類號(hào)：Q945.79文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）04-1057-07

Induction and Proliferation of Embryogenic Callus of Alfalfa

TAN Lu-na#， PENG Jia-wen#， XU Huan-yu， ZHANG Han-wen， XIA Hou-yin， MIAO Yu-qi，

CUI Yi-lin， YUAN Wang， MA Zhi-chao， TONG Yu-tao， GAO Jing-hui*

（College of Grass and Grassland， Northwest A amp; F University， Yangling， Shaanxi Province 712100， China）

Abstract：In order to establish a stable，rapid and efficient tissue culture system on different cultivated alfalfa （Medicago sativa） varieties，this experiment took the varieties ‘Tourist’‘Paola’ and ‘Sardi7’ as the research materials，investigated the effects of alfalfa explants，hormones ratio and metal ions （Cu2+，Ag+） on induction of embryonic callus. The results showed that hypocotyl was the best explants to induce callus. When MS+1 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 KT were cultured，embryogenic callus induction rates of ‘Tourist’ and ‘Paola’ were 24.7% and 16.7% respectively. And the embryogenic callus induction effect of ‘Sardi7’ was 27.3% when MS+2 mg·L^-1 2，4-D +0.2 mg·L^-1 KT were cultured. 1 μmol·L^-1 and 5 μmol·L^-1 Cu²⁺ could promote callus induction of ‘Sardi7’，‘Tourist’ and ‘Paola’ significantly. 5 μmol·L^-1 Ag⁺ significantly induced embryogenic callus of ‘Tourist’ and ‘Paola’，and the induction rates increased by 25.3% and 46.7%，respectively （Plt;0.05）. In this study，we explored the best explants to induce alfalfa callus and their culture conditions，as well as the role of metal ions in promoting regeneration of different alfalfa varieties，which provided a solution for breaking through the genotypic restriction of autotetraploid cultivated alfalfa varieties and improving the healing rate of embryonic callus.

Key words：Alfalfa （Medicago sativa）;Hypocotyl;Metal ions;Embryogenic callus;Microscopic observation

優(yōu)質(zhì)飼料草種紫花苜蓿（Medicago sativa）的遺傳轉(zhuǎn)化工作中，因組織培養(yǎng)過程中植株再生率低、轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定，嚴(yán)重制約了轉(zhuǎn)基因及相關(guān)遺傳改良工作的進(jìn)展［1］。Chen等［2］已完成了同源四倍體紫花苜?！陆笕~’的測(cè)序工作，為苜蓿的遺傳改良奠定了良好的基礎(chǔ)。因此，獲取可用于不同栽培苜蓿品種的穩(wěn)定、快速且高效的組織培養(yǎng)體系用于遺傳轉(zhuǎn)化研究，已成為當(dāng)前紫花苜蓿分子育種的重中之重。

誘導(dǎo)和增殖高質(zhì)量愈傷組織對(duì)高效紫花苜蓿組織培養(yǎng)體系的建立至關(guān)重要；其中胚性愈傷組織生長(zhǎng)較快，可通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生形成植株［3］；而非胚性愈傷組織則生長(zhǎng)緩慢，再生能力比較弱。近年來，許多學(xué)者通過探究紫花苜蓿的外植體種類和激素濃度配比，提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率并建立高效組織培養(yǎng)體系；如MS培養(yǎng)基中，2，4-D與6-BA不同配伍，可誘導(dǎo)苜蓿種子［4］、胚軸上、下段和子葉［5］形成愈傷組織。Cu²⁺參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的多種代謝反應(yīng)，是多種氧化酶的組成成分、參與植物體內(nèi)的氧化還原過程和光合作用［6］，在植物組織培養(yǎng)中起重要作用［7］；Ag+對(duì)許多單子葉和雙子葉植物形態(tài)發(fā)生具有促進(jìn)作用，作為一種乙烯抑制劑能減輕植物自身產(chǎn)生乙烯對(duì)分化的抑制作用，促進(jìn)外植體形態(tài)發(fā)生［8-10］。在小麥組培中添加10 μmol·L^-1 Cu²⁺時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率和胚性愈傷誘導(dǎo)率均顯著提高［11］；Ag⁺對(duì)甘蔗試管苗繁殖存一定的影響和應(yīng)用［12］。本試驗(yàn)以紫花苜?！慰汀淖尤~、根尖和下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，探索誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織的最佳外植體及其培養(yǎng)條件；并利用Cu2+和Ag+刺激苜蓿胚性愈傷組織形成、提高愈傷組織出愈率的可能，探索金屬離子促進(jìn)不同苜蓿品種再生的作用；以期突破紫花苜蓿再生體系效率較低的難題，達(dá)到不同品種紫花苜蓿均可通過愈傷組織培養(yǎng)再生植株的目的。

1材料和方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為紫花苜蓿品種‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’，購(gòu)置于百綠（天津）國(guó)際草業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1無(wú)菌苗培養(yǎng)取紫花苜?！慰汀N子100～150粒，在超凈工作臺(tái)內(nèi)30% NaClO浸泡消毒20 min；無(wú)菌水洗滌3次并用無(wú)菌濾紙吸干種子表面殘留水分，接種至1/2MS培養(yǎng)基（添加瓊脂12 g·L^-1、蔗糖10 g·L^-1，pH 5.7）。置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25±2℃，光照18 h /黑暗6 h，光照強(qiáng)度2 000 lx。本試驗(yàn)中后續(xù)組織培養(yǎng)的溫度和光照條件均如上所述。

1.2.2紫花苜蓿不同外植體愈傷組織的獲得取培養(yǎng)3～4 d ‘游客’無(wú)菌苗，將子葉切割成5 mm正方形小塊，下胚軸和根尖切割成5 mm長(zhǎng)小段，接種到下列4種不同激素組合，含有蔗糖30 g·L^-1和瓊脂10 g·L^-1，pH 5.8的MS培養(yǎng)基中，見表1。在方形培養(yǎng)皿中分別接種子葉、下胚軸及根3種不同外植體50個(gè)，每種激素組合處理重復(fù)3次。接種14 d后觀察愈傷組織形態(tài)，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的數(shù)量并分析結(jié)果。

1.2.3不同品種的紫花苜蓿胚性愈傷組織的獲得將紫花苜蓿品種‘Sardi7’、‘游客’和‘Paola’3個(gè)品種的下胚軸分別按照上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合培養(yǎng)基進(jìn)行外植體制備，14 d后獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置于相同激素濃度配比誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)，每14 d繼代1次，共繼代2次。繼代培養(yǎng)完成后根據(jù)愈傷組織的形態(tài)劃分為三類［13-14］：Ⅰ型為淡黃色愈傷組織，結(jié)構(gòu)松散透明、質(zhì)地較軟，鑷子觸碰容易破碎，無(wú)緊密結(jié)構(gòu)；Ⅱ型為綠色愈傷組織，表面呈現(xiàn)綠色顆粒狀，質(zhì)地緊密堅(jiān)硬，鑷子觸碰不會(huì)破碎，屬于胚性愈傷組織；Ⅲ型為褐色愈傷組織，質(zhì)地緊密，整體呈現(xiàn)干枯狀，鑷子觸碰不易破碎。

1.2.4金屬離子濃度設(shè)置根據(jù)上述愈傷組織的形態(tài)篩選出適宜誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳激素組合，并在其中分別添加不同濃度梯度的Cu²⁺、Ag⁺（表2）。將紫花苜蓿品種‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’3個(gè)品種的下胚軸在最佳激素組合培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d后獲得的愈傷組織，轉(zhuǎn)置于上述添加了金屬離子的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)完成后，統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織數(shù)量和愈傷組織數(shù)量。愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織數(shù)／接種外植體總數(shù)×100%；胚性愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)生Ⅱ型愈傷組織數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.2.5顯微觀察- HE染色法將紫花苜蓿‘游客’繼代兩次后的3種不同類型愈傷組織浸入70% FAA固定液（甲醛∶乙酸∶70%乙醇=5∶5∶90）中固定24 h，以不同濃度梯度乙醇（70%，85%，95%，100%）將固定樣品脫水后浸蠟并包埋在石蠟中，切片機(jī)切成厚度5 μm的蠟帶后制片，過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin Staining）染色并拍照觀察。

1.3數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016記錄整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8作圖。方差分析采用SPSS 23進(jìn)行，單因素ANOVA分析愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷誘導(dǎo)率，顯著性比較用Duncan’s法，多重比較采用新復(fù)極差法。

2結(jié)果與分析

2.1紫花苜蓿誘導(dǎo)愈傷組織的外植體及激素濃度配比

紫花苜蓿‘游客’不同取材部位獲得的外植體在不同激素濃度配比下的愈傷誘導(dǎo)率有顯著差異（圖1 A）。4種不同激素濃度組合下，以下胚軸為外植體時(shí)的愈傷誘導(dǎo)率均最高，激素濃度配比為Y1和Y4時(shí)差異最為顯著；Y1激素濃度配比下，下胚軸愈傷誘導(dǎo)率為66.0%，較子葉和根尖高出29.0%，45.7%（Plt;0.05）；Y4激素濃度配比下，下胚軸愈傷誘導(dǎo)率為75.8%，較子葉和根尖高出38.8%，33.9%（Plt;0.05）。Y1激素濃度配比下胚軸誘導(dǎo)形成的愈傷組織呈現(xiàn)出綠色、表面顆粒狀、質(zhì)地緊密堅(jiān)硬的形態(tài)（圖1 B，a）。在4種不同激素濃度組合下子葉和根尖均不能形成形態(tài)較好的愈傷組織：子葉為外植體形成的愈傷組織有水漬褐化現(xiàn)象，較難形成胚性愈傷組織（圖1 B，b）；根尖呈現(xiàn)水漬、透亮不緊密形態(tài)，愈傷組織較難保持良好（圖1 B，c）。以下胚軸為外植體時(shí)在激素濃度配比為Y1、Y3和Y4時(shí)愈傷誘導(dǎo)率顯著高于Y2，分別高出66.2%，75.1%，75.8%（Plt;0.05）。因此紫花苜蓿下胚軸為愈傷誘導(dǎo)的最佳外植體，適宜誘導(dǎo)的培養(yǎng)基激素濃度組合為Y1，Y3和Y4。

2.2不同激素濃度配比對(duì)不同品種紫花苜蓿胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將紫花苜蓿品種‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’3個(gè)品種下胚軸誘導(dǎo)形成的愈傷組織兩次繼代培養(yǎng)后，不同品種紫花苜蓿誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最適激素濃度配比不同（圖2）?！甋ardi7’誘導(dǎo)胚性愈傷組織最適激素濃度配比為Y3，該配方下的胚性愈傷誘導(dǎo)率為27.3%；顯著高于Y1，Y4，較Y1，Y4分別高出6.0%，16.7%（Plt;0.05）。在‘Paola’中，Y1和Y3激素濃度配比下胚性愈傷誘導(dǎo)率都較高，胚性愈傷誘導(dǎo)率為16.7%，12.7%?！慰汀T導(dǎo)胚性愈傷組織最適激素濃度為Y1，胚性愈傷誘導(dǎo)率達(dá)24.7%，顯著高于Y3，Y4下的胚性愈傷誘導(dǎo)率，分別高出了16.0%，18.3%（Plt;0.05）。

2.3金屬離子對(duì)紫花苜蓿愈傷誘導(dǎo)的作用

在培養(yǎng)基中添加Cu2+后，3個(gè)供試品種的愈傷誘導(dǎo)率均顯著增加（表3）?！甈aola’的愈傷誘導(dǎo)率在1 μmol·L^-1Cu²⁺濃度下最高，達(dá)86.7%，比對(duì)照組高20.0%（Plt;0.05）；‘游客’和‘Sardi7’的愈傷誘導(dǎo)率在5 μmol·L^-1 Cu²⁺濃度下最高，分別高達(dá)92.0%，92.7%，較對(duì)照組高出14.0%，12.0%（Plt;0.05）。添加Ag+可以顯著提高‘Paola’的愈傷誘導(dǎo)率，對(duì)‘Sardi7’、‘游客’的愈傷誘導(dǎo)無(wú)顯著影響（表3）。5 μmol·L^-1和10 μmol·L^-1 Ag+濃度下‘Paola’的愈傷誘導(dǎo)率較對(duì)照顯著提高，分別為94.7%，84.0%，較對(duì)照組分別高出28.0%，17.3%（Plt;0.05）。

添加Cu²⁺后‘Paola’‘游客’的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高，最高可達(dá)29.3%，21.3%，分別比對(duì)照組高16.6%，12.6%（Plt;0.05）；供試品種‘Sardi7’在1 μmol·L^-1和5 μmol·L^-1 Cu²⁺濃度下的胚性愈傷誘導(dǎo)率與對(duì)照組的胚性愈傷誘導(dǎo)率均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Ag+濃度可顯著提高‘Paola’、‘游客’的胚性愈傷誘導(dǎo)率，對(duì)‘Sardi7’的胚性愈傷組織誘導(dǎo)無(wú)顯著促進(jìn)作用；‘Paola’‘游客’的胚性愈傷誘導(dǎo)率在5 μmol·L^-1 Ag⁺濃度下最高，高達(dá)59.3%，34.00%，較對(duì)照組提高了46.7%，25.3%（Plt;0.05）。

2.4紫花苜蓿愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.4.1愈傷組織形態(tài)對(duì)紫花苜?！慰汀南屡咻S在兩次繼代培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，松散透明的Ⅰ型愈傷組織分散性較好，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加不容易發(fā)生褐化，但無(wú)法形成胚性組織，不能繼續(xù)分化過程；Ⅱ型致密綠色愈傷組織質(zhì)地較硬，再生性高，增殖較快；Ⅲ型褐化愈傷組織隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，逐漸喪失胚性而死亡。在Y3配方中加入金屬離子后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型紫花苜蓿愈傷組織更加緊密、表面顆粒狀增多（圖3B，3D，3F）。

2.4.2組織學(xué)特征在顯微組織細(xì)胞學(xué)上，紫花苜?！慰汀咝杂鷤M織和非胚性愈傷組織有明顯的差異（圖4）。Ⅰ型松散透明淡黃色愈傷組織的細(xì)胞排列松散，無(wú)明顯的組織結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞染色淺，較少的細(xì)胞含有細(xì)胞核（圖4A，B）；Ⅱ型致密的綠色愈傷組織細(xì)胞排列緊密，有明顯的組織樣結(jié)構(gòu)和分生中心，分化出球形胚和子葉型胚結(jié)構(gòu)（圖4 C），且細(xì)胞染色深，細(xì)胞核大（圖4D）；Ⅲ型褐色愈傷組織細(xì)胞排列雜亂，沒有明顯的組織結(jié)構(gòu)，雖然細(xì)胞染色較深，部分細(xì)胞有細(xì)核，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整（圖4E，4F）。

3討論

3.1外植體類型及激素濃度影響紫花苜蓿胚性愈傷的形成

紫花苜蓿不同植株部位內(nèi)源激素水平的差異，同一品種上的不同外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的效果存在顯著差異［15，16］，適宜外植體有助于高質(zhì)量愈傷組織的形成，保證其繼代培養(yǎng)中不定芽的形成，有利于發(fā)育成完整植株，提高組培效率［17］。本研究中采用紫花苜?！慰汀贩N子葉、下胚軸和根尖3種不同外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)上存在著顯著差異，其中以下胚軸作為外植體形成愈傷組織數(shù)量和質(zhì)量效果最佳，研究結(jié)果與趙曉倩等［18-19］的研究結(jié)果一致。

馬伶俐等［20］在MS基本培養(yǎng)基上以下胚軸為外植體，添加2 mg·L^-1 2，4-D+1 mg·L^-1 6-BA激素，誘導(dǎo)紫花苜?！兽r(nóng)4號(hào)’愈傷組織并分化成苗；紫花苜?！啻?號(hào)’以種子為外植體，在添加了40 μmol·L^-1 2，4-D和15 μmol·L^-1 6-BA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚性愈傷組織［21］?；蛐蜎Q定植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其發(fā)育，相同物種不同基因型的體細(xì)胞胚發(fā)生能力存在差異［22］，對(duì)植物激素種類和濃度敏感性響應(yīng)亦不同［23］。本試驗(yàn)中采用下胚軸為外植體，品種‘Paola’和‘游客’在激素濃度配比為2，4-D 1 mg·L^-1+ KT 0.2 mg·L^-1時(shí)胚性愈傷誘導(dǎo)效果最佳，而品種‘Sardi7’誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳激素濃度則為2，4-D 2 mg·L^-1+ KT 0.2 mg·L^-1。以紫花苜蓿葉片為外植體，2 mg·L^-1 2，4-D和0.5 mg/ KT最適于胚性愈傷的誘導(dǎo)，但也僅適用于基因型為公農(nóng)系列苜蓿品種；因不同基因型次生胚發(fā)生頻率不同，不同品種紫花苜蓿胚性愈傷組織最適激素濃度配伍存在差異［24］，因此，選擇合適的外植體類型和激素配伍，可以有效提高胚性愈傷誘導(dǎo)率。不同品種紫花苜蓿誘導(dǎo)胚性愈傷組織，需要在外植體和激素配伍間多次試驗(yàn)探索，以期獲得較好的再生植株。

3.2金屬離子促進(jìn)紫花苜蓿胚性愈傷組織誘導(dǎo)

金屬離子會(huì)對(duì)植物愈傷誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著影響［25］，Cu²⁺因其氧化還原特性能夠參與生物體內(nèi)的多種催化反應(yīng)，對(duì)生物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要［26］；Ag+作為植物生長(zhǎng)非必需元素，對(duì)器官和體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有顯著促進(jìn)作用［12］。山禾等［27］發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加15.0 μmol·L^-1的Cu²⁺，寒地粳稻‘空育131’和‘東農(nóng)425’的愈傷組織誘導(dǎo)率分別提高了8.0%和22.0%（Plt;0.01），綠苗分化率分別提高了26.4%和27.0%（Plt;0.05）；在小麥‘甘春’中添加0.5 μmol·L^-1的CuSO₄有類似效應(yīng)［28］。本試驗(yàn)研究0～5 μmol·L^-1 Cu²⁺和 0～10 μmol·L^-1 Ag⁺對(duì)紫花苜蓿愈傷誘導(dǎo)的效應(yīng)，1 μmol·L^-1和5 μmol·L^-1Cu²⁺均能顯著提高3種紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)率。棉花組培中添加5 μmol·L^-1 Ag⁺可縮短最早出愈天數(shù)，提高愈傷誘導(dǎo)率和植株再生率［25］；當(dāng)添加10 μmol·L^-1Ag⁺時(shí)，小麥‘泰山21’的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)到74.0%［29］。本實(shí)驗(yàn)中Cu2+和Ag+均不同程度促進(jìn)紫花苜蓿愈傷的誘導(dǎo)，這與后猛等［29］在小麥上的研究結(jié)果一致；其中5 μmol·L^-1 Ag+顯著提高‘Paola’和‘游客’胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。試驗(yàn)添加1 μmol·L^-1和5 μmol·L^-1 Cu²⁺促進(jìn)了紫花苜蓿愈傷誘導(dǎo)率，但對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)效果則尚需進(jìn)一步研究。

3.3金屬離子影響紫花苜蓿胚性愈傷形態(tài)

高濃度的Ag⁺通過嚴(yán)重的氧化應(yīng)激引起形態(tài)畸變和細(xì)胞膜損傷，從而對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)［30］。本研究中紫花苜蓿‘游客’3種愈傷組織形態(tài)學(xué)觀察表明，誘導(dǎo)的紫花苜蓿胚性愈傷組織具有致密的綠色顆粒狀結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞學(xué)形態(tài)上具有明顯的分生中心，并形成了球狀胚和子葉型胚的胚狀結(jié)構(gòu)，與連香樹［31］和‘鳳丹白’［32］組培上的研究結(jié)果相一致。受紫花苜?；蛐偷挠绊?，本研究添加Ag+的愈傷組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，形成的愈傷組織更加緊密、表面顆粒狀增多，說明Ag+對(duì)紫花苜蓿胚性愈傷品質(zhì)有明顯促進(jìn)作用，并可實(shí)現(xiàn)在紫花苜蓿胚性愈傷組織早期組織學(xué)形態(tài)鑒定，便于早期優(yōu)質(zhì)胚性愈傷組織的篩選。

如何突破同源四倍體栽培苜蓿品種基因型上的限制、提高胚性愈傷組織出愈率，金屬離子在胚性愈傷組織形態(tài)上的作用，也許能提供一些思路。玉米中報(bào)道了ZmSAUR15 基因參與吲哚-3-乙酸的生物合成和未成熟胚衍生愈傷組織的細(xì)胞分裂，敲除ZmSAUR15可以改善未成熟胚胎誘導(dǎo)胚性愈傷組織形成的能力，從而提高愈傷組織再生效率［33］。而金屬離子在苜蓿胚性愈傷組織誘導(dǎo)中的分子機(jī)理則有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

紫花苜?！慰汀南屡咻S作為外植體能夠很好地誘導(dǎo)愈傷組織的形成；‘游客’和‘Paola’胚性愈傷誘導(dǎo)率均較高的培養(yǎng)基為MS+1 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 KT，誘導(dǎo)率分別為24.67%，16.67%；‘Sardi7’的胚性愈傷誘導(dǎo)效果最佳的培養(yǎng)基為MS+2 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 KT，誘導(dǎo)率為27.33%；1 μmol·L^-1和5 μmol·L^-1 Cu²⁺均能促進(jìn)‘Sardi7’‘游客’和‘Paola’愈傷組織的誘導(dǎo)，其中‘Paola’的愈傷誘導(dǎo)率在1 μmol·L^-1 Cu²⁺濃度下最高，為86.7%，‘游客’和‘Sardi7’的愈傷誘導(dǎo)率在5 μmol·L^-1 Cu²⁺濃度下最高，分別為92.0%，92.7%；5 μmol·L^-1 Ag⁺顯著提高了‘游客’和‘Paola’的胚性愈傷誘導(dǎo)率，較不添加Ag⁺的對(duì)照組分別提高了25.3%，46.7%（Plt;0.05）。

參考文獻(xiàn)

［1］張婧，包愛科，柴薇薇，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展［J］. 分子植物育種，2020，18（3）：931-943

［2］CHEN H T，ZENG Y，YANG Y Z，et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly and efficient transgene-free genome editing for the autotetraploid cultivated alfalfa［J］. Nature Communications，2020，11（1）：1-11

［3］程子珊，易敏，宋才玲，等. 濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生胚性愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，43（5）：1054-1064

［4］艾婧，蔣湘寧，蓋穎.日本落葉松胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化［J/OL］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220606.1454.004.html，2022-06-07/2022-12-02

［5］王曉春，師尚禮，梁慧敏，等. 2，4-D和6-BA組合配比對(duì)金達(dá)苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2010，18（2）：219-222

［6］PRINTZ B，LUTTS S，HAUSMAN J F，et al. Copper trafficking in plants and its implication on cell wall dynamics［J］. Front Plant Sci，2016，7（601）：1-16

［7］PURNHAUSER L，GYULAI G. Effect of copper on shoot and root regeneration in wheat，triticale，rape and tobacco tissue-cultures［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1993，35（2）：131-139

［8］MOHIUDDIN A K M，CHOWDHURY M K U，ABDULLAH Z C，et al. Influence of silver nitrate （ethylene inhibitor） on cucumber in vitro shoot regeneration［J］. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1997，51（1）：75-78

［9］SONGSTAD D D，ARMSTRONG C L，PETERSEN W L. AgNO3 increases type II callus production from immature embryos of maize inbred B73 and its derivatives［J］. Plant Cell Reports，1991，9（12）：699-702

［10］SHANG F Y，NEIL E H. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants［J］. Plant Physiol，1984，35：155-189

［11］楊筱，孟亞雄，馬小樂，等. CuSO4和EDTA-Fe對(duì)小麥成熟胚再生體系的影響［J］. 分子植物育種，2016，14（3）：679-686

［12］BELLO-BELLO J J，CHAVEZ-SANTOSCOY R A，LECONA-GUZMAN C A，et al. Hormetic response by silver nanoparticles on in vitro multiplication of sugarcane（Saccharum spp. Cv. Mex 69-290） using a temporary immersion system［J］. Dose-Response，2017，15（4）：1-9

［13］李紅，李波，陳雪梅，等. 苜蓿愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀察及芽分化的研究［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（6）：49-51

［14］付麗，張東向，劉麗杰，等. 甘草外植體誘導(dǎo)愈傷組織形成條件優(yōu)化［J］. 種子，2021，40（12）：139-143，148

［15］谷蕊，蘇德畢力格，徐舶，等. 草原4號(hào)紫花苜蓿兩種再生分化途徑的建立和比較［J］. 中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2022，44（5）：114-120

［16］李波，彭丹，徐婉玉，等. 苜蓿不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)效果及其相關(guān)性分析［J］. 種子，2016，35（2）：73-75

［17］王宏霞. 美國(guó)紅楓離體培養(yǎng)外植體的篩選［J］. 現(xiàn)代園藝，2022，45（15）：30-32

［18］趙曉倩. ‘甘農(nóng)四號(hào)’紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)研究［J］. 甘肅聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，27（5）：61-63

［19］王文斌，王琳. 紫花苜蓿高效遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立［J］. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（7）：653-657

［20］馬伶俐，柳小妮，劉曉靜，等. ‘甘農(nóng)4號(hào)’紫花苜蓿組培再生體系的建立［J］. 草業(yè)科學(xué)，2008，25（12）：67-70

［21］熊麗麗，李萍，楊國(guó)柱，等. ‘青大1號(hào)’紫花苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)［J］. 青海大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，36（1）：28-33，53

［22］劉燕蓉，張萬(wàn)軍. 不同生態(tài)型的11個(gè)柳枝稷品種組織培養(yǎng)反應(yīng)評(píng)價(jià)［J］. 草地學(xué)報(bào)，2014，22（3）：579-585

［23］李代麗，康向陽(yáng). 植物愈傷組織培養(yǎng)中內(nèi)外源激素效應(yīng)的研究現(xiàn)狀與展望［J］. 生物技術(shù)通訊，2007（3）：546-548

［24］金太成，王悅，吳艷菊，等. 苜蓿次生胚遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化［J］. 分子植物育種，2019，17（20）：6685-6690

［25］張海平，邵明彥，袁淑娜，等. 幾種金屬離子對(duì)棉花愈傷誘導(dǎo)和分化成苗的影響［J］. 科技通報(bào)，2009，25（6）：765-768

［26］GARCIA-MOLINA A，MARINO G，LEHMANN M，et al. Systems biology of responses to simultaneous copper and iron deficiency in Arabidopsis［J］. Plant Journal，2020，103（6）：2119-2138

［27］山禾，鄒德堂，薩日娜，等. CuSO4和烯效唑?qū)鼐境墒炫吲囵B(yǎng)的影響［J］. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，40（1）：19-22，28

［28］楊筱. 小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化的研究［D］. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：34-37

［29］后猛，崔法，西廷業(yè)，等. 金屬離子對(duì)小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（S1）：38-42

［30］IQBAL M，RAJA N I，ALI A，et al. Silver nanoparticles and silver salt （AgNO3） elicits morphogenic and biochemical variations in callus cultures of sugarcane［J］. Iet Nanobiotechnology，2019，13（9）：896-904

［31］樊小寧，白天宇，鄔潔麗，楊敬元，姜志國(guó)，梁宏偉.連香樹體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生體系建立［J/OL］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210705.1057.008.html，2021-07-05/2022-12-02

［32］陳敏敏，楊柳燕，楊貞，等. ‘鳳丹白’成熟胚愈傷誘導(dǎo)、增殖及組織學(xué)觀察［J］. 經(jīng)濟(jì)林研究，2021，39（1）：9-16

［33］WANG Y，HE S，LONG Y，et al. Genetic variations in ZmSAUR15 contribute to the formation of immature embryo-derived embryonic calluses in maize［J］. Plant Journal，2022，109（4）：980-991

（責(zé)任編輯 彭露茜）