窄竹葉柴胡內(nèi)參基因篩選及皂苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

摘要：窄竹葉柴胡（Bupleurum marginatum var. stenophyllum）為柴胡屬多年生高大型草本植物，以根入藥稱為藏柴胡，具有較高的藥用價(jià)值。本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，利用geNorm、NormFinder及BestKeeper3種不同數(shù)據(jù)分析軟件，從5個(gè)常用的候選基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）篩選出可在窄竹葉柴胡不同器官穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參基因，并利用篩選得到的內(nèi)參基因分析皂苷合成關(guān)鍵酶基因（HMGR，IPPI，F(xiàn)PS，SS，β-AS）在窄竹葉柴胡不同器官的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明β-tubulin基因可作為窄竹葉柴胡不同器官穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因；皂苷合成關(guān)鍵酶基因在窄竹葉柴胡的不同器官中表達(dá)量有顯著差異，IPPI基因在種子中表達(dá)量最高，其他基因在根中的表達(dá)量均高于在其他器官中的表達(dá)量，其中HMGR，F(xiàn)PS，SS在側(cè)根的表達(dá)量高于主根。因此，窄竹葉柴胡各器官皂苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量不同，最適內(nèi)參基因?yàn)棣?tubulin基因，本研究為窄竹葉柴胡分子生物學(xué)研究提供一定依據(jù)，促進(jìn)其合理開發(fā)和利用。

關(guān)鍵詞：窄竹葉柴胡；內(nèi)參基因；柴胡皂苷；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S153文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）04-1001-07

Screening of Internal Reference Genes of Bupleurum marginatum var.

stenophyllum and Analysis of Gene Expression of Saikosaponin Key Enzymes

SUN Zhe DU Xiao-rong HUA Long LI Ao-xuan SONG Yun HAN Ming-zhe QIAO Yong-gang

（1.College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 2.Shanxi key lab. for modernization"of TCVM， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var. stenophyllum （Wolff） Shan et Y. Li is a perennial shrubby herb of the genus Bupleurum，with high medicinal value as the root is known as Tibetan Bupleurum. In this experiment，real-time quantitative PCR technology was used，combined with the three different data analysis softwares of the geNorm，NormFinder and BestKeeper to screen out the genes that can be stably expressed in different organs of B. marginatum var. stenophyllum from the five commonly used candidate genes：Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin and EF-1α as the internal reference genes，and then the selected internal reference genes were used to analyze the key enzyme genes of saikosaponin by the relative expression levels of HMGR，IPPI，F(xiàn)PS，SS，β-AS in different organs of B. marginatum var. stenophyllum. The results showed that β-tubulin gene could be used as an internal reference gene for its stable expression in different organs of B. marginatum var. stenophyllum;different saikosaponin synthase genes were expressed differently in different organs of B. marginatum var. stenophyllum. Except for IPPI gene which had the highest expression in seeds. The expression levels of HMGR，F(xiàn)PS，SS and β-AS in roots were higher than those in other organs，and the expression levels of HMGR，F(xiàn)PS and SS in lateral roots were higher than those in main roots. Therefore，the expression levels of key enzyme genes for saponin synthesis in different parts of B. marginatum var. stenophyllum were different. The optimal internal reference gene is β-tubulin gene，which can provide a basis for molecular biology research of B. marginatum var. stenophyllum and this research could promote its rational development and wide utilization.

Key words：Bupleurum marginatum var. stenophyllum;Internal reference gene;Saikosaponin;Real-time quantitative PCR;Expression analysis

中藥材柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根，按照產(chǎn)地和性狀等不同將其分為北柴胡和南柴胡［1］。柴胡作為國內(nèi)常見的傳統(tǒng)中藥材，對(duì)于治療感冒發(fā)燒發(fā)熱、寒熱虛實(shí)往來、月經(jīng)不調(diào)等疾病具有顯著的療效，有解表退燒、升舉陽氣、疏肝解郁的功能［2］，同時(shí)柴胡的多糖結(jié)構(gòu)具有較好的抗疲勞功效［3］。柴胡在中藥材市場上出現(xiàn)了供不應(yīng)求的狀況，近幾年來甘肅渭源等地的藥材種植戶引進(jìn)了一種名為“藏柴胡”［4］的高產(chǎn)柴胡，經(jīng)鑒定為傘形科柴胡屬植物窄竹葉柴胡（Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var. stenophyllum （Wolff） Shan et Y. Li），主要藥效成分為柴胡皂苷（saikosaponin，SS），具有抗菌消炎、抗病毒等功效［5］，含量大約為北柴胡的3～4倍，按其分子結(jié)構(gòu)的不同可分為a、b、c和d等類型，其中柴胡皂苷d的藥理活性最好，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藏柴胡的毒性大于北柴胡［6］，具有很高的研究價(jià)值。基于目前市場需求與柴胡研究進(jìn)展，下一步的研究熱點(diǎn)集中在植物化學(xué)研究與生物學(xué)發(fā)育機(jī)制分析，為柴胡資源綜合開發(fā)利用提供更好的指導(dǎo)［7］。窄竹葉柴胡相關(guān)基礎(chǔ)研究報(bào)道較少，開展窄竹葉柴胡生物學(xué)研究，對(duì)合理開發(fā)利用窄竹葉柴胡資源十分必要。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)［8］具有高效、靈敏、安全等優(yōu)勢，其結(jié)果以擴(kuò)增曲線的形式呈現(xiàn)，更加直觀［9-10］。在基因表達(dá)分析中，樣品間RNA濃度及質(zhì)量差異會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，內(nèi)參基因可以校準(zhǔn)因樣品差異造成的誤差，提高研究結(jié)果準(zhǔn)確性［11］。在研究基因表達(dá)時(shí)需要篩選在植物不同生長階段及不同器官穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，傘形科植物常用β微管蛋白（β-tubulin）、親環(huán)蛋白（Cyclophilin）、肌動(dòng)蛋白（Actin）、轉(zhuǎn)錄延伸因子（EF-1α）和α微管蛋白（α-tubulin）等作為內(nèi)參基因［12-14］。geNorm、NormFinder以及BestKeeper等軟件是常用的分析候選內(nèi)參基因軟件［15-16］。柴胡皂苷合成的上游關(guān)鍵酶基因［17］：異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IPPI）、法尼基焦磷酸合成酶（FPS）、3-羥基-甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）、β-香樹素合成酶（β-AS）和鯊烯合成酶（SS）等基因?qū)Σ窈碥盏暮铣删哂兄匾饔?，確定不同基因在柴胡不同器官的表達(dá)模式對(duì)從分子水平了解柴胡皂苷的合成具有重要意義。

本研究以窄竹葉柴胡為試驗(yàn)材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)5個(gè)候選基因（β-tubulin，Cyclophilin，Actin，EF-1α，α-tubulin）進(jìn)行表達(dá)量分析，并使用geNorm、NormFinder以及BestKeeper篩選在窄竹葉柴胡莖、葉、花、種子以及根上部、根中部、側(cè)根和須根中均可穩(wěn)定表達(dá)的最適基因。應(yīng)用篩選所得到的內(nèi)參基因，對(duì)其上游合成關(guān)鍵酶基因（HMGR，IPPI，F(xiàn)PS，SS，β-AS）在不同器官的表達(dá)量進(jìn)行分析，為柴胡皂苷合成關(guān)鍵酶基因的深入研究奠定基礎(chǔ)，為推動(dòng)窄竹葉柴胡在未來分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

窄竹葉柴胡種子來自甘肅省臨洮縣，2020年4月種植于山西省晉中市太谷區(qū)申奉試驗(yàn)田，2021年7月取窄竹葉柴胡的根、莖、葉、花、種子，用酒精棉擦拭后迅速放于液氮，于—80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋx取的窄竹葉柴胡的根上部（蘆頭）、根中部（根全長的1/2處，取1～2 cm）、側(cè)根（主根產(chǎn)生的分支）和須根（側(cè)根產(chǎn)生的毛狀分支）、莖、葉、花、種子部位如圖1所示。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1RNA的提取及cDNA的合成分別取窄竹葉柴胡的莖、葉、花、種子、根上部、根中部、側(cè)根和須根各0.2 g，使用華越洋RNA提取試劑盒（0416-50 GK型）提取各器官樣品的RNA。用Nanodrop 2000C檢測不同樣品RNA的濃度和純度并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。將所提取的RNA稀釋至同一濃度（100 ng·μL^-1）。采用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒法（AE311-03）將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2內(nèi)參基因及目的基因的引物設(shè)計(jì)窄竹葉柴胡中可以穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因還未見報(bào)道。本試驗(yàn)選取一些當(dāng)前傘形科柴胡屬植物已經(jīng)報(bào)道的5個(gè)常用的內(nèi)參基因作為候選基因［14］，篩選出5個(gè)參與柴胡皂苷合成的上游基因，根據(jù)NCBI所發(fā)表的序列利用primer5.0設(shè)計(jì)引物。候選基因與柴胡皂苷合成關(guān)鍵酶基因引物序列信息見表1。

1.2.3候選基因及目的基因特異性檢測以根上部的cDNA為模板分別對(duì)候選基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）以及參與柴胡皂苷合成的關(guān)鍵酶基因（HMGR，IPPI，F(xiàn)PS，SS，β-AS）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)候選基因及目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性分析。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序見表2。

1.2.4內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)以窄竹葉柴胡的莖、葉、花、種子以及根上部、根中部、側(cè)根和須根的cDNA為模板分別對(duì)各個(gè)候選基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）的表達(dá)水平進(jìn)行研究。采用Bio-Rad CFX-96熒光定量PCR儀進(jìn)行本試驗(yàn)，反應(yīng)體系為10 μL：Premix E×Taq 5.0 μL，上游和下游引物分別為0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。RT-qPCR反應(yīng)步驟：預(yù)變性94℃，180 s；變性94℃，10 s；退火60℃，30 s；延伸72℃，20 s，45個(gè)循環(huán)，70～95℃熔解曲線：0.5℃，5 s，信號(hào)采集。

將5個(gè)候選基因的Ct值使用EXCEL2016整理后輸入到geNorm、NormFinder和BestKeeper數(shù)據(jù)分析軟件統(tǒng)計(jì)分析表達(dá)的穩(wěn)定性。計(jì)算每個(gè)候選基因根據(jù)3款不同數(shù)據(jù)分析軟件分析所得的表達(dá)穩(wěn)定性排名的幾何平均數(shù)得到最終的排名指數(shù)，該指數(shù)越小，說明內(nèi)參基因表達(dá)量越高穩(wěn)定性越好；反之，則表達(dá)穩(wěn)定性越低［18］。

1.2.5柴胡皂苷合成關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量測定以窄竹葉柴胡的莖、葉、花、種子以及根上部、根中部、側(cè)根和須根的cDNA為模板，以篩選到的內(nèi)參基因β-tubulin為參照，對(duì)窄竹葉柴胡中柴胡皂苷合成的各主要酶基因（HMGR，IPPI，F(xiàn)PS，SS，β-AS）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，引物信息見表1，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序與“1.2.4”相同，采用2-ΔΔCt法分析計(jì)算皂苷合成關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1窄竹葉柴胡RNA提取結(jié)果

利用Nanodrop 2000C測定了待測樣品RNA的濃度和純度，結(jié)果顯示，所提取的RNA濃度均大于100 ng·μL-1，A260/280均在1.9到2.1范圍內(nèi)，且A260/230值在2.0到2.3之間，均在可用范圍之內(nèi)。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)獲取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，電泳結(jié)果顯示條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象（圖2）。因此，RNA的完整性良好，可以進(jìn)行cDNA合成及用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2候選基因與目的基因引物特異性檢驗(yàn)

通過PCR分別對(duì)窄竹葉柴胡的候選基因及參與柴胡皂苷合成的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，各個(gè)基因的擴(kuò)增條帶單一，且無重疊現(xiàn)象，沒有雜帶和引物二聚體的出現(xiàn)（圖3）。則說明合成的目的基因及候選基因的引物具有較高的特異性，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3候選基因RT-qPCR表達(dá)分析

經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析測定5個(gè)候選基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）在窄竹葉柴胡不同器官的表達(dá)Ct值，結(jié)果如圖4所示。Ct值反映了各個(gè)候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性，5個(gè)候選基因的Ct值在20～36之間，α-tubulin的Ct值為31.43～35.11，表達(dá)量最低，Actin，EF-1α基因Ct值較低，波動(dòng)較大。

僅依靠Ct值的大小無法篩選出最適內(nèi)參基因，通過geNorm、NormFinder及BestKeeper數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)各個(gè)候選基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，綜合排名取其幾何平均值，結(jié)果如表3所示，β-tubulin的綜合排名最靠前，結(jié)合Ct值數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量較高，表達(dá)穩(wěn)定性較好，可以將其選為內(nèi)參基因。

2.4柴胡皂苷合成關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量分析

以β-tubulin基因作為參照，對(duì)參與柴胡皂苷合成關(guān)鍵酶基因HMGR，IPPI，F(xiàn)PS，SS，β-AS分別在窄竹葉柴胡的莖、葉、花、種子以及根上部、根中部、側(cè)根和須根中的表達(dá)量進(jìn)行分析與測定，并利用2^-ΔΔCt方法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量如圖5所示。HMGR基因在窄竹葉柴胡的側(cè)根和須根中表達(dá)量最高，其次是根中部和根上部，在莖、葉、花和種子中表達(dá)量較低；IPPI基因在窄竹葉柴胡種子中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于其他器官；SS基因在窄竹葉柴胡不同器官中的相對(duì)表達(dá)量由高到低分別為：側(cè)根gt;須根gt;根中部gt;種子gt;根上部gt;葉gt;莖gt;花；除IPPI基因外其余基因在根中的表達(dá)量均明顯高于其他器官。由上述分析可知，在窄竹葉柴胡中，主要參與柴胡皂苷合成的酶基因在不同的器官具有穩(wěn)定的表達(dá)，它們都能參與柴胡皂苷的合成和積累，大部分基因在根中的表達(dá)量高于其他器官。

3討論

3.1內(nèi)參基因篩選

內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)至關(guān)重要，不同物種的不同器官、不同取樣時(shí)間以及經(jīng)過不同的處理之后，基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，因此需要篩選在不同條件下最適宜的內(nèi)參基因作為參照，以此來保證目的基因的穩(wěn)定表達(dá)［19］。劉艷霞等［20］篩選出在NaCl和PEG脅迫下藜和灰綠藜中均共同穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因GAPDH，β-ACTIN、β-TUBULIN分別在藜和灰綠藜中穩(wěn)定表達(dá)；蔣婷婷等［21］篩選了石蒜屬植物換錦花、石蒜和中國石蒜內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)同種植物在不同器官和不同發(fā)育時(shí)期穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因表達(dá)差異明顯，需要分別篩選；張麗麗等［22-23］也從事過相關(guān)研究。柴胡是我國常用的大宗藥材之一，主要藥用成分為柴胡皂苷，而窄竹葉柴胡的柴胡皂苷含量更高［24］，有望成為柴胡與狹葉柴胡的替代品［25］，目前對(duì)窄竹葉柴胡（藏柴胡）的研究多集中在摻偽鑒定［26-29］與化學(xué)成分的研究［30-31］，尚未有最適內(nèi)參基因的相關(guān)報(bào)道。因此開展窄竹葉柴胡最適內(nèi)參基因的篩選，研究窄竹葉柴胡不同器官的柴胡皂苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，對(duì)窄竹葉柴胡的基因功能研究至關(guān)重要。本試驗(yàn)在5個(gè)植物常用的內(nèi)參基因（Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α）中篩選出β-tubulin為最適內(nèi)參基因，該基因在窄竹葉柴胡的不同器官中均可以穩(wěn)定表達(dá)，與在同屬植物北柴胡、狹葉柴胡不同器官所篩選出的最適內(nèi)參基因一致［12，32］。

3.2皂苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)與皂苷含量

柴胡不同器官中柴胡皂苷含量不同，北柴胡根中皂苷含量最高，果和葉次之，莖中含量最少［14］；地下部分皂苷含量明顯高于地上部分，根部不同位置的皂苷含量也有明顯差異，從蘆頭到根尖含量逐漸增高，地上部分則越往上含量越低［33］；側(cè)根的皂苷含量明顯高于主根［34-35］。皂苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量與不同器官的皂苷含量密切相關(guān)，趙鈺等［14］研究柴胡皂苷含量與其關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性結(jié)果表明，HMGR，β-AS，P450-7，P450-12這4個(gè)基因的表達(dá)量與柴胡皂苷和含量均有一定的相關(guān)性，對(duì)于皂苷合成積累有重要影響，宋鑫等研究刺五加P450基因的表達(dá)對(duì)皂苷含量的影響，結(jié)果表明，7條EsP450基因的表達(dá)與皂苷含量呈正相關(guān)關(guān)系［36］。本研究選用5個(gè)皂苷合成關(guān)鍵酶上游基因（HMGR，IPPI，F(xiàn)PS，SS，β-AS）作為目的基因，測定其在窄竹葉柴胡不同器官的表達(dá)量。結(jié)果顯示HMGR，F(xiàn)PS，SS基因在根部的表達(dá)量均高于其他器官，且側(cè)根（側(cè)根和須根）的表達(dá)量高于主根（根上部和根中部），與預(yù)期結(jié)果一致。IPPI基因在種子中的表達(dá)量最高，β-AS在根上部的表達(dá)量最高，可能只是參與柴胡皂苷的合成的中間途徑，并不決定柴胡皂苷的含量。柴胡皂苷的生物合成機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)基因的表達(dá)模式可能會(huì)受環(huán)境或者其他因素的控制，其分子機(jī)制需要更加深入的研究。通過對(duì)窄竹葉柴胡內(nèi)參基因及柴胡皂苷合成關(guān)鍵酶基因的研究可以為其分子機(jī)制的研究提供參考，并為其藥材質(zhì)量的調(diào)控提供一定的依據(jù)。

4結(jié)論

本試驗(yàn)選取5個(gè)常用的候選基因Actin，α-tubulin，β-tubulin，Cyclophilin，EF-1α，并從中篩選出可在窄竹葉柴胡不同器官穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?yàn)棣?tubulin。分析皂苷合成關(guān)鍵酶基因（HMGR，IPPI，F(xiàn)PS，SS，β-AS）在窄竹葉柴胡不同器官的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)IPPI基因在種子中表達(dá)量最高，其他基因在根中的表達(dá)量較高，其中HMGR，F(xiàn)PS，SS在側(cè)根的表達(dá)量高于主根，因此，窄竹葉柴胡不同器官皂苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量不同。本研究豐富了窄竹葉柴胡的分子生物學(xué)研究，為其分子機(jī)制的研究提供參考，促進(jìn)其合理開發(fā)和利用。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）