蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)特征分析

摘要：Delta24-甾醇還原酶（Delta24-sterol reductase，DWF1）是油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroide，BR）合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵性的作用。為了研究DWF1基因在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中的功能，本試驗(yàn)從蒺藜苜蓿R108中克隆MtDWF1基因全長(zhǎng)序列，該基因開(kāi)放閱讀框（ORF）1 704 bp，編碼567個(gè)氨基酸，分子量65.911 kD，理論等電點(diǎn)為8.53。亞細(xì)胞定位顯示，該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。進(jìn)化分析表明，蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白與鷹嘴豆（Cicer arietinum）、紅三葉（Trifolium pratense）及豌豆（Pisum sativum）親緣關(guān)系較為接近。MtDWF1基因在蒺藜苜蓿根、莖、葉中均有表達(dá)，在莖和葉中的表達(dá)水平較高。外源激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）能夠明顯提高M(jìn)tDWF1表達(dá)，水楊酸（Salicylic acid，SA）能夠顯著降低MtDWF1表達(dá)水平。同時(shí)，經(jīng)油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)后，MtDWF1表達(dá)水平整體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。本研究為進(jìn)一步探索MtDWF1基因在蒺藜苜蓿發(fā)育過(guò)程中的作用提供理論研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：MtDWF1；蒺藜苜蓿；基因克?。槐磉_(dá)分析；亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）04-0984-08

Cloning，Subcellular Localization and Expression Pattern of MtDWF1 Gene in

Medicago truncatula

XIE Hong1， LI Shu-wen1， DONG Di1， WANG Meng-di JIA Wei CHAO Yue-hui ZHAO Yan

（1. School of Grassland Science， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China; 2. College of Grassland， Resources

Environment， Inner Mongolia Agricultural University， Hottot， Inner Mongolia 010018， China）

Abstract：Delta24-sterol reductase （DWF1） is a crucial enzyme in the biosynthesis of brassinosteroids and has a significant regulation on plant growth and development. To examine the function of the DWF1 gene in Medicago truncatula，the full-length sequence of the MtDWF1 gene was cloned from M. truncatula （R108）. The open reading frame of MtDWF1 was found to be 1 704 bp in length and encoded a peptide of 567 amino acids with a molecular weight of 65.911 kDa and a predicted isoelectric point of 8.53. The protein of the MtDWF1 was localized in the cytoplasm as determined by subcellular localization analysis. Evolutionary analysis indicated that the MtDWF1 protein of M. truncatula is closely related to those of Cicer arietinum，Trifolium pratense，and Pisum sativum. The MtDWF1 gene was expressed in the roots，stems，and leaves of M. truncatula，with higher expression levels observed in stems and leaves than that in roots. Exogenous application of abscisic acid （ABA） caused the MtDWF1 expression significantly increased，while salicylic acid （SA） significantly reduced. Brassinosterol （BR） treatment resulted in an overall increase of MtDWF1 expression. This study provides a foundation for further investigating on the role of the MtDWF1 gene in M. truncatula development.

Key words：MtDWF1;Medicago truncatula;Gene clone;Expression analysis;Subcellular localization

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula），豆科（Leguminosae），苜蓿屬（Medicago L.），一年生牧草植物。因其倍性?。?n=16）、基因組?。?×10⁸bp）［1］、生長(zhǎng)期短、自花授粉、結(jié)實(shí)率高及可固氮等優(yōu)良性狀，受到了越來(lái)越多研究者們的青睞［2-4］，同時(shí)也成為了研究豆科生物和基因組學(xué)方面的模式植物［5］。

油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroide，BR），是一類調(diào)控植物生長(zhǎng)的固醇類激素［6］，被稱為第六類植物激素，是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的天然植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［7］，在植物的不同器官中均存在，參與種子萌發(fā)［8］、細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂、葉片衰老以及增加抗旱、抗寒、抗病等不同逆境環(huán)境的抵抗［9］。研究發(fā)現(xiàn)，DWF基因家族與BR在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中聯(lián)系密切，很多成員都參與了BR的合成途徑［10］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［11］ 中DWF1/DIM是一個(gè)雙功能蛋白，催化24-亞甲基膽甾醇合成油菜素內(nèi)酯，在dwf1/dim突變體中，內(nèi)源BR的合成受阻其含量大量降低，造成DWF1基因的表達(dá)水平降低，從而導(dǎo)致植株生長(zhǎng)速度減緩，植株表現(xiàn)矮化現(xiàn)象。在種子萌發(fā)時(shí)，DWF4與BR合成相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致內(nèi)源BR含量增加。在DWF1蛋白序列中存在FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有FAD氧化還原酶特性。此外，DWF1在植物中的其他功能也得到了充分的研究，對(duì)甜瓜（Cucumis melo）中的DWF1基因進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)根系及葉等組織的發(fā)育［12］。在水稻（Oryza satival）中，dwf1突變體的植株矮小，生長(zhǎng)速度減緩，根、莖、葉等器官明顯變脆，同時(shí)葉片數(shù)量也較少，結(jié)實(shí)率及千粒重均比野生型有一定的降低［13］。在玉米（Zea mays）中通過(guò)RNAi技術(shù)干擾DWF1，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)受到抑制，轉(zhuǎn)基因植株變矮，同時(shí)這種抑制與植株的高度呈現(xiàn)正相關(guān)［14］。

綜上，DWF1基因在植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，然而在豆科模式植物蒺藜苜蓿中關(guān)于DWF1基因相關(guān)的研究較少。因此，本試驗(yàn)以蒺藜苜蓿為研究材料，從蒺藜苜蓿中通過(guò)克隆得到MtDWF1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位及結(jié)合qRT-PCR分析該基因的表達(dá)特征，初步探討MtDWF1的功能，為后續(xù)深入研究該基因的功能機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的野生型蒺藜苜蓿（生態(tài)型R108）種子于北京林業(yè)大學(xué)保存。蒺藜苜蓿種子經(jīng)4℃春化3 d后放置于光照16 h /25℃黑暗8 h/23℃至根系發(fā)育。然后移栽至直徑12 cm花盆中，并于25℃光照16 h/24℃黑暗8 h條件下生長(zhǎng)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTAR MAX、限制性內(nèi)切酶、pMD19-T克隆載體均來(lái)自于TAKARA公司；純化試劑盒、DNA提取試劑盒購(gòu)自于OMEGA公司；DL5000 DNA Marker購(gòu)自艾克瑞公司；熒光定量TB Green訂購(gòu)于康維公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α來(lái)自于天根公司；利福平、卡那霉素、ABA，SA和BR購(gòu)于Sigma公司，農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105為實(shí)驗(yàn)室保存。其他試劑均采自于進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)基于已經(jīng)公布的蒺藜苜蓿R108參考基因組（R108_HM340_v1.0），通過(guò)軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。其中，MtDWF1-F/R用于MtDWF1基因全長(zhǎng)的克隆，引物3302Y-MtDWF1-F/R用于構(gòu)建亞細(xì)胞定位植物表達(dá)載體構(gòu)建，引物3302Y-F和3302Y-R用于植物表達(dá)載體檢測(cè)，引物MtDWF1-RT-F/R用于MtDWF1基因熒光定量檢測(cè)，引物MtActin-F和MtActin-R用于內(nèi)參基因Actin熒光定量檢測(cè)。

1.2.2MtDWF1基因克隆取長(zhǎng)勢(shì)一致的蒺藜苜蓿健康葉片作為植物材料，將其放在盛有液氮的研缽中充分研磨，按照RNA提取試劑盒提取蒺藜苜蓿總RNA。以提取的總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得蒺藜苜蓿cDNA。以蒺藜苜蓿cDNA為模板，以DWF1-F/R為引物獲得MtDWF1基因的目的條帶。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶大小正確后，利用OMEGA純化試劑盒進(jìn)行純化操作。純化后的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T進(jìn)行連接。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，將其放在涂有氨芐抗生素的固體LB培養(yǎng)基上，挑取單菌落，使用引物M13F-47/R-48進(jìn)行菌體PCR鑒定，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選取擴(kuò)增目的條帶大小的PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3亞細(xì)胞載體構(gòu)建以含有MtDWF1克隆質(zhì)粒為模板，用3302Y-DWF1-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在50℃下使用無(wú)縫連接酶將純化后的PCR產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒產(chǎn)物進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，并將其菌液涂在含有50 mg·L-1卡那霉素的抗生素固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行挑選，將其置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)8 h，挑取生長(zhǎng)于抗生素培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增并取4 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將條帶大小符合的PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序。

1.2.4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用CaCl2凍融法將3302Y-DWF1重構(gòu)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到EHA105農(nóng)桿菌的感受態(tài)中，并將其放置冰上30 min，液氮速凍1 min，37℃水浴5 min，冰上5 min，向管中加入1 mL的LB溶液，放置在28℃培養(yǎng)箱中振蕩4 h，5 000 r·min-1，棄上清，將剩余菌液涂于含有利福平和卡那霉素抗生素的LB培養(yǎng)基上，28℃暗處理2 d后，挑取單菌落，利用引物3302Y-F和3302Y-R對(duì)菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，條帶大小符合的產(chǎn)物送至公司測(cè)序，測(cè)序后將比對(duì)正確的農(nóng)桿菌菌液加甘油保存于-80℃的冰箱中。

1.2.5亞細(xì)胞定位將構(gòu)建好的35S：：MtDWF1：GFP農(nóng)桿菌菌液加到含50 mg·L^-1的利福平和50 mg·L^-1的卡那霉素抗生素的LB溶液中，黑暗條件下在培養(yǎng)箱振蕩1～2 d后，至OD600為0.6～0.8；以健康生長(zhǎng)一個(gè)月左右的煙草為材料，用注射器將菌液注射到煙草葉片下表皮細(xì)胞中，注射后將煙草放置于人工氣候箱黑暗處理48 h，制作葉片玻片，將玻片倒置在共聚焦顯微鏡下，觀察煙草葉片中GFP熒光信號(hào)的分布情況，最終確定目的基因所在位置。

1.2.6生物信息學(xué)分析從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載MtDWF1的基因序列，將其在（https：//iris.angers.inra.fr/obh/）中與蒺藜苜蓿R108基因組序列比對(duì)，獲取MtDWF1的基因序列。同時(shí)于NCBI網(wǎng)站上對(duì)MtDWF1蛋白質(zhì)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。利用DNA MAN分析MtDWF1的開(kāi)放閱讀框及編碼氨基酸序列，用ProtPara（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量，用（https：//services.healthtech.dtu.dk/services.php？signalp-5.0）進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。利用SOPMA（https：//prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）對(duì)MtDWF1蛋白一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，Cell-PLoc網(wǎng)站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）去預(yù)測(cè)MtDWF1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。通過(guò)MEGA 11軟件構(gòu)建同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.7MtDWF1實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析選取長(zhǎng)勢(shì)一致健康的蒺藜苜蓿植株根、莖、葉三個(gè)組織，液氮速凍后，迅速放入-80℃的冰箱，對(duì)其進(jìn)行組織差異性表達(dá)分析。以李殷睿智［15］和舒思晨［16］的實(shí)驗(yàn)方法為參考，確定ABA，SA及BR濃度分別為10 μmol·L^-1，0.5 mmol·L^-1及0.1 μmol·L^-1。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的蒺藜苜蓿植株葉片，對(duì)葉表面均勻噴施1次進(jìn)行激素誘導(dǎo)，分別于噴施激素的第0，0.5，1，3，6，9，12 h這7個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)采取植株葉片組織后，立即用液氮進(jìn)行速凍。隨后將上述樣品研磨后，分別提取植物的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用引物MtActin-F和MtActin-R作為熒光定量的內(nèi)參基因，引物MtDWF1-RT-F/R按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)2—△△Ct法［17］使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8數(shù)據(jù)分析通過(guò)Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及圖標(biāo)制作，利用軟件SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1蒺藜苜蓿MtDWF1基因的克隆

以DWF1-F/R為引物對(duì)蒺藜苜蓿cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，如圖1獲得條帶清晰、條帶大小約1 700 bp，將其產(chǎn)物送至生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明所克隆的堿基序列與蒺藜苜蓿MtDWF1基因序列一致，初步表明蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆成功，將正確的克隆載體命名為pMD-MtDWF1?？捎糜诤罄m(xù)試驗(yàn)。

2.2蒺藜苜蓿MtDWF1亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)Cell-PLoc網(wǎng)站分析，推測(cè)MtDWF1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。將成功構(gòu)建的35S：：MtDWF1：GFP載體轉(zhuǎn)化煙草，黑暗培養(yǎng)48 h，使用激光聚焦顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)化后的煙草進(jìn)行觀察，捕捉激光信號(hào)。結(jié)果顯示從細(xì)胞質(zhì)捕獲到強(qiáng)烈的GFP信號(hào)（圖2）。表明MtDWF1蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中。

2.3MtDWF1基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)PCR克隆技術(shù)得到的MtDWF1基因開(kāi)放閱讀框1 704 bp，編碼567個(gè)氨基酸（圖3），利用NCBI網(wǎng)站以及Blast工具對(duì)MtDWF1進(jìn)行同源比對(duì)，對(duì)MtDWF1蛋白的保守結(jié)構(gòu)及特性進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在109～199位氨基酸之間含有FAD-binding-4結(jié)構(gòu)域（圖4），該位點(diǎn)是FAD結(jié)合位點(diǎn)，MtDWF1其分子式為C₃₀₁₈H₄₆₂₀N₇₈₈O₈₂₉S₂₂，分子總質(zhì)量65.911 kD，理論等電點(diǎn)為8.53。其正電荷殘基數(shù)量為78，負(fù)電荷殘基數(shù)量為73；不穩(wěn)定系數(shù)是36.23，經(jīng)預(yù)測(cè)，其蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖5），結(jié)果顯示，MtDWF1蛋白主要由α螺旋及無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，其分別各占二級(jí)結(jié)構(gòu)總比例的42.5%和36.33%，含有延伸鏈16.23%和β轉(zhuǎn)角4.94%。通過(guò)Signal 5.0網(wǎng)站，進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)（圖6），結(jié)果顯示，MtDWF1蛋白中不含有信號(hào)肽。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MtDWF1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。使用MEGA 11軟件對(duì)MtDWF1蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明（圖7）蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白與鷹嘴豆（Cicer arietinum）、紅三葉（Trifolium pratense）和豌豆（Pisum sativum）親緣關(guān)系較近，與蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白同源的物種大多為豆科植物。

2.4組織差異性分析

對(duì)蒺藜苜蓿根莖葉進(jìn)行熒光定量分析，檢測(cè)MtDWF1基因在根莖葉中的表達(dá)水平。結(jié)果表明MtDWF1基因在根莖葉中均有表達(dá)，在莖和葉中的表達(dá)量顯著高于根，分別是根的1.45和1.46倍。MtDWF1基因在莖和葉的表達(dá)水平相似（圖8）。

為探究激素對(duì)MtDWF1基因的作用，我們檢測(cè)了MtDWF1在ABA，SA及BR處理下0，0.5，1，3，6，9，12 h的表達(dá)水平。研究表明，ABA處理后，MtDWF1表達(dá)量與對(duì)照相比呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。0.5 h時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)，并在6 h達(dá)到頂峰，此時(shí)MtDWF1的表達(dá)量是對(duì)照的4.81倍。隨后MtDWF1表達(dá)量逐漸降低，但總體表達(dá)量高于對(duì)照（圖9）。這些數(shù)據(jù)表明，ABA可促進(jìn)MtDWF1的表達(dá)，促進(jìn)作用在短期內(nèi)較明顯。

SA誘導(dǎo)后，MtDWF1的表達(dá)量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，前6 h呈現(xiàn)急速下降趨勢(shì)，在6 h時(shí)達(dá)到最低，占對(duì)照組的4.5%，6 h之后，表達(dá)量有所回升，但是仍然低于對(duì)照組。12 h表達(dá)量占對(duì)照組的44.7%（圖10）。結(jié)果表明，MtDWF1對(duì)SA較敏感，且SA對(duì)MtDWF1的表達(dá)具有明顯的抑制作用。

BR誘導(dǎo)后，MtDWF1被快速誘導(dǎo)其表達(dá)量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在處理9 h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到峰值，其表達(dá)量是對(duì)照組的5倍（圖11）。結(jié)果表明，BR對(duì)MtDWF1的表達(dá)具有促進(jìn)作用。

3討論

DWF1基因是BR合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，能夠多次參與BR的催化合成。目前，DWF1基因已在多種植物中被研究，但在蒺藜苜蓿中DWF1方面的研究還未見(jiàn)到報(bào)道。本研究成功在蒺藜苜蓿中克隆獲得MtDWF1基因，該基因全長(zhǎng)1 704 bp，共編碼567個(gè)氨基酸。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果分析（圖8）該基因控制合成的蛋白質(zhì)與鷹嘴豆、豌豆、紅三葉等多個(gè)物種中的DWF1蛋白高度同源，其與鷹嘴豆相似度最高。DWF1蛋白含有FAD-binding-4結(jié)構(gòu)域保守區(qū)域。在已報(bào)道的擬南芥［18］、甜瓜（Cucumis melo）［12］、棉花（Gossypium hirsutum）［19］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）［20］等物種中，DWF1主要都是參與BR的催化合成過(guò)程，同時(shí)在本試驗(yàn)中我們預(yù)測(cè)的蒺藜苜蓿DWF1蛋白質(zhì)性質(zhì)與以上這些物種中的DWF1蛋白質(zhì)性質(zhì)相同。因此，我們推測(cè)MtDWF1在蒺藜苜蓿中也具有相似的功能，能夠參與蒺藜苜蓿BR的催化合成過(guò)程。

通過(guò)表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)MtDWF1在根、莖、葉組織中均有表達(dá)，說(shuō)明其廣泛存在于蒺藜苜蓿各個(gè)組織中，但其在不同的組織中的表達(dá)量具有差異性，在根中表達(dá)量最低，在葉中的表達(dá)量最高。這與DWF1基因在馬鈴薯［20］、玉米［14］和豌豆［21］的表達(dá)模式十分相似，推測(cè)DWF1基因在不同物種中可能具有相似的功能，因此可以利用在其他植物中獲得的結(jié)果，推測(cè)MtDWF1基因可能參與了蒺藜苜蓿BR的催化合成過(guò)程。植物激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色，不同激素處理對(duì)基因的響應(yīng)也存在著差異。ABA被稱為“逆境激素”［22］，在逆境脅迫下大量的脫落酸（Abscisic acid，ABA）在植物中被積累。已有研究發(fā)現(xiàn)，玉米在外源噴施ABA激素后DWF4的相對(duì)表達(dá)量升高［23］。在本研究中，MtDWF1受ABA激素誘導(dǎo)后表達(dá)量也上調(diào)，因此我們猜測(cè)，該基因表達(dá)在受到ABA誘導(dǎo)后上調(diào)，MtDWF1可能會(huì)對(duì)逆境脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，這種響應(yīng)可能是受到或部分受到ABA途徑所影響。除了ABA，MtDWF1與其他激素也存在相互作用。在SA處理后，該基因的相對(duì)表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加基因的表達(dá)量受到抑制，暗示SA可能對(duì)MtDWF1進(jìn)行負(fù)調(diào)控從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蒺藜苜蓿生長(zhǎng)的調(diào)控。Vriet等［24］發(fā)現(xiàn)，DWF1基因能夠促進(jìn)油菜素內(nèi)酯的合成，同時(shí)Best等人［25］也發(fā)現(xiàn)DWF1基因參與著B(niǎo)R和GA信號(hào)的相互作用，從而調(diào)控植物發(fā)育。在本試驗(yàn)中我們通過(guò)BR激素處理后，發(fā)現(xiàn)MtDWF1基因的表達(dá)量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這說(shuō)明在外施BR激素的條件下，其促進(jìn)了MtDWF1基因的表達(dá)，因此我們有理由猜測(cè)MtDWF1基因可能參與了蒺藜苜蓿植株的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程［20］，對(duì)植株生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。綜上所述，本研究為進(jìn)一步探究蒺藜苜蓿MtDWF1基因功能提供了幫助，但關(guān)于其在蒺藜苜蓿中的具體功能及調(diào)控機(jī)制還需深入研究。

4結(jié)論

本研究成功克隆了蒺藜苜蓿MtDWF1基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示，DWF1的開(kāi)放閱讀框1 704 bp，編碼567個(gè)氨基酸。DWF1的序列上有一個(gè)典型的氧化還原酶的FAD保守結(jié)構(gòu)域，無(wú)信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位顯示該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。表達(dá)分析結(jié)果表明，蒺藜苜蓿MtDWF1基因在莖及葉中的表達(dá)量最高，說(shuō)明其在莖和葉中發(fā)揮作用。其表達(dá)受ABA，SA調(diào)節(jié)。BR可促進(jìn)MtDWF1基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)植株發(fā)育?？傊?，這些結(jié)果不僅為進(jìn)一步探索MtDWF1基因功能的提供了思路，也從分子水平上研究其他豆科植物基因功能提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］TRIEU A T，HARRISON M J. Rapid transformation of Medicago truncatula：regeneration via shoot organogenesis［J］. Plant Cell Reports，1996，16（1-2）：6-11

［2］VIKER K B，STEELE M B，LANKOV I D，et al. Preclinical safety assessment of MV-s-NAP，a novel oncolytic measles virus strain armed with an H. pylori immunostimulatory bacterial transgene［J］. Molecular Therapy - Methods amp; Clinical Development，2022（26）：532-546

［3］ENDRE G，KERESZT A，KEVEI Z，et al. A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development［J］. Nature，2002（417）：962-966

［4］李菲，何小紅，張習(xí)敏，等. 苜蓿14-3-3基因家族的鑒定與進(jìn)化和特征分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（12）：5238-5243

［5］TAO Y Z，ZHENG J，XU Z M，et al. Functional analysis of ZmDWF1，a maize homolog of the Arabidopsis brassinosteroids biosynthetic DWF1/DIM gene［J］. Plant Science，2004，167（4）：743-751

［6］何宇炯，徐如涓，趙毓橘，等. 表油菜素內(nèi)酯對(duì)油菜幼苗生長(zhǎng)及其可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的影響［J］. 植物生理學(xué)通訊，1995，31（1）：37-39

［7］曲善民，蘇一諾，苗陽(yáng)陽(yáng)，等. 蕓苔素內(nèi)酯對(duì)連作及非連作紫花苜蓿生產(chǎn)調(diào)控初探［J］. 草地學(xué)報(bào)，2019，27（4）：874-881

［8］寇江濤. 外源2，4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)和生理的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2019，27（6）：1562-1568

［9］鄧天福，吳艷兵，李廣領(lǐng)，等. 油菜素內(nèi)酯提高植物抗逆性研究進(jìn)展［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（11）：21-25

［10］WANG Z Y，BAI M Y，OH E，et al. Brassinosteroid signaling network and regulation of photomorphogenesis［J］. Annual Review of Genetics，2012，46（1）：701-724

［11］HOSSAIN Z，MCGARVEY B，AMYOT L，et al. Diminuto 1 affects the lignin profile and secondary cell wall formation in Arabidopsis［J］. Planta，2012，235（3）：485-498

［12］張瑾，金烏云，陳瑩瑩，等. 甜瓜CmDWF1基因的克隆及表達(dá)分析［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，34（5）：8-14

［13］吳國(guó)超. 水稻矮脆突變體dwf1的特性與基因定位［D］. 重慶：西南大學(xué)，2014：35-36

［14］陶亞忠. 玉米與油菜素類固醇生物合成相關(guān)的基因ZmDWF1的克隆及其功能分析［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004：108

［15］LI Y R Z，WANG M D，GUO T，et al. Overexpression of abscisic acid-insensitive gene ABI4 from Medicago truncatula，which could interact with ABA2，improved plant cold tolerance mediated by ABA signaling［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13（13）：982715

［16］舒思晨，王娟，王柏柯，等. 外源MeJA和BR對(duì)番茄種子萌發(fā)及幼根生長(zhǎng)的影響［J］. 農(nóng)業(yè)工程，2022，12（3）：138-143

［17］吳婧，范菠菠，張學(xué)峰，等. 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)及其表達(dá)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（11）：2910-2921

［18］CHOE S，DILKES B P，GREGORY B D，et al. The Arabidopsis dwarf1 mutant is defective in the conversion of 24-methylenecholesterol to campesterol in brassinosteroid biosynthesis［J］. Plant Physiology，1999，119（3）：897-908

［19］羅明，周建平，肖月華，等. 棉花油菜素類固醇合成酶基因GhDWF1的克隆和表達(dá)分析［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（7）：1337-1344

［20］唐曉，鄧孟勝，鄒雪，等. 馬鈴薯StDWF1基因克隆及表達(dá)分析［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，30（6）：909-917

［21］SCHULTZ L，HUUB L，KERCKHOFFS J，et al. Molecular characterization of the brassinosteroid-deficient Ikb mutant in pea［J］. Plant Molecular Biology，2001，47（4）：491-508

［22］剛爽. ABA對(duì)亞高溫強(qiáng)光脅迫下番茄葉片光合作用影響及分子機(jī)制研究［D］. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：9-11

［23］段方猛，羅秋蘭，魯雪莉，等. 玉米油菜素甾醇生物合成關(guān)鍵酶基因ZmCYP90B1的克隆及其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)［J］. 作物學(xué)報(bào)，2018，44（3）：343-356

［24］VRIET C，RUSSINOVA E，REUZEAU C，et al. From squalene to brassinolide：the steroid metabolic and signaling pathways across the plant kingdom［J］. Molecular Plant，2013，6（6）：1738-1757

［25］BEST N B，HARTWIG T，BUDKA J，et al. Nana plant2 encodes a maize ortholog of the Arabidopsis brassinosteroid biosynthesis gene DWARF1，identifying developmental interactions between brassinosteroids and gibberellins［J］. Plant Physiology，2016，171（4）：2633-2647

（責(zé)任編輯 劉婷婷）