紫花苜蓿R2R3-MYB亞家族鑒定與干旱脅迫下的表達(dá)分析

摘要：MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）家族是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，R2R3-MYB亞家族在植物脅迫響應(yīng)、次級(jí)代謝、生長(zhǎng)和發(fā)育等過(guò)程發(fā)揮重要作用。本研究利用紫花苜蓿（Medicago sativa ‘Zhongmu No.1’）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定了R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件及干旱脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，紫花苜蓿中有121個(gè)R2R3-MYB亞家族成員，各成員均具有兩個(gè)典型的MYB結(jié)構(gòu)域，理化性質(zhì)變化較大。系統(tǒng)進(jìn)化分析將121個(gè)成員分為33個(gè)組，各成員無(wú)規(guī)律地定位在8條染色體上?；蚪Y(jié)構(gòu)和順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，同一分組具有相同或相似的外顯子數(shù)和順式作用元件。響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)模式分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果表明干旱脅迫下MsMYB12，MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73，MsMYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189，MsMYB268基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，可作為后期紫花苜蓿響應(yīng)干旱脅迫機(jī)制研究的潛在靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；R2R3-MYB；生物信息學(xué)分析；干旱脅迫；表達(dá)模式

中圖分類(lèi)號(hào)：S772.3+6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）04-0972-12

Identification and Expression Analyses of R2R3-MYB Subfamily in

Alfalfa under Drought Stress

REN Ming-hui， ZHANG Yu-peng， XU Tao， ZHU Hui-sen CEN Hui-fang

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：The MYB （v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog） family is one of the largest transcription factor families. The R2R3-MYB subfamily is widely involved in the stress response，secondary metabolism，growth and development of plant. In this study，R2R3-MYB transcription factors were identified in alfalfa. Their sequence characteristics，phylogenetic relationship，chromosome distributions，gene structures，cis-elements，and expression patterns under drought stress were analyzed by bioinformatic methods. The results showed that there were 121 members of the R2R3-MYB subfamily in Alfalfa. Each member had two typical MYB binding domains，the physical and chemical properties of which were yet different. These 121 members were divided into 33 groups by phylogenetic analysis，and each member was located irregularly on one of the 8 chromosomes. The analyses of gene structures and cis-elements showed that there were the same or similar numbers of exon and cis-elements within the same group. The expression levels of MsMYB12， MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73，MsMYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189， MsMYB268 genes were significantly up-regulated in response to drought stress. It provides potential targets for studying the mechanism of R2R3-MYB transcription factor genes in response to drought stress in alfalfa.

Key words：Alfalfa;R2R3-MYB;Bioinformatic analysis;Drought stress;Expression patterns

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物進(jìn)化過(guò)程中形成的一類(lèi)特有的蛋白，能與基因啟動(dòng)子區(qū)的特定位點(diǎn)結(jié)合，從而起到調(diào)控轉(zhuǎn)錄的作用［1］。轉(zhuǎn)錄因子以其靶向DNA結(jié)構(gòu)域的相似性被劃分為不同家族［2］。MYB轉(zhuǎn)錄因子因具有保守的MYB結(jié)構(gòu)域而得名，是植物中成員數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［3］。MYB轉(zhuǎn)錄因子的N端高度保守，該區(qū)域包含1至4個(gè)相鄰的不完全重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)由約50個(gè)氨基酸殘基組成［4］。根據(jù)氨基酸序列中串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目，MYB家族被分為4個(gè)主要的亞族：1R-MYB，R2R3-MYB，R1R2R3-MYB和4R-MYB［5］。植物中大多數(shù)MYB屬于R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子［6］。通常R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子由兩種模式進(jìn)化而來(lái)：一種通過(guò)R1R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域缺失一個(gè)重復(fù)產(chǎn)生；另外一種由1R-MYB結(jié)構(gòu)域的復(fù)制產(chǎn)生［3，5］。R2R3-MYB亞家族在植物的逆境脅迫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。近來(lái)有大量關(guān)于R2R3-MYB亞家族鑒定及參與植物非生物脅迫的報(bào)道。小麥（Triticum aestivum）、青錢(qián)柳（Cyclocarya paliurus）、煙草（Nicotiana tabacum）、菠蘿（Ananas comosus）的相關(guān)報(bào)道中分別鑒定出了393個(gè)、69個(gè)、174個(gè)、103個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，其中部分基因已被證明參與了干旱、高溫、低溫及鹽脅迫等非生物脅迫的響應(yīng)［7-10］。Zhang等基于垂絲海棠（Malus halliana）鐵缺乏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)14個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因在缺鐵脅迫下差異表達(dá)，并證明MhR2R3-MYB4能夠提高擬南芥對(duì)缺鐵的耐受性［11］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）因其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)高、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是種植最廣泛的牧草之一，有“牧草之王”的美譽(yù)［12-13］。在中國(guó)，紫花苜蓿的種植區(qū)主要分布在西北、東北、華北等半干旱地區(qū)，干旱是限制其產(chǎn)量和地理分布的主要因素之一［14-15］。因此，提高紫花苜蓿的干旱適應(yīng)性對(duì)我國(guó)北方畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。干旱導(dǎo)致植物代謝異常進(jìn)而影響植株正常生長(zhǎng)，而植物通過(guò)相關(guān)基因調(diào)控對(duì)干旱脅迫的感知、響應(yīng)，以維持正常生長(zhǎng)［16-17］。其中，R2R3-MYB亞家族基因在非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，是值得挖掘的一類(lèi)調(diào)控干旱脅迫的基因［18］。本文利用生物信息學(xué)方法對(duì)紫花苜蓿R2R3-MYB亞家族進(jìn)行了鑒定，對(duì)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化、基因染色體分布、基因結(jié)構(gòu)及順式作用元件進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。此外，通過(guò)對(duì)紫花苜蓿響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及qRT-PCR驗(yàn)證確定9個(gè)R2R3-MYB家族成員是潛在的干旱脅迫抗性基因。本研究為探討紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因功能提供了基礎(chǔ)，也為后續(xù)紫花苜蓿耐旱品種改良提供靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1MYB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

利用紫花苜蓿（Medicago sativa ‘Zhongmu No.1’）基因組數(shù)據(jù)（https：//figshare.com/articles/dataset/Medicago_sativa_genome_and_annotation_files/12623960）和MYB保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件（PF00249），用HMMER3.0搜索含有MYB結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，E-value值設(shè)為0.001。把搜索到的含MYB結(jié)構(gòu)域的序列在保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（Conserved domains database，CDD）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）中進(jìn)行鑒定，剔除結(jié)構(gòu)域不完整序列后，根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目最終篩選出R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)，我們從擬南芥（Arabidopsis thaliana）信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)（The arabidopsis information resource，TAIR）（https：//www.arabidopsis.org/）獲取擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2序列特征分析

紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的大小，理論等電點(diǎn)和分子質(zhì)量通過(guò)ExPasy網(wǎng)站（https：//www.expasy.org/）進(jìn)行預(yù)測(cè)。同時(shí)，通過(guò)WebLogo在線工具（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制擬南芥和紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子R2和R3重復(fù)的序列標(biāo)簽圖。

1.3紫花苜蓿R2R3-MYB基因染色體定位分析

從‘中苜1號(hào)’基因注釋文件中獲取組裝的染色體信息及MYB基因的染色體定位信息，根據(jù)MYB基因在染色體上的順序進(jìn)行編號(hào)。利用MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）在線工具，繪制R2R3-MYB基因的染色體定位圖［19］。

1.4紫花苜蓿R2R3-MYB亞家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用多序列比對(duì)工具M(jìn)uscle對(duì)紫花苜蓿和擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多序列比對(duì)，參數(shù)采用系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。通過(guò)分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（采用鄰接法，泊松模型，系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置為1000自舉值）［20］。根據(jù)擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的分類(lèi)情況對(duì)紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分組［5］。

1.5紫花苜蓿R2R3-MYB基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和順式作用元件分析

從‘中苜1號(hào)’基因注釋文件中獲取R2R3-MYB基因的內(nèi)含子和外顯子信息用于繪制基因結(jié)構(gòu)圖；從‘中苜1號(hào)’基因組中提取R2R3-MYB基因起始密碼子上游1 000 bp的序列，并提交到PlantCARE進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測(cè)［21］。根據(jù)獲得的基因結(jié)構(gòu)信息和順式作用元件預(yù)測(cè)信息，利用Tbtools繪制R2R3-MYB基因的順式作用元件和基因結(jié)構(gòu)圖［22］。

1.6紫花苜蓿R2R3-MYB基因響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)模式分析

從‘中苜1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組（PRJNA450305）中獲取400 mmol·L^-1甘露醇模擬干旱脅迫處理0 h，3 h，6 h，12 h，24 h的數(shù)據(jù)以及10 μmol·L^-1響應(yīng)干旱脅迫主要激素ABA處理1 h，3 h，12 h的數(shù)據(jù)作為表達(dá)模式分析的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)［23-24］。之后，通過(guò)hisat2建立紫花苜?；蚪M的索引，并將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)到紫花苜?；蚪M中，利用FeatureCounts進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算TPM值，用log₂（TPM+1）值繪制干旱脅迫下紫花苜蓿R2R3-MYB基因的表達(dá)模式圖。

1.7紫花苜蓿R2R3-MYB基因qRT-PCR分析

植物材料為‘中苜1號(hào)’紫花苜蓿，于2022年8月種植在蛭石∶沙=1∶1的基質(zhì)中，置于人工氣候箱中，培養(yǎng)條件為晝/夜溫度25℃/20℃，濕度65%，光照/黑暗時(shí)間16 h/8 h。出苗后，每3 d用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌。待幼苗生長(zhǎng)至4周齡，取出植株，于1/2 Hoagland中培養(yǎng)24 h后分別用含500 mmol·L^-1甘露醇和80 μmol·L^-1 ABA的1/2 Hoagland進(jìn)行脅迫處理，采集甘露醇處理0，3 h，6 h，12 h和ABA處理0，1 h，3 h，12 h的葉片，用于qRT-PCR檢測(cè)。

總RNA提取采用快速通用植物RNA提取試劑盒3.0（北京華越洋生物科技有限公司），用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度，利用PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser（Perfect Real Time）（RR047，TaKaRa，寶生物工程有限公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Primer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1，其中β-Actin為內(nèi)參基因。qRT-PCR采用Bio-Rad CFX96系統(tǒng)，每個(gè)反應(yīng)體系中含有cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、TB Green Premix Ex Taq II （TaKaRa，寶生物工程有限公司）10 μL和無(wú)菌水7 μL。qRT-PCR反應(yīng)循環(huán)條件為：95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，10 s；40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量使用FC=2^-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.8數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2019進(jìn)行整理，SPSS 11.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子鑒定

在紫花苜?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得277個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子序列。根據(jù)上述MYB轉(zhuǎn)錄因子的分類(lèi)方法，將紫花苜蓿MYB轉(zhuǎn)錄因子分為4類(lèi)，分別為1R-MYB，R2R3-MYB，R1R2R3-MYB和4R-MYB，其中1R-MYB有148個(gè)，R2R3-MYB有121個(gè)，R1R2R3-MYB有7個(gè)，4R-MYB有1個(gè)。根據(jù)MYB基因在染色體的順序編號(hào)為MsMYB1～MsMYB274。此外，MsMYB275，MsMYB276，MsMYB277以所在contig的順序編號(hào)。表2為R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因ID、編號(hào)及理化性質(zhì)。

2.2紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子序列特征分析

紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸長(zhǎng)度、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子中分子量最小的是MsMYB74轉(zhuǎn)錄因子，由119個(gè)氨基酸殘基組成，分子量最大的MsMYB8轉(zhuǎn)錄因子，由1 771個(gè)氨基酸殘基組成，氨基酸殘基數(shù)200～500個(gè)的轉(zhuǎn)錄因子有94個(gè)，占R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的77.7%，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子分子質(zhì)量分布范圍為1 388.94～1 196 154.61 Da；蛋白等電點(diǎn)（Isoelectric point，pI）最小的是MsMYB65轉(zhuǎn)錄因子（4.74），等電點(diǎn)最大的是MsMYB47轉(zhuǎn)錄因子（10.15），pIlt;6.5的酸性蛋白55個(gè)，占總數(shù)的45.5%，pIgt;7.5的堿性蛋白51個(gè)，占總數(shù)的42.1%，中性蛋白15個(gè)，占總數(shù)的12.4%，表明紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞家族蛋白理化性質(zhì)具有多樣性。

為了進(jìn)一步探究R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的序列特征，我們繪制了R2和R3重復(fù)每個(gè)位點(diǎn)氨基酸出現(xiàn)的頻率圖。如圖1所示，紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的R2和R3重復(fù)由約108個(gè)氨基酸殘基組成。同擬南芥相似，紫花苜蓿R2和R3重復(fù)中的第9，30，50，82，101位分布著高度保守的色氨酸殘基（W），R3重復(fù)的第63位色氨酸（W）常被苯丙氨酸（F）或異亮氨酸（I）取代，除高度保守的色氨酸殘基之外，R2和R3重復(fù)中分別含有高度保守的谷氨酸（E-12）～谷氨酸（E-13）～天冬氨酸（D-14）殘基和谷氨酸（E-66）～谷氨酸（E-67）～谷氨酸（E-68）殘基。紫花苜蓿R2和R3重復(fù)的一些位點(diǎn)與擬南芥存在一定的差異，如：R2重復(fù)的第2，19，22和40位，R3重復(fù)的第77，87和110位。

序列特征分析表明紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的R2，R3重復(fù)保守性較高（圖1），但蛋白質(zhì)的理化特性具有較大的差異（表2）。因此，有必要進(jìn)一步了解紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因特征。

2.3紫花苜蓿R2R3-MYB亞家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)紫花苜蓿和擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)已報(bào)道的擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子分組情況，將紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子分為20個(gè)組［5］，其中未有文獻(xiàn)報(bào)道的分組編號(hào)為M1—M13（圖2）。從紫花苜蓿與擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)中發(fā)現(xiàn)，擬南芥S15，S16，S24組沒(méi)有紫花苜蓿序列，紫花苜蓿M1，M2，M11，M13分組中沒(méi)有擬南芥序列，表明R2R3-MYB亞家族在植物進(jìn)化中的多樣性。聚集在同一分組的成員序列保守性較高，其基因功能也可能具有一定的相似性，在擬南芥中S1，S2，S11，S18，S20，S22分組與非生物脅迫有關(guān)，MsMYB181基因處于S1分組，MsMYB12基因處于S2分組，MsMYB71，MsMYB132，MsMYB48基因處于S11分組，MsMYB30，MsMYB31，MsMYB246，MsMYB81，MsMYB1，MsMYB67，MsMYB271，MsMYB176，MsMYB20基因處于S18分組，MsMYB268，MsMYB52，MsMYB36，MsMYB44基因處于S20分組，MsMYB144基因處于S22分組中，這些基因可能參與紫花苜蓿非生物脅迫調(diào)控。

2.4紫花苜蓿R2R3-MYB基因染色體定位

根據(jù)Shen等對(duì)‘中苜1號(hào)’基因組的注釋信息［12］，對(duì)編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因進(jìn)行染色體定位分析，結(jié)果顯示，119個(gè)成員定位到8條染色體上，2個(gè)成員定位到未完全組裝的contig上；其中1號(hào)染色體上R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因最多，有21個(gè)成員，占R2R3-MYB基因總數(shù)的17.4%；其次是7號(hào)染色體，有20個(gè)R2R3-MYB基因；6號(hào)染色體含有R2R3-MYB基因數(shù)目最少，僅為10個(gè)成員。染色體長(zhǎng)度和含有的R2R3-MYB基因數(shù)量沒(méi)有明顯的相關(guān)性，但在Chr1，Chr5，Chr7和Chr8上分布密集，推斷與R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的串聯(lián)復(fù)制有關(guān)。

2.5紫花苜蓿R2R3-MYB基因結(jié)構(gòu)分析及順式作用元件預(yù)測(cè)

為了分析紫花苜蓿R2R3-MYB亞家族的基因結(jié)構(gòu)特征，繪制了基因結(jié)構(gòu)圖（圖4）。121個(gè)R2R3-MYB基因包含不同數(shù)目的外顯子，從1到22個(gè)不等，多數(shù)R2R3-MYB基因含3個(gè)外顯子。結(jié)合進(jìn)化樹(shù)分組發(fā)現(xiàn)，聚集在同一分組的R2R3-MYB基因有相同或接近數(shù)目的外顯子，同一分組的基因結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，提示這些基因可能具有相似的功能。

為了進(jìn)一步分析紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能，對(duì)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因上游1 000 bp區(qū)域進(jìn)行了順式作用元件檢測(cè)，以推測(cè)紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的功能。兩類(lèi)順式作用元件被檢測(cè)到，一類(lèi)與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，一類(lèi)與脅迫響應(yīng)有關(guān)（圖4）。與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的順式作用元件包括：MYB結(jié)合位點(diǎn)（MYB），光響應(yīng)元件（Box-4，G-box，GT1-motif，Sp），MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)（CCAAT-box），分生組織活性位點(diǎn)（O2-site），分生表達(dá)元件（CAT-box）。與脅迫有關(guān)的順式作用元件有：厭氧響應(yīng)元件（ARE），茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif和CGTCA-motif），ABA響應(yīng)元件（ABRE），干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）。結(jié)合進(jìn)化樹(shù)分組發(fā)現(xiàn)，聚集在同一分組的R2R3-MYB基因上游含有相同或相似的與生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，推測(cè)R2R3-MYB基因能夠參與非生物脅迫調(diào)控，且在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期發(fā)揮作用。

2.6紫花苜蓿R2R3-MYB基因干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

基因表達(dá)模式分析可以為基因功能研究提供重要依據(jù)，為了獲取干旱脅迫下紫花苜蓿R2R3-MYB基因的表達(dá)模式，根據(jù)甘露醇模擬干旱脅迫處理3 h（M1），6 h（M2），12 h（M3），24 h（M4）以及ABA處理1 h（ABA1），3 h（ABA2），12 h（ABA3）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以0 h（CK）處理為對(duì)照繪制了51個(gè)差異性表達(dá)R2R3-MYB基因的熱圖。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果，將51個(gè)基因分為A—D四個(gè)組，與對(duì)照相比，D組R2R3-MYB基因表達(dá)在甘露醇和ABA處理下被不同程度地誘導(dǎo)；B組9個(gè)基因的表達(dá)在甘露醇和ABA處理下被誘導(dǎo)，1個(gè)基因的表達(dá)被抑制。51個(gè)差異性表達(dá)的R2R3-MYB基因中，MsMYB12，MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73，MsMYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189，MsMYB268基因在甘露醇和ABA處理下表達(dá)量均顯著上調(diào)；MsMYB32，MsMYB102，MsMYB272，MsMYB128，MsMYB97，MsMYB71基因隨甘露醇處理時(shí)長(zhǎng)增加，表達(dá)量呈先升高后降低趨勢(shì)；MsMYB26，MsMYB118，MsMYB232基因在甘露醇處理下表達(dá)量下調(diào)（圖5）。

2.7紫花苜蓿R2R3-MYB基因qRT-PCR分析

根據(jù)圖5中的結(jié)果，為了進(jìn)一步確認(rèn)紫花苜蓿R2R3-MYB基因在干旱脅迫下的表達(dá)情況，選取9個(gè)紫花苜蓿R2R3-MYB基因進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示甘露醇和ABA處理對(duì)上述R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因均有顯著調(diào)控作用。其中，甘露醇處理組均顯著上調(diào)，尤其是在12 h時(shí)間點(diǎn)，表達(dá)量變化最為明顯。而在ABA處理?xiàng)l件下，整體隨著ABA處理時(shí)長(zhǎng)增加，表達(dá)量呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，但是也存在一定的波動(dòng)，如：MsMYB88基因的表達(dá)量先增加后降低，這可能是由于ABA作為干旱的重要信使在處理過(guò)程中對(duì)植株的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在一定的擾動(dòng)。我們的qRT-PCR結(jié)果與圖5中的結(jié)果存在一定差異，如MsMYB52，MsMYB124，MsMYB149在甘露醇處理3 h時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化，可能是轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR試驗(yàn)的樣本來(lái)源與處理時(shí)間不同所導(dǎo)致的。

3討論

在植物中，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是最大的一類(lèi)，可調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程和代謝通路。本文對(duì)紫花苜蓿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行鑒定，并對(duì)篩選出的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、順式作用元件預(yù)測(cè)及干旱脅迫下的表達(dá)模式分析。共有277個(gè)MYB基因被鑒定到，包括121個(gè)R2R3-MYB基因，占總MYB基因的43%，此結(jié)果和Li等在馬鈴薯（Solanum tuberosum）中鑒定的有111個(gè)R2R3-MYB基因占總MYB基因的44%相似［25］。在擬南芥中有126個(gè)R2R3-MYB基因，占總MYB家族的64.29%［2］，在辣椒（Capsicum annuum）中鑒定出108個(gè)R2R3-MYB基因，占總MYB基因的50%［26］。植物R2R3-MYB亞家族成員占MYB家族較大一部分比例，這可能是在進(jìn)化過(guò)程中R2R3-MYB基因處于有利地位，發(fā)生了基因擴(kuò)張所導(dǎo)致的［27］。

植物在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中，進(jìn)化出了相應(yīng)的性狀，調(diào)控這些性狀的基因各異。紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子各成員中，基因長(zhǎng)度各異，編碼的蛋白理化性質(zhì)差異性較大，但這些轉(zhuǎn)錄因子的特征性區(qū)域R2和R3重復(fù)序列高度保守，與毛果楊（Populus trichocarpa）、柑橘（Citrus sinensis）等的結(jié)果一致［28-29］。R2和R3重復(fù)通過(guò)結(jié)合基因上游啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮功能，在不同植物中R2和R3重復(fù)序列高度保守，推斷R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能具有的相似性。

基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系是研究基因功能的重要參考，進(jìn)化關(guān)系相近的基因功能具有相似性，擬南芥中S1，S2，S11，S18，S20，S22分組與非生物脅迫有關(guān)［5］，推斷處于這些分組的紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子可能與干旱脅迫有關(guān)，但仍需后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。紫花苜蓿與擬南芥的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子大部分能聚于同一分組，表明R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在不同物種間具有保守性，但是并不是所有紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子都能與擬南芥聚在同一分組，可能這些轉(zhuǎn)錄因子基因是后期進(jìn)化獲得的，或者進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了基因丟失的情況［30］。

基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示聚集在同一分組的R2R3-MYB基因有相同或接近數(shù)目的外顯子數(shù)，與Wang等報(bào)道的結(jié)果一致［4］，同一分組內(nèi)基因的結(jié)構(gòu)相似，基因的進(jìn)化關(guān)系相近，那么可以推斷同一分組基因的功能相似?；騿?dòng)子區(qū)域順式作用元件預(yù)測(cè)顯示，紫花苜蓿25.62%（31/121）的R2R3-MYB基因具有MBS順式作用元件，順式作用元件MBS是響應(yīng)干旱脅迫的主要元件［31］，說(shuō)明這些R2R3-MYB基因可能與干旱脅迫有關(guān)；紫花苜蓿29.75%（36/121）的R2R3-MYB基因具有ABRE順式作用元件，ABRE是ABA響應(yīng)的主要順式元件［32］，有研究報(bào)道，ABA信號(hào)通路在MYB介導(dǎo)的植物耐旱性中起著重要作用［33］，過(guò)表達(dá)TaMYB33可通過(guò)ABA介導(dǎo)的脅迫響應(yīng)信號(hào)，提高擬南芥的耐旱、耐鹽能力［34］，過(guò)表達(dá)擬南芥MYB37可以通過(guò)增強(qiáng)對(duì)ABA的敏感性，提高擬南芥干旱脅迫耐受性［35］，初步判斷R2R3-MYB基因可以通過(guò)ABA途徑調(diào)控紫花苜蓿干旱脅迫耐受性。

基因表達(dá)模式的闡明可以為研究基因功能提供重要線索，R2R3-MYB基因在植物抵抗各種非生物脅迫中起著重要的調(diào)控作用［36］。紫花苜蓿中51個(gè)R2R3-MYB基因的表達(dá)受甘露醇、ABA處理影響，說(shuō)明這些基因可能參與干旱脅迫調(diào)控。有研究報(bào)道，擬南芥AtMYB2能夠提高ABA敏感性，以誘導(dǎo)干旱脅迫相關(guān)基因表達(dá)，提高干旱脅迫耐受性，MsMYB52，MsMYB268和AtMYB2處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的S20分組，推斷MsMYB52和MsMYB268能在紫花苜蓿的干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用［37］。過(guò)表達(dá)AtMYB37能夠提高擬南芥對(duì)ABA的敏感性，以提高干旱脅迫耐受性，MsMYB73，MsMYB124和AtMYB37處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的S14分組，推斷MsMYB73和MsMYB124可以通過(guò)ABA途徑提高紫花苜蓿的干旱脅迫耐受性［35］。此外，基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MsMYB45，MsMYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189，MsMYB268啟動(dòng)子區(qū)含有MBS或ABRE順式作用元件，推測(cè)這些基因可以參與紫花苜蓿干旱脅迫響應(yīng)。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果證明了MsMYB12，Ms-MYB 45，MsMYB 52，MsMYB 73，MsMYB 88，Ms-MYB124，MsMYB149，MsMYB189，MsMYB268基因具有響應(yīng)干旱脅迫的功能。

4結(jié)論

紫花苜?；蚪M中有121個(gè)R2R3-MYB亞家族成員，各成員均具有兩個(gè)典型的MYB結(jié)構(gòu)域，理化性質(zhì)有較大差異。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因可能在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及qRT-PCR結(jié)果表明在干旱脅迫下MsMYB12，MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73，Ms-MYB88，MsMYB124，MsMYB149，MsMYB189，Ms-MYB268表達(dá)量顯著上調(diào)，為后期紫花苜蓿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制研究提供潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

［1］PABO C O，SAUER R T. Transcription Factors：Structural Families and Principles of DNA Recognition［J］. Annual Review of Biochemistry，1992，61（1）：1053-1095

［2］STRACKE R，WERBER M，WEISSHAAR B. The R2R3-MYB Gene Family in Arabidopsis thaliana［J］. Current Opinion in Plant Biology，2001，4（5）：447-456

［3］AMBAWAT S，SHARMA P，YADAV N R，et al. MYB Transcription Factor Genes as Regulators for Plant Responses：an Overview［J］. Physiology and Molecular Biology of Plants，2013，19（3）：307-321

［4］WANG Y J，ZHANG Y，F(xiàn)AN C J，et al. Genome-Wide Analysis of MYB Transcription Factors and Their Responses to Salt Stress in Casuarina equisetifolia［J］. BMC Plant Biology，2021，21（1）：1-17

［5］DUBOWS C，STRACKE R，GROTEWOLD E，et al. MYB Transcription Factors in Arabidopsis［J］. Trends in Plant Science，2010，15（10）：573-581

［6］李春艷，王曦，周勝花，等. 白羊草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及對(duì)干旱脅迫反應(yīng)的研究［J］. 草地學(xué)報(bào)，2020，28（6）：1784-1790

［7］WEI Q H，CHEN R，WEI X，et al. Genome-Wide Identification of R2R3-MYB Family in Wheat and Functional Characteristics of the Abiotic Stress Responsive Gene TaMYB344［J］. BMC Genomics，2020，21（1）：1-16

［8］ZHANG Z J，ZHANG L，LIU Y，et al. Identification and Expression Analysis of R2R3-MYB Family Genes Associated with Salt Tolerance in Cyclocarya paliurus［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（7）：1-18

［9］YANG J H，ZHANG B H，GU G，et al. Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the R2R3-MYB Gene Family in Tobacco （Nicotiana tabacum L.） ［J］. BMC Genomics，2022，23（1）：1-21

［10］陳哲，胡福初，阮城城，等. 菠蘿R2R3-MYB基因家族鑒定與表達(dá)分析［J］. 熱帶植物學(xué)報(bào)，2019，40（10）：1958-1971

［11］ZHANG Z X，ZHANG R，WANG S C，et al. Identification of Malus halliana R2R3-MYB Gene Family under Iron Deficiency Stress and Functional Characteristics of MhR2R3-MYB4 in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Biology，2022，24（2）：344-355

［12］SHEN C，DU H L，CHEN Z，et al. The Chromosome-Level Genome Sequence of the Autotetraploid Alfalfa and Resequencing of Core Germplasms Provide Genomic Resources for Alfalfa Research［J］. Molecular Plant，2021，13（9）：1259-1261

［13］楊帆，韋寶，王瑜，等. 紫花苜蓿產(chǎn)量、品質(zhì)和根系對(duì)刈割高度的響應(yīng)［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（6）：1597-1602

［14］方明月，汪溢磐，趙奕，等. 低溫干旱復(fù)合脅迫對(duì)8個(gè)紫花苜蓿品種形態(tài)和生理特征的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（11）：2967-2974

［15］魏娜，李艷鵬，馬藝桐，等. 全基因組水平紫花苜蓿TCP基因家族的鑒定及其在干旱脅迫下表達(dá)模式分析［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2022，31（1）：118-130

［16］MUVUNYI B P，YAN Q，WU F，et al. Mining Late Embryogenesis Abundant （LEA） Family Genes in Cleistogenes songorica a Xerophyte Perennial Desert Plant ［J］. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（11）：1-15

［17］ZHU J K. Abiotic Stress Signaling and Responses in Plants［J］. Cell，2016，167（2）：313-324

［18］WU W H，ZHU S，ZHU L M，et al. Characterization of the Liriodendron chinense MYB Gene Family and its Role in Abiotic Stress Response［J］. Frontiers in Plant Science，2021，12（6）：1-19

［19］CHAO J T，LI Z Y，SUN Y H，et al. MG2C：a User-Friendly Online Tool for Drawing Genetic Maps［J］. Molecular Horticulture，2021，1（12）：1-4

［20］KUMAR S，STECHER G，TAMURA K. MEGA7：Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets［J］. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874

［21］MAGALI L，DHAIS P，THIJS G，et al. PlantCARE，a Database of Plant Cis-acting Regulatory Elements and a Portal to Tools for in Silico Analysis of Promoter Sequences［J］. Nucleic Acids Research，2002，30（1）：325-327

［22］CHEN C J，CHEN H，ZHANG Y，et al. TBtools：an Integrative Toolkit Developed for Interactive Analyses of Big Biological Data［J］. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202

［23］LUO D，ZHOU Q，WU Y G，et al. Full-length Transcript Sequencing and Comparative Transcriptomic Analysis to Evaluate the Contribution of Osmotic and Ionic stress Components Towards Salinity Tolerance in the Roots of Cultivated Alfalfa （Medicago sativa L.）［J］. BMC Plant Biology，2019，19（1）：1-20

［24］LUO D，WU Y G，LIU J，et al. Comparative Transcriptomic and Physiological Analyses of Medicago sativa L. Indicates that Multiple Regulatory Networks are Activated during Continuous ABA Treatment［J］. International Journal of Molecular Sciences，2018，20（1）：1-22

［25］LI Y M，WANG K L，LIU Z，et al. Genome-Wide Analysis and Expression Profiles of the StR2R3-MYB Transcription Factor Superfamily in Potato （Solanum tuberosum L.）［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2020，148（4）：817-832

［26］WANG J，LIU Y，TANG B Q，et al. Genome-Wide Identification and Capsaicinoid Biosynthesis-Related Expression Analysis of the R2R3-MYB Gene Family in Capsicum annuum L.［J］. Frontiers in Genetics，2020，11（12）：1-12

［27］王嵐春，沈方圓，歐陽(yáng)丹，等. 簸箕柳R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組分析［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，59（3）：153-162

［28］WILKINS O，NAHAL H，F(xiàn)OOMG J，et al. Expansion and Diversification of the Populus R2R3-MYB Family of Transcription Factors［J］. Plant Physiology，2008，149（2）：981-993

［29］HOU X J，LI S B，LIU S R，et al. Genome-Wide Classification and Evolutionary and Expression Analyses of Citrus MYB Transcription Factor Families in Sweet Orange［J］. PLoS One，2014，9（11）：1-16

［30］居利香，雷欣，趙成志，等. 辣椒MYB基因家族的鑒定及與辣味關(guān)系分析［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2020，47（5）：875-892

［31］KATIYAR A，SMITA S，LENKA S K. Genome-Wide Classification and Expression Analysis of MYB Transcription Factor Families in Rice and Arabidopsis［J］. BMC Genomics，2012，13（10）：1-19

［32］YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K. Transcriptional Regulatory Networks in Cellular Responses and Tolerance to Dehydration and Cold Stresses［J］. Annual Review of Plant Biology，2006，57（1）：781-803

［33］WANG X P，NIU Y L，ZJENG Y，et al. Multiple Functions of MYB Transcription Factors in Abiotic Stress Responses［J］. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（11）：1-14

［34］QIN Y X，WANG M C，TIAN Y C，et al. Over-expression of TaMYB33 Encoding a Novel Wheat MYB Transcription Factor Increases Salt and Drought Tolerance in Arabidopsis［J］. Molecular Biology Reports，2012，39（2）：7183-7192

［35］YU Y T，WU Z W，LU K，et al. Overexpression of the MYB37 Transcription Factor Enhances Abscisic Acid Sensitivity，and Improves both Drought Tolerance and Seed Productivity in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Molecular Biology，2015，90（3）：267-279

［36］DU H，ZHANG L，LIU L，et al. Biochemical and Molecular Characterization of Plant MYB Transcription Factor Family［J］. Biochemistry，2009，74（1）：1-11

［37］ABE H，URAO T，ITO T，et al. Arabidopsis AtMYC2 （bHLH） and AtMYB2 （MYB） Function as Transcriptional Activators in Abscisic Acid Signaling［J］. Plant Cell，2003，15（1）：63-78

（責(zé)任編輯 閔芝智）