淺析口蹄疫阻斷ELISA 試驗(yàn)中易出現(xiàn)的問題及其糾正措施

徐振浩，王巖梅

（山東省青島市即墨區(qū)動物疫病預(yù)防與控制中心，山東 青島 266200）

ELISA 試驗(yàn)是目前基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的檢測方法，常用于口蹄疫、豬瘟等疫病的抗體效價(jià)測定，以及口蹄疫病、豬瘟等疫病的流行病學(xué)的調(diào)查、疫病診斷、防疫檢測、免疫程序制定等工作中。該試驗(yàn)操作要求取量精確，操作熟練，讀數(shù)及時(shí)，試驗(yàn)環(huán)境溫度適宜恒定，儀器設(shè)備計(jì)量準(zhǔn)確等。在試驗(yàn)操作過程中，稍有失誤就會使試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，試驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確或試驗(yàn)失敗。筆者通過長期的檢測工作，總結(jié)了試驗(yàn)中易出現(xiàn)的問題，并提出糾正措施，供實(shí)驗(yàn)室人員參考。

1 人員方面易出現(xiàn)的問題

1.1 操作人員技術(shù)水平低

實(shí)驗(yàn)室未按照人員培訓(xùn)程序要求進(jìn)行崗前操作技能的培訓(xùn)，導(dǎo)致在試驗(yàn)中試劑取量不準(zhǔn)確，容易導(dǎo)致監(jiān)測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確或試驗(yàn)失敗。

1.2 對實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程不熟練

操作人員不熟練掌握ELISA 檢測試劑盒說明書，不能精準(zhǔn)掌握反應(yīng)時(shí)間，易出現(xiàn)檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。

2 儀器設(shè)備方面易出現(xiàn)的問題

常見移液器和酶標(biāo)儀不檢測校準(zhǔn)或酶標(biāo)儀讀數(shù)錯誤。ELISA 試驗(yàn)取樣微量，要求取量精確、移液器和酶標(biāo)儀儀器精準(zhǔn)、計(jì)量精確，試驗(yàn)結(jié)果才能準(zhǔn)確，否則難以確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 操作過程中易出現(xiàn)的問題

3.1 加樣過程常出現(xiàn)的問題

（1）每次加不同標(biāo)本時(shí)不更換槍頭，易發(fā)生交叉污染。（2）加樣時(shí)速度太快，將標(biāo)本加在孔壁上部或?yàn)R出或產(chǎn)生氣泡。（3）為了防止操作時(shí)差對結(jié)果的影響，使用血清稀釋板先把血清稀釋好，再轉(zhuǎn)移到檢測板子中，加樣時(shí)對稀釋后的血清不吹打混勻。（4）在加酶結(jié)合物和顯色液時(shí)，由于檢測樣品過多且使用單道移液器，造成加樣間隔時(shí)間過長，使加液過程不能迅速完成。

3.2 溫育過程常出現(xiàn)的問題

3.2.1 溫育板上不加蓋 抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育。溫育過程在ELISA 檢測中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。溫育常采用的溫度有43 ℃、37 ℃、室溫等。37 ℃ 是實(shí)驗(yàn)室中常用的溫育溫度，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋或用塑料貼紙覆蓋板孔（FMD-3ABC 和CSFV 試劑盒）。在試驗(yàn)操作過程中往往板上不加蓋。

3.2.2 反應(yīng)板疊放 溫育過程中，若要求室溫溫育，則一般是指20～25 ℃。室溫溫育中經(jīng)常出現(xiàn)將反應(yīng)板疊放現(xiàn)象，將難以保證各板的溫度都能迅速平衡。

3.3 洗滌過程常出現(xiàn)的問題

3.3.1 洗滌次數(shù)不按說明書要求 洗滌目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分、未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌時(shí)不按照說明書要求洗滌次數(shù)進(jìn)行洗滌。

3.3.2 洗滌操作不規(guī)范 洗滌可采用洗板機(jī)或手工洗滌兩種方式，無論洗板方式如何，洗滌操作應(yīng)規(guī)范，在向板孔內(nèi)注液時(shí)出現(xiàn)氣泡殘留孔內(nèi)，因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。

3.4 顯色過程常出現(xiàn)的問題

顯色是 ELISA 中的最后一步溫育反應(yīng)，在以HRP 作為標(biāo)記酶的ELISA 試劑盒中，主要采用TMB 和OPD 兩種底物，其中以TMB 最為多見，TMB 底物顯色一般要求室溫，如果升高或者降低反應(yīng)溫度均可影響檢測結(jié)果。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須固定顯色時(shí)間和溫度，但不少操作者往往忽略了這一點(diǎn)。

3.4.1 出現(xiàn)反應(yīng)板顯色淡，靈敏度偏低的原因（1）試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長或環(huán)境溫度太高。（2）試劑盒取出未充分平衡。（3）試劑盒以前使用過，使用次數(shù)過多。（4）使用了錯誤的標(biāo)記物。（5）試劑失效或不同批號的試劑混用。（6）實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)境溫度低或恒溫箱溫度不足37 ℃，溫育時(shí)間不足。（7）樣品保存時(shí)間過久或被反復(fù)凍融過。（8）洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過長，洗滌次數(shù)增加洗滌液配制不正確或使用了錯誤的洗滌液。（9）移液器吸液量不足，吸頭內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔。（10）底物作用時(shí)間不足。

3.4.2 出現(xiàn)反應(yīng)板背景深，非特異性反應(yīng)偏多的原因 （1）洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留，樣品被污染。（2）實(shí)驗(yàn)室的溫度過高，培養(yǎng)箱溫度超過37 ℃或溫育反應(yīng)時(shí)間過長。（3）不使用一次性吸頭，吸頭重復(fù)使用未洗凈或消毒不徹底。（4）稀釋用的蒸餾水被污染。（5）底物變質(zhì)或不同批次的試劑混用。（6）加樣時(shí)間太長，導(dǎo)致實(shí)際反應(yīng)時(shí)間延長。

3.4.3 出現(xiàn)白板，陽性對照不顯色的原因（1）顯色液變質(zhì)。（2）洗滌液配制有誤。（3）忘記加酶結(jié)合物或某個(gè)底物液。（4）終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂谩?/p>

4 應(yīng)采取的糾正措施

4.1 人員方面

（1）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開展ELISA 試驗(yàn)操作的培訓(xùn)，使每位實(shí)驗(yàn)操作者能夠熟練掌握檢測方法，熟悉檢測試劑盒使用說明書，避免操作的失誤。（2）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)做好年度質(zhì)量控制計(jì)劃，及時(shí)開展人員比對活動，提高實(shí)驗(yàn)員的操作技能。（3）實(shí)驗(yàn)室定期開展能力驗(yàn)證計(jì)劃，及時(shí)進(jìn)行有能力實(shí)驗(yàn)室之間比對或參加業(yè)務(wù)上級開展的實(shí)驗(yàn)室比對活動，來提高實(shí)驗(yàn)室檢測水平。

4.2 儀器設(shè)備方面

（1）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照儀器設(shè)備管理程序要求，認(rèn)真按照儀器設(shè)備操作規(guī)程操作，定期做好設(shè)備的維護(hù)。（2）應(yīng)按照儀器設(shè)備檢測和校準(zhǔn)計(jì)劃，定期將計(jì)量設(shè)備移液器和酶標(biāo)儀送到有資質(zhì)的計(jì)量單位進(jìn)行校準(zhǔn)。（3）有條件的實(shí)驗(yàn)室可采購多臺儀器設(shè)備，期間可按質(zhì)量控制計(jì)劃進(jìn)行儀器設(shè)備或?qū)嶒?yàn)室間的儀器設(shè)備結(jié)果比對，驗(yàn)證儀器設(shè)備的準(zhǔn)確性。

4.3 試驗(yàn)操作方面

（1）試劑盒在運(yùn)輸途中盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫。（2）實(shí)驗(yàn)前試劑盒從2～8 ℃ 冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20 min，確保所有試劑已平衡至室溫（約25 ℃）。（3）試劑盒使用前應(yīng)仔細(xì)查驗(yàn)，查看試劑盒從冰箱里拿出的次數(shù)，查看試劑盒是否曾在外界某個(gè)地方或極低的溫度下太長的時(shí)間。（4）為確保使用的標(biāo)記物來自試劑盒和批次是特異性的，避免每次倒出的試劑下次再使用或倒回原瓶，不要過早的將標(biāo)記物倒出。試劑失效或不同批號的試劑不能混用。（5）試劑盒使用后應(yīng)將使用過的板條及時(shí)廢棄，以免下次重復(fù)使用，未使用過的包被板，切記勿撕開上面的封膜。（6）應(yīng)保持室內(nèi)溫度在20～25 ℃ 內(nèi)，避免在熱源、直射光照下或通風(fēng)口旁邊操作。按試劑盒規(guī)定的時(shí)間溫育，準(zhǔn)確定時(shí)，不能過長或過短。調(diào)整恒溫箱溫度，使恒溫箱溫度保持37 ℃，避免溫度過高或過低，放入反應(yīng)板后盡量減少開啟次數(shù)以免影響溫度恒定。（7）樣品應(yīng)新鮮采集，低溫保存，應(yīng)避保存時(shí)間過久或被反復(fù)凍融過，血清樣品應(yīng)避免溶血。（8）校正移液器，吸頭要配套，盡可能使用一次性的，裝吸頭時(shí)要緊密，保證吸頭內(nèi)壁清潔，避免移液器吸液量不足或吸頭內(nèi)壁掛水太多。（9）確保使用試劑盒配置的洗滌液，標(biāo)明洗滌液以免誤用，每次加液前均應(yīng)看清各試劑的標(biāo)簽，避免洗滌次數(shù)增加、洗滌液配制不正確或使用了錯誤的洗滌液。濃縮洗液配制要準(zhǔn)確，如有結(jié)晶則應(yīng)讓結(jié)晶于室溫全部溶解后再量取稀釋，充分洗滌，徹底拍干。加酶標(biāo)記物后拍干用的濾紙不要反復(fù)使用，避免造成污染，注意不要漏加和忘記加酶結(jié)合物。（10）使用新鮮蒸餾水，避免稀釋用水被污染。（11）洗滌時(shí)按說明書要求的浸泡時(shí)間和洗滌次數(shù)進(jìn)行洗滌，避免沖擊力太大、浸泡時(shí)間過長。合理安排試驗(yàn)，如果一次試驗(yàn)的樣品量過多，可采用多道移液器或多人試驗(yàn)，盡可能避免加樣時(shí)間太長。（12）底物和顯色液應(yīng)避光保存，底物溶液使用時(shí)應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。底物在加到檢測板之前，應(yīng)檢查是否變藍(lán)，如出現(xiàn)變質(zhì)，棄去不用。（13）終止液不能作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂?，底物顯色終止后，盡量在30 min 內(nèi)進(jìn)行酶標(biāo)板讀值。酶標(biāo)儀讀數(shù)前應(yīng)檢查波長是否正確，檢驗(yàn)酶標(biāo)儀的校正和對準(zhǔn)燈。