冬蟲夏草真?zhèn)舞b別方法研究進(jìn)展△

李文佳，汪小東，艾中，錢正明*，向麗，張曉婧

(1. 廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523850； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

冬蟲夏草真?zhèn)舞b別方法研究進(jìn)展△

李文佳1，汪小東1，艾中1，錢正明1*，向麗2，張曉婧1

(1. 廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523850； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

冬蟲夏草為傳統(tǒng)的名貴中藥材，近年來由于瘋狂的采挖使得其資源急劇減少，瀕臨滅絕。目前市場(chǎng)上冬蟲夏草價(jià)格堪比黃金，摻偽現(xiàn)象嚴(yán)重。本文從性狀鑒別、顯微鑒別、分子生物學(xué)鑒別和化學(xué)鑒別(理化鑒別、光譜鑒別、色譜鑒別和色譜-光譜聯(lián)用鑒別)四個(gè)方面，對(duì)近10年來國(guó)內(nèi)外冬蟲夏草真?zhèn)舞b別方法研究文獻(xiàn)進(jìn)行了概括和總結(jié)，為市場(chǎng)上冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別提供科學(xué)參考依據(jù)。

冬蟲夏草；性狀鑒別；顯微鑒別；分子生物學(xué)鑒別；化學(xué)鑒別

冬蟲夏草為傳統(tǒng)名貴中藥，具有補(bǔ)肺益腎，止血化痰的功效，主治腎虛精虧、陽(yáng)痿遺精、腰膝疼痛、久咳虛喘和勞嗽咳血[1]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果顯示，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲勞和降血糖等多種藥理作用[2]。近年來，由于亂采濫挖，生態(tài)環(huán)境受損、菌源枯竭、冬蟲夏草資源瀕臨滅絕。有學(xué)者調(diào)查研究表明，青海、西藏、四川和云南等省區(qū)大部分地區(qū)蟲草的產(chǎn)量不到25年前的10%，甚至有些原來資源分布密集區(qū)近年沒有發(fā)現(xiàn)蟲草生長(zhǎng)[3]。由于冬蟲夏草確切的臨床功效和資源的稀缺，導(dǎo)致冬蟲夏草的價(jià)格不斷上漲，堪比黃金[4]，從20世紀(jì)70年代的36元·kg-1，到現(xiàn)在的20萬(wàn)元·kg-1左右，最貴已達(dá)80萬(wàn)元·kg-1。由于現(xiàn)階段冬蟲夏草價(jià)格的昂貴和資源的稀缺，市場(chǎng)上蟲草產(chǎn)品以次充好、以假亂真的現(xiàn)象大量存在，這對(duì)其臨床療效和用藥安全造成了嚴(yán)重的影響[5]，因此冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別研究對(duì)保證其用藥的安全性和有效性尤為重要。前期已有文獻(xiàn)對(duì)冬蟲夏草鑒別方法進(jìn)行了概述[6-7]，本文在已有文獻(xiàn)綜述的基礎(chǔ)上對(duì)國(guó)內(nèi)外近10年來冬蟲夏草真?zhèn)舞b別方法進(jìn)行了系統(tǒng)的歸納總結(jié)，為廣大消費(fèi)者和科研工作者提供科學(xué)參考。根據(jù)中藥鑒定學(xué)方法分類[8-9]，冬蟲夏草鑒別方法可以分為性狀鑒別、顯微鑒別、分子生物學(xué)鑒別和化學(xué)鑒別，現(xiàn)分述如下。

1 性狀鑒別

冬蟲夏草性狀鑒別一般是從樣品的蟲體色澤、眼睛顏色、環(huán)紋數(shù)以及“一寬三狹的結(jié)構(gòu)”、腹足和子座著生位置、子座表面結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)短、數(shù)量以及樣品氣味等特征進(jìn)行觀察比較。本文根據(jù)文獻(xiàn)記載[5-6，10-19]，分析總結(jié)出了冬蟲夏草性狀鑒別的以下特征：①蟲體的體表呈深黃色至黃棕色，頭部呈紅棕色。②蟲體環(huán)紋20～30個(gè)，1～7腹節(jié)存在“一寬三窄”結(jié)構(gòu)。足8對(duì)，中部4對(duì)較明顯。③蟲體質(zhì)脆易斷，斷面黃白色，中間會(huì)存在一個(gè)黑色“V”字或黑色圓點(diǎn)。④子座表面深棕色至棕褐色，從寄主頂部正上方發(fā)出，呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，長(zhǎng)4～7cm，直徑約0.3～0.8cm。⑤氣微腥，味微苦。上部稍膨大，有細(xì)縱皺紋，質(zhì)地柔軟。以上冬蟲夏草鑒別點(diǎn)能夠?qū)Χx夏草和其常見的偽品(亞香棒蟲草、蟬花、蛹蟲草、分枝蟲草、新疆蟲草、涼山蟲草、香棒蟲草、珊瑚蟲草)進(jìn)行有效區(qū)分，但是很多時(shí)候?qū)Χx夏草了解不深入的大眾消費(fèi)者來說，有些高度相似的偽品在形態(tài)鑒別方面存在一定的困難，更有造假者將混淆品或者偽品進(jìn)行加工，使它們和真品冬蟲夏草形態(tài)更為接近，這無(wú)形中又增加了鑒別的難度。故一般需要結(jié)合其他分析鑒定技術(shù)進(jìn)行鑒別。

2 顯微鑒別

顯微鑒別是中藥鑒定領(lǐng)域很常用的技術(shù)，冬蟲夏草的顯微鑒別一般是利用光學(xué)或電子顯微鏡對(duì)樣品體壁剛毛、絨毛、環(huán)紋、腹足、子囊殼等結(jié)構(gòu)的顯微/亞顯微特征進(jìn)行觀察和比較。

冬蟲夏草顯微結(jié)構(gòu)：冬蟲夏草切片后顯微觀察，與其他偽蟲草樣品在體壁細(xì)胞的表面觀、側(cè)面觀、體表剛毛、子囊殼著生位置等顯微結(jié)構(gòu)上也存在顯著的差異，如冬蟲夏草體壁細(xì)胞表面觀顏色呈淡黃至黃色，側(cè)面觀可見叢生刺狀毛；體表剛毛呈黃橙色，眼睫毛狀，不規(guī)則排列，頂端鈍圓，基部漸闊，有些上部略呈鉤狀；子囊殼半埋生，可以根據(jù)這些特征對(duì)冬蟲夏草及其偽品進(jìn)行鑒別[12，15-16，18]。

粉末顯微結(jié)構(gòu)：蟲草純粉片、蟲草膠囊等粉末制品充斥市場(chǎng)，不法商販為了獲取巨大利潤(rùn)向蟲草粉末制品中添加含淀粉的植物粉末、不明蟲卵粉末、偽蟲草粉末等，以此獲高額利潤(rùn)。粉末制品肉眼無(wú)法鑒別，顯微鏡檢能夠辨認(rèn)細(xì)小的冬蟲夏草粉末和雜質(zhì)[20]。冬蟲夏草蟲體體壁粉末碎片表面具小刺毛或圓形殘痕，團(tuán)塊狀物質(zhì)色澤呈黃色；毛片碎片呈淡黃色點(diǎn)狀，具環(huán)狀殘留毛窩；子囊殼呈卵圓形、半埋生的著生方式、邊緣色褐、子囊直徑10 μm左右等特征均可以作為冬蟲夏草粉末的鑒別特征，如果未發(fā)現(xiàn)粉末碎片呈現(xiàn)上述特征或摻雜有其他特征碎片的，比如子囊全埋生或者毛片碎片無(wú)淡黃色點(diǎn)狀等，則為偽品或摻偽品[21]。通過番紅-固綠染色、斯氏碘染色等染色方法也可以有效地對(duì)冬蟲夏草粉末進(jìn)行鑒別，如果每片均能清晰觀察到冬蟲夏草的特有結(jié)構(gòu)，且沒有碘液染色下的明顯藍(lán)色斑點(diǎn)，沒有觀測(cè)到明顯的植物組織，即可判斷為純冬蟲夏草粉，如果有藍(lán)色斑點(diǎn)則表明有淀粉類物質(zhì)混入[22]。

超微結(jié)構(gòu)：冬蟲夏草分離出的雜菌菌絲和中國(guó)被毛孢的超微結(jié)構(gòu)中都存在一個(gè)瓶形小梗的結(jié)構(gòu)，但是前者瓶形小梗呈圓形或橢圓形，后者呈鉆形；另外，瓶形小梗著生方式也不同，前者為單生或者頂生而后者為單生或輪生[23-24]。根據(jù)以上結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以區(qū)分冬蟲夏草中分離的雜菌和中國(guó)被毛孢菌絲體。Noriko Kinjo等[25]對(duì)冬蟲夏草子囊超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，干蟲草標(biāo)本子囊殼呈球形或花瓶形、密集排列，擬薄壁組織厚，子囊柱形、基部窄；鮮蟲草標(biāo)本子囊透明，4個(gè)子囊孢子平行排列在一個(gè)子囊，呈圓柱體，子囊孢子纖維狀、柱形、光滑具膜，以上特征均可以作為冬蟲夏草鑒別特征。

3 分子生物學(xué)鑒別

傳統(tǒng)的性狀和顯微鑒定方法是建立在個(gè)體形態(tài)描述和微觀觀測(cè)的水平上，得到的結(jié)論往往不完善。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，中藥鑒定方法逐漸過渡到分子生物學(xué)鑒定[26]。中藥分子鑒定一般是指依據(jù)核酸或蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)特征的鑒定，具有不受外界因素及生物體發(fā)育階段的影響，具有準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。按照鑒定特征可分為核酸分子鑒定和蛋白質(zhì)分子鑒定。DNA分子鑒定技術(shù)是目前應(yīng)用較為廣泛的中藥生物分子鑒定方法。

3.1 DNA分子鑒定

中藥DNA分子鑒定主要是基于核酸序列分析、分子雜交信號(hào)、PCR擴(kuò)增指紋圖譜的三大DNA鑒定技術(shù)體系[27]，基于DNA分子技術(shù)的鑒定在蟲草中主要有以下幾個(gè)方面。

3.1.1 基于ITS序列的條形碼技術(shù) DNA條形碼技術(shù)是指利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA片段作為物種標(biāo)記而建立的一種生物鑒定方法，Paul Hebert等[28]將DNA條形碼技術(shù)運(yùn)用于物種鑒定。翁榕安等[29]對(duì)冬蟲夏草和其混淆品北蟲草在分子水平進(jìn)行了鑒別，提取兩者DNA后使用PCR法進(jìn)行DNA ITS測(cè)序發(fā)現(xiàn)，兩者在ITS序列上有顯著的差異，其中ITS1差異性達(dá)到33.31%，ITS2差異性達(dá)到26.26%。鐘欣等[30]采用通用引物ITS5/ITS4對(duì)冬蟲夏草、亞香棒蟲草和蛹蟲草中提取的核糖體基因(rDNA)進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，亞香棒蟲草與冬蟲夏草在ITS5/ITS4區(qū)間序列的相似度僅為80.5～81%，蛹蟲草與冬蟲夏草在該區(qū)間序列的相似度為80.8～81.3%。Chen Yue-Qin等[31]對(duì)冬蟲夏草和各種偽品進(jìn)行核酸序列分析(包括ITS1，ITS2和5.8S rRNA編碼區(qū))發(fā)現(xiàn)各個(gè)不同產(chǎn)地的冬蟲夏草在ITS序列區(qū)間具有很高的同源性，其序列之間的距離值低于0.02，然而蛹蟲草、古尼蟲草和擬青霉分生孢子與冬蟲夏草有很大的差異，序列間的距離值為0.25～0.33。將ITS區(qū)序列作為DNA條形碼比對(duì)區(qū)，能夠很好地將冬蟲夏草和其混偽品鑒別開來[32-33]。Xiang Li等[34]對(duì)冬蟲夏草和羅伯茨蟲草、下垂蟲草、蟬花、蛹蟲草、古尼蟲草等多種偽蟲草進(jìn)行了DNA條形碼分析，它們之間在ITS序列上存在很大的差異，也證實(shí)了DNA條形碼技術(shù)能對(duì)冬蟲夏草及其混淆品、近緣種能夠進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地鑒別。此外，無(wú)性型和交配型冬蟲夏草也可以通過ITS序列和5.8S rRNA序列上的差異進(jìn)行比對(duì)鑒別[35-39]。

3.1.2 基于PCR分子鑒定技術(shù) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)之上以任意核苷酸序列為引物(通常為10個(gè)堿基)，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳得到圖譜。根據(jù)圖譜的DNA多態(tài)性信息可以對(duì)中藥進(jìn)行鑒定和分類。Feng K等[40]利用RAPD技術(shù)對(duì)冬蟲夏草的子座、菌核、菌絲體以及分離得到的真菌進(jìn)行了比對(duì)，篩選到了一個(gè)特異性高、圖譜特征穩(wěn)定的隨機(jī)引物，能夠進(jìn)行很好的區(qū)分分離得到的不同真菌。利用該段隨機(jī)引物能夠在冬蟲夏草中擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約350 bp的特異性條帶，而新疆蟲草、亞香棒蟲草、北蟲草都沒有該條帶，藉此可以對(duì)這些偽品進(jìn)行很好的鑒定。RAPD技術(shù)可以快速并且提供大量的多態(tài)性數(shù)據(jù)，但是最大缺陷在于其再現(xiàn)性相對(duì)較差[41]。

PCR-SSCP(PCR-single-strand conformation polymor-phism)是Shuiji Hoshino[42]等在SSCP分析法基礎(chǔ)上用敏感的銀染法代替放射性同位素標(biāo)記的改進(jìn)技術(shù)，從而增強(qiáng)了安全性，實(shí)用性。利用該技術(shù)，可以對(duì)基于ITS2和18S rRNA PCR的產(chǎn)物將冬蟲夏草和紅座蟲草、金龜子蟲草、擬蛹蟲草以及其他三種不知名近緣種等6種偽品進(jìn)行了很好的鑒定區(qū)分[43]。另外利用該技術(shù)可以確定不同地域的冬蟲夏草遺傳的多樣性和冬蟲夏草子座、菌核、菌絲體的真菌群落組成的多樣性，這些均為冬蟲夏草的鑒別提供了參考[44-45]。該技術(shù)分析核酸片段大于300 bp靈敏度會(huì)下降，假陽(yáng)性結(jié)果的不可避免，易受各種外界環(huán)境的影響，如游離引物、凝膠的濃度、厚度、溫度，故利用此種技術(shù)進(jìn)行鑒定，還需要繼續(xù)研究和改良[46-47]。

3.1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法鑒定 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是利用4種特異引物針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域，用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件完成核酸擴(kuò)增的方法。李奎等[48]通過特異性靶序列的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物實(shí)現(xiàn)了冬蟲夏草特異性擴(kuò)增，而其他偽蟲草無(wú)交叉反應(yīng)，由此可以將冬蟲夏草和其混偽品鑒別開來。該檢測(cè)可以便捷、準(zhǔn)確地對(duì)冬蟲夏草進(jìn)行檢測(cè)，適于基層推廣[49]。

3.2 蛋白質(zhì)免疫鑒定

蛋白質(zhì)免疫鑒定是利用中草藥中抗原類物質(zhì)，制備特異性抗體，采用免疫酶聯(lián)吸附法、抗體酶免疫試驗(yàn)等免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行中藥鑒別。李楊[50]提取了冬蟲夏草特異性蛋白，制備特異性多克隆抗體，采用金標(biāo)法檢測(cè)冬蟲夏草抗原，利用該法對(duì)冬蟲夏草做出了準(zhǔn)確的鑒定，檢測(cè)靈敏度達(dá)到20 ng·mL-1。

4 化學(xué)鑒別

4.1 一般理化鑒別

冬蟲夏草的一般理化鑒別主要是根據(jù)其中所含化學(xué)成分能與某些化學(xué)試劑產(chǎn)生特殊顏色或者在紫外下觀察發(fā)出熒光等進(jìn)行鑒別，也有物理方法如沉淀法、升華法和結(jié)晶法。傅道珍[51]對(duì)冬蟲夏草與新疆蟲草、亞香棒蟲草、地蠶與淀粉人工偽制品進(jìn)行了詳細(xì)的理化比較分析。冬蟲夏草的酸性醇提物在紫外燈(365nm)下觀察發(fā)淡藍(lán)色熒光，亞香棒蟲草發(fā)黃綠色熒光，地蠶發(fā)鮮紫熒光，新疆蟲草和人工偽制品無(wú)熒光。冬蟲夏草水浸提液在紫外燈(365 nm)下觀察發(fā)黃藍(lán)色熒光，亞香棒蟲草發(fā)淡黃綠熒光，地蠶發(fā)青黃熒光，新疆蟲草和人工偽制品無(wú)熒光。此外也比較了冬蟲夏草與這些偽品在化學(xué)顯色上的差異，冬蟲夏草的甲醇提取物與鋅粉沸水浴之后，正品不顯紅色，偽品顯紅色。

4.2 光譜鑒別

4.2.1 紫外光譜鑒定技術(shù) 紫外-可見光吸收光譜是一種常見的光譜分析方法，利用某種溶劑對(duì)中草藥進(jìn)行提取之后，采用紫外光譜測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的吸光度或者光譜圖，根據(jù)吸收值或光譜圖上的特征，可對(duì)中藥材進(jìn)行鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)。殷仁亭[52]的研究表明，冬蟲夏草在200～400 nm波段有4個(gè)特征吸收峰，而亞香棒蟲草只有2個(gè)，藉此可以鑒別。顧崢嶸等[53]利用紫外吸收光譜對(duì)蟲草偽品進(jìn)行了鑒別，發(fā)現(xiàn)正品蟲草紫外吸收光譜在259 nm和309 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，偽品(染色金針菜套在蟲體頭部干燥偽制而成)在259 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，在309 nm波長(zhǎng)處無(wú)最大吸收峰。高明等[16]利用紫外吸收光譜對(duì)冬蟲夏草和湖北蟲草在200～300 nm處的最大吸收峰進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示冬蟲夏草在區(qū)間內(nèi)具兩個(gè)吸收峰，而湖北蟲草具三個(gè)吸收峰。

4.2.2 紅外光譜鑒定技術(shù) 紅外光譜按照波長(zhǎng)范圍的不同可分為近紅外光譜(NIR)、中紅外光譜(MIR)和遠(yuǎn)紅外光譜(FIR)，尤以中紅外光譜技術(shù)最為成熟、應(yīng)用最為廣泛，中藥材鑒定即是其重要的應(yīng)用領(lǐng)域[8]。該技術(shù)能夠反映樣品的整體化學(xué)信息，實(shí)現(xiàn)各種形態(tài)樣品的快速無(wú)損檢測(cè)，且不需要進(jìn)行提取分離等前處理過程。王宜祥等[54]利用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)冬蟲夏草和古尼蟲草進(jìn)行了比較分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冬蟲夏草與古尼蟲草的子座上部外表皮紅外光譜差異很大，冬蟲夏草在777 cm-1、1 671 cm-1兩處具吸收峰，古尼蟲草在766 cm-1、1 675 cm-1兩處具吸收峰，且在1 675 cm-1處得吸收峰較冬蟲夏草在1 671 cm-1處吸收峰強(qiáng)度要弱得多；古尼蟲草在1 025和1 087 cm-1處具兩個(gè)尖峰，其在其兩側(cè)1 191和936 cm-1處具兩個(gè)小的吸收峰，而冬蟲夏草均無(wú)；另外古尼蟲草在895、873 cm-1處具雙峰，在714、1 316、1 388 cm-1處均具有吸收峰，而冬蟲夏草僅在1 338 cm-1處具有一個(gè)弱的吸收峰。根據(jù)以上特征峰差異可以鑒別冬蟲夏草和古尼蟲草。宋文軍等[55]比較了不同產(chǎn)地野生冬蟲夏草和偽蟲草在紅外圖譜上的差異，發(fā)現(xiàn)偽蟲草中脂類、蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)對(duì)應(yīng)的峰值處較正品冬蟲夏草弱，同時(shí)，偽品蟲草在1 711 cm-1處有羧酸強(qiáng)吸收峰，而真品冬蟲夏草的紅外譜圖中沒有此吸收峰，從而導(dǎo)致其峰形和冬蟲夏草不同。Yang Ping等[56]人對(duì)青海和西藏冬蟲夏草和地蠶、甘露子兩種偽蟲草的紅外光譜進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩地產(chǎn)的冬蟲夏草與偽蟲草的一級(jí)紅外圖譜沒有很大的差異，相似系數(shù)的比較沒有明顯的區(qū)別，只是偽蟲草較真品吸收峰弱。但是兩種偽蟲草與青海、西藏產(chǎn)地正品冬蟲夏草在二階導(dǎo)數(shù)圖譜上存在顯著的差異，兩種偽蟲草在1 400～1 700 cm-1之間不存在顯著的峰值，而正品蟲草則存在數(shù)個(gè)顯著的峰值，可以據(jù)此做出清晰的鑒別。

近紅外光譜亦可用于蟲草鑒定，但由于存在譜圖影響因素多、背景復(fù)雜、譜峰重疊等限制，應(yīng)用較少[8]。王鋼力等[57]利用近紅外光譜技術(shù)比較了青海和其他產(chǎn)地102批冬蟲夏草樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示近紅外光譜技術(shù)能夠較好地顯示出青海產(chǎn)藥材和其他產(chǎn)地藥材的差異，準(zhǔn)確率高達(dá)95%以上，該技術(shù)可以作為鑒別冬蟲夏草的技術(shù)模型。

4.2.3 核磁共振鑒定技術(shù) 中藥的核磁共振指紋圖譜是一種綜合的、整體的鑒定手段，可以用于中藥材真?zhèn)舞b別，具有高度的重現(xiàn)性和特征性。陳暢等[58]利用核磁共振技術(shù)，分別比較了冬蟲夏草和蒙山九州蟲草的醇提取物、水提取物的1HNMR圖譜，蒙山九州蟲草醇提取物核磁共振圖譜在7.2 ppm處有峰而冬蟲夏草沒有；蒙山九州蟲草水提取物核磁共振圖譜在4.1～4.3 ppm處存在一個(gè)冬蟲夏草沒有的峰，而冬蟲夏草在4.8-4.9 ppm處的峰蒙山九州蟲草不存在，這些顯著的差異能夠?qū)Χx夏草和九州蟲草進(jìn)行有效地鑒別。

4.3 色譜鑒別

4.3.1 薄層色譜 薄層色譜鑒別適合于組成成分復(fù)雜的中草藥鑒別，可以在一塊層析板上進(jìn)行多個(gè)樣品的分析，它具有分離和鑒定的雙重作用。傅道珍[51]等建立了一種薄層層析方法，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草樣本在層析板上出現(xiàn)了8個(gè)紫紅色斑點(diǎn)，而新疆蟲草樣本則出現(xiàn)了6個(gè)、亞香棒蟲草樣本沒有紫色斑點(diǎn)，據(jù)此可以對(duì)新疆蟲草和亞香棒蟲草進(jìn)行鑒別。顧崢嶸[53]等報(bào)道冬蟲夏草在薄層層析板上具有尿苷斑點(diǎn)，偽品(染色金針菜套在蟲體頭部干燥偽制而成)無(wú)尿苷斑點(diǎn)，可以據(jù)此進(jìn)行鑒別。朱國(guó)強(qiáng)等[59]將冬蟲夏草及其混偽品利用薄層層析方法進(jìn)行了分析研究，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草及其偽品的甲醇浸出液薄層層析結(jié)果有顯著的差異，冬蟲夏草和蛹蟲草斑點(diǎn)數(shù)目為6個(gè)，其他偽品亞香棒蟲草、涼山蟲草、分枝蟲草、蛹蟲草、地蠶、人工蟲草的斑點(diǎn)數(shù)1～5個(gè)不等；冬蟲夏草最前方的斑點(diǎn)相對(duì)距離大于其他偽品，前兩個(gè)斑點(diǎn)之間的距離較遠(yuǎn)，后5個(gè)斑點(diǎn)彼此間距大致相同，約為前兩個(gè)斑點(diǎn)間距的1/2，蛹蟲草6個(gè)斑點(diǎn)之間距離大致相同，由這些特征性差異可以對(duì)冬蟲夏草和上述混偽品進(jìn)行鑒別。

4.3.2 電泳色譜 電泳法鑒別中藥的原理是利用中藥中含有的帶電荷的成分在同一電場(chǎng)作用下，各組分所帶電荷的性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子質(zhì)量的不同導(dǎo)致泳動(dòng)方向和速度的差異，可以結(jié)合譜帶條數(shù)和染色的不同達(dá)到分離鑒定的目的。傅道珍等[51]報(bào)道了運(yùn)用電泳色譜可以鑒別冬蟲夏草與新疆蟲草、亞香棒蟲草和地蠶。結(jié)果顯示，新疆蟲草有2條一級(jí)譜帶，冬蟲夏草只有1條一級(jí)譜帶；亞香棒蟲草有4條二級(jí)譜帶，冬蟲夏草有3條二級(jí)譜帶，新疆蟲草和地蠶均只有1條二級(jí)譜帶；冬蟲夏草沒有顯示三級(jí)蛋白電泳圖譜條帶，而其他三種偽品均有1～2條三級(jí)譜帶，由以上三級(jí)譜帶數(shù)的差異可成功鑒別出冬蟲夏草與幾種偽品。呂鵬等[60]利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)方法對(duì)冬蟲夏草、蛹蟲草、蒙山瘤座蟲草進(jìn)行了鑒別分析，冬蟲夏草在2.56～4.29 min處有一個(gè)明顯特征吸收峰，而蛹蟲草和蒙山瘤座蟲草在對(duì)應(yīng)的時(shí)間均無(wú)明顯特征吸收峰，藉此差異可以進(jìn)行有效地鑒別。古今等[61]利用高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)對(duì)冬蟲夏草、亞香棒蟲草和地蠶三者的Tris-甘氨酸和堿性、酸性蛋白所進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示Tris-甘氨酸提取液中，冬蟲夏草在7.048 min處具有特征吸收峰；堿性蛋白質(zhì)提取液中，冬蟲夏草在3.725和9.243 min處具特征吸收峰；酸性蛋白質(zhì)提取液中，5.700和9.875 min處為冬蟲夏草特有吸收峰。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HPEC對(duì)冬蟲夏草及其偽品能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，該方法具分辨率高、速度快、需樣品量少等優(yōu)點(diǎn)。劉玉軍等[62]利用毛細(xì)管電泳法測(cè)定了冬蟲夏草和人工蛹蟲草中核苷、堿基的含量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示人工蛹蟲草蟲草素含量高達(dá)4 581.8 μg·g-1，冬蟲夏草中不能測(cè)出，冬蟲夏草中測(cè)出次黃嘌呤為118.5 μg·g-1，而人工蛹蟲草中未測(cè)出該物質(zhì)含量，因此根據(jù)人工蛹蟲草與天然蟲草核苷及堿基成分在含量上的差異，可以高效快速的鑒別蛹蟲草與冬蟲夏草。

4.3.3 高效液相色譜 高效液相色譜(HPLC)是一種高效快速的分離分析技術(shù)，在中藥領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用，對(duì)中藥有效成分建立指紋圖譜進(jìn)行分析是中藥鑒別和質(zhì)量控制常用方法。鐘欣等[30]比對(duì)了冬蟲夏草和亞香棒蟲草的HPLC指紋圖譜，兩者圖譜的相似度低于47.9%，對(duì)這兩種蟲草能起到鑒別作用。欒蘭等[63]對(duì)野生冬蟲夏草與蟲草發(fā)酵菌絲體進(jìn)行了HPLC指紋圖譜比較研究，兩者在高極性物質(zhì)成分方面相似，在低極性成分方面有較大的差異，可以對(duì)冬蟲夏草和菌絲體進(jìn)行鑒別。賴宇紅等[64]對(duì)冬蟲夏草與分枝蟲草、亞香棒蟲草、涼山蟲草和人工培植的蟲草花進(jìn)行了HPLC指紋圖譜比較，采用相似度評(píng)價(jià)和輪廓圖、雷達(dá)圖、星座圖等多變量二維平面比對(duì)分析，結(jié)果顯示冬蟲夏草與偽品在水溶性成分方面存在很大的差異，可以對(duì)這些偽品進(jìn)行有效鑒別。國(guó)錦琳等[65]利用HPLC測(cè)定了10批涼山蟲草的腺苷含量，發(fā)現(xiàn)涼山蟲草比冬蟲夏草中腺苷含量相比要低，可以作為涼山蟲草和冬蟲夏草的鑒別依據(jù)。周枝鳳等[66]進(jìn)行了蠶蛹蟲草與冬蟲夏草水溶液成分的HPLC指紋圖譜中相應(yīng)化學(xué)組分的歸屬分析，發(fā)現(xiàn)蠶蛹蟲草和冬蟲夏草有5個(gè)共有組分，分別有4個(gè)和6個(gè)相異組分，可以有效地對(duì)兩者進(jìn)行鑒別。Wang Shuang等[67]綜合HPLC二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和蒸發(fā)光散射耦合法(ELSD)定性定量分析了野生蟲草和人工蟲草中的核苷和堿基、糖類、多球殼菌素等12種組分，分析結(jié)果顯示含糖量的多寡也可以用作冬蟲夏草鑒偽。

4.4 色譜光譜聯(lián)用鑒定技術(shù)

色譜-光譜聯(lián)用鑒定技術(shù)是將高效分離性能的色譜技術(shù)與能獲取化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息的光譜技術(shù)相結(jié)合形成的中藥鑒定技術(shù)。常用的聯(lián)用技術(shù)有高效液相-質(zhì)譜法(HPLC-MS)、氣相-質(zhì)譜法(GC-MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法(EC-MS)。錢正明等[68]采用高效液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-QTOF/MS)建立了冬蟲夏草高效液相特征圖譜，該方法分別從冬蟲夏草中鑒定了9個(gè)化學(xué)成分，北蟲草中鑒定了8個(gè)化學(xué)成分，其中蟲草素、脫氧鳥苷可作為冬蟲夏草和北蟲草的鑒別成分。陳林琤等[69]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)蟲草子實(shí)體、中國(guó)被毛孢菌絲體、蛹蟲草和蝙蝠蛾擬青霉中的麥角甾醇及其衍生物進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蟲草子座中含有2種HI-A衍生物，菌絲體中含有5種H1-A衍生物，而在蟲草菌核、蛹蟲草和擬青霉中沒有檢測(cè)到H1-A衍生物，可以根據(jù)麥角甾醇衍生物的差異對(duì)蟲草菌絲體、蛹蟲草和擬青霉進(jìn)行區(qū)分。Guan Jia等[70]運(yùn)用GC/MS技術(shù)對(duì)冬蟲夏草、人工蟲草和蛹蟲草中的游離和聚合糖類物質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，野生冬蟲夏草中游離甘露醇的含量超過7.99%，而在人工蟲草和蛹蟲草中含量小于5.83%，同時(shí)結(jié)合聚類分析可以對(duì)野生和人工蟲草進(jìn)行區(qū)分。Yang等[71]運(yùn)用CE/MS技術(shù)對(duì)冬蟲夏草、人工蟲草和蛹蟲草中的12種核苷和堿基進(jìn)行了分析，分析結(jié)果表明，蟲草素為蛹蟲草特有成分，冬蟲夏草中次黃嘌呤和肌苷的含量比人工蟲草和蛹蟲草高很多。

5 小結(jié)

冬蟲夏草作為珍稀名貴藥材，市場(chǎng)上以假亂真的手段層出不窮，為冬蟲夏草的質(zhì)量控制帶來了很大的挑戰(zhàn)，為了規(guī)范市場(chǎng)秩序和保障用藥安全，對(duì)其快速有效的鑒別非常重要。本文從形態(tài)、顯微、化學(xué)及分子生物鑒別這4個(gè)方面，綜述了近十年以來的國(guó)內(nèi)外冬蟲夏草鑒別方法的研究進(jìn)展。但隨著新技術(shù)的發(fā)展和分子生物學(xué)在中藥領(lǐng)域研究的深入，必然會(huì)有更加高效、準(zhǔn)確的方法應(yīng)用于冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別，以保證其臨床用藥的準(zhǔn)確性。

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AdvancesinIdentificationMethodofCordyceps

LI Wenjia1，WANG Xiaodong1，AI Zhong1，QIAN Zhengming1*，XIANG Li2，ZHANG Xiaojing1

(1.HECPharmCo.，Ltd，Guangdong，Dongguan523850，China)(2.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Cordyceps，a valued Chinese medicine，in recent years because of the crazy digging makes its resources on the verge of extinction.The price of Cordyceps is becoming higher than gold.Due to the high price，counterfeits in the market are becoming more and more common.This article is a review of advances in identification method of Cordyceps and its counterfeits from view of morphology，microscopy，molecular biology and chemistry(including physicochemical property，spectrum analysis，chromatogram and spectrum-chromatogram identification).This review referred to recent ten years literatures and attempted to make a scientific reference for identification of Cordyceps in the market.

Cordyceps；morphology identification；microscopic identification；chemical identification；molecular biology identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.002

2014-10-05)

國(guó)家工信部中藥材扶持項(xiàng)目：仿生態(tài)栽培冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)基地，負(fù)責(zé)人：華獻(xiàn)春

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錢正明，博士，主要研究方向：中藥和食品質(zhì)量控制。E-mail：qianzhengming@hecpharm.com