長鏈非編碼 RNA 生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5在宮頸癌中的作用研究進(jìn)展

徐靜純，王 聰

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210029)

宮頸癌是女性第2大常見惡性腫瘤，也是全球第4大癌癥死亡原因，其病死率僅次于乳腺癌。約90%的宮頸癌病例發(fā)生在發(fā)展中國家，中國每年有超過 50 000例女性死于宮頸癌[1-4]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)，研究已證實(shí)HPV是引起宮頸癌和癌前病變的必要因素[5-8]。目前，對于宮頸癌的治療方式多采用手術(shù)、放射治療及輔助化學(xué)治療等方法，但患者的5 a生存率始終不盡如人意[9]。因此，進(jìn)一步研究宮頸癌的致病機(jī)制，對尋找新的藥物靶點(diǎn)和治療策略具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個(gè)核苷酸的RNA，雖然其沒有編碼蛋白質(zhì)的功能，但越來越多的研究表明，lncRNA與基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多種病理生理過程有關(guān)[10-12]。生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth arrest special 5，GAS5)是位于人染色體1q25位點(diǎn)的一個(gè)lncRNA，其與多種腫瘤的臨床病理特征如TNM 分期、組織學(xué)分級、腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等顯著相關(guān)[13-14]。當(dāng)GAS5表達(dá)下調(diào)時(shí)，可抑制結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌等多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-20]。有研究顯示，GAS5在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及治療中發(fā)揮重要作用[13,21-29]。本文就GAS5在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為宮頸癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供參考和方向。

1 GAS5 簡介

GAS5是從生長抑制細(xì)胞的減法雜交cDNA文庫中分離出來的屬于5′-終端帽子結(jié)構(gòu)家族的RNA成員，其位于與淋巴瘤相關(guān)的1q25位點(diǎn)。GAS5通過其內(nèi)含子發(fā)揮生物學(xué)功能，該內(nèi)含子可被轉(zhuǎn)錄為10個(gè)框式C/D小核仁RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)分子和2個(gè)成熟的lncRNA(GAS5a和GAS5b)[30-32]。GAS5具有短的開放閱讀框，但不能編碼蛋白質(zhì)，可作為snoRNA宿主基因來發(fā)揮生物學(xué)功能[33]。GAS5通過3種基本作用模式充當(dāng)基因調(diào)控元件：第1種是直接與靶基因結(jié)合；第2種為間接機(jī)制，涉及GAS5與調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合以及隨后的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控；第3種是次要的間接作用方式，即形成GAS5/蛋白質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)一步作為轉(zhuǎn)錄基因的調(diào)控元件[34]。

最初，研究者發(fā)現(xiàn)GAS5在人類T細(xì)胞中具有生物活性，并證實(shí)GAS5過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并使S期的細(xì)胞數(shù)量減少，而GAS5低表達(dá)時(shí)則結(jié)果相反，表明GAS5的過表達(dá)可抑制T細(xì)胞生長[35]。GAS5同樣影響正常組織的細(xì)胞周期進(jìn)程，因此對于正常細(xì)胞的生長停滯至關(guān)重要[36]。GAS5在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、食管癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌及腎細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，且這種異常表達(dá)與腫瘤大小、疾病分期和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[15-20,37-41]。其中在GAS5與宮頸癌的關(guān)系中,GAS5 可能與宮頸癌細(xì)胞的凋亡、增殖和侵襲及腫瘤放化療抵抗相關(guān)[13,21-25]。因此，GAS5 有望成為宮頸癌干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)。

2 GAS5 在宮頸癌組織中的表達(dá)

有研究表明，GAS5在多種生物過程中發(fā)揮重要作用，主要包括細(xì)胞生長和腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等[14,25]。CAO等[21]和YANG等[26]采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技術(shù)分析GAS5在宮頸癌組織中的表達(dá)，結(jié)果提示，宮頸癌組織中GAS5的表達(dá)水平顯著低于鄰近正常組織；同時(shí)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，GAS5表達(dá)水平與FIGO分期、血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的年齡、腫瘤大小、組織學(xué)和分化等其他參數(shù)無關(guān)。此外，生存分析發(fā)現(xiàn)，GAS5表達(dá)水平更低的宮頸癌患者總生存期明顯縮短[27]。

3 GAS5 表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響

為了評估GAS5在宮頸癌中的生物學(xué)作用，CAO等[21]采用四甲基偶氮唑鹽法(methylthiazolyl-tetrazolium，MTT)測定GAS5對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與非特異性小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)組相比，GAS5特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長速度顯著增加，即GAS5的下調(diào)會(huì)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖；此外，細(xì)胞傷口愈合測定和Transwell侵襲測定結(jié)果顯示，與非特異性siRNA組相比，GAS5特異性siRNA轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞的遷移率顯著上調(diào)，侵襲能力顯著增加。因此，GAS5的下調(diào)可能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。另外，YANG等[13]通過轉(zhuǎn)染GAS5的重組真核載體(protruding clustered DNA-GAS5,pcDNA-GAS5)成功建立了過表達(dá)GAS5的人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SiHa和人子宮頸表皮癌細(xì)胞ME-180，經(jīng)MTT檢測發(fā)現(xiàn)，GAS5的外源表達(dá)顯著抑制了SiHa和ME-180細(xì)胞活力,表明GAS5的過表達(dá)阻礙了宮頸癌細(xì)胞的生長。ZHANG等[28]為了分析GAS5在細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用，將pcDNA-GAS5和陰性對照物pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到C33A和HeLa宮頸癌細(xì)胞中，CCK-8分析結(jié)果顯示，GAS5的過表達(dá)顯著降低了C33A和HeLa宮頸癌細(xì)胞的增殖；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色證實(shí)，2種細(xì)胞系中的GAS5過表達(dá)均通過誘導(dǎo)凋亡進(jìn)而降低癌細(xì)胞的活力，隨后進(jìn)行的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙重染色進(jìn)一步證實(shí)，GAS5過表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖減少是由于誘導(dǎo)了癌細(xì)胞凋亡。研究者還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞的增殖降低是由于細(xì)胞周期蛋白B1水平下降引起GAS5過表達(dá)，從而誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯[28-29]。以上研究均表明，GAS5的低表達(dá)促進(jìn)了宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步表明GAS5 在宮頸癌中具有重要的基礎(chǔ)及臨床研究前景。

4 GAS5 的分子海綿作用

近年來RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析揭示，lncRNA在調(diào)控miRNA的表達(dá)和生物學(xué)功能方面發(fā)揮分子海綿的作用，即lncRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA吸附微RNA (microRNA,miRNA)，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[42-43]。 為了驗(yàn)證GAS5是否具有類似的功能，YANG等[26]應(yīng)用TargetScan、miRanda和DIANA等在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測相應(yīng)的miRNA，結(jié)果顯示，miR-196a和miR-205可能被GAS5吸附；為了進(jìn)一步驗(yàn)證GAS5是否可以與miR-196a和miR-205直接結(jié)合,其構(gòu)建了GAS5野生型和突變型熒光素酶載體，并分別與miR-196a或miR-205共轉(zhuǎn)染，通過熒光素酶報(bào)告基因測定、RNA免疫沉淀測定和qRT-PCR 分析結(jié)果證實(shí)，GAS5可充當(dāng)miR-196a和miR-205的分子海綿，通過吸附miR-196a和miR-205進(jìn)而下調(diào)其表達(dá)水平,從而使叉頭框蛋白O1和蛋白酪氨酸磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)表達(dá)升高，進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。有研究通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，GAS5和miR-106b存在潛在結(jié)合序列，并通過RNA免疫沉淀和RNA下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GAS5是miR-106b的分子海綿，其高表達(dá)可通過下調(diào)miR-106b來增強(qiáng)宮頸癌的放射治療敏感性[23,35]。

5 GAS5與宮頸癌的順鉑耐藥性

目前，宮頸癌的主要治療方法是根治性子宮切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)、放射治療、化學(xué)治療單獨(dú)或聯(lián)合使用。基于順鉑的同步放化療是局部晚期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[44]。研究發(fā)現(xiàn)，以順鉑為基礎(chǔ)的放化療后的鞏固化學(xué)治療可以降低宮頸癌患者遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率，并提高患者的總生存期和無進(jìn)展生存期[45]。然而，在宮頸癌治療期間，順鉑的耐藥性極大地限制了其臨床應(yīng)用和療效[46]。為了研究GAS5表達(dá)對順鉑耐藥性的影響，溫啟榮[25]和WEN等[47]在不同濃度梯度的順鉑(1、2、3、4、5、6、10、15、 30 mg·L-1)處理后的宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)或沉默GAS5和miR-21，并分別檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果表明，GAS5和miR-21可以調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞對順鉑治療的敏感性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GAS5可能通過調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)水平影響絲蘇氨酸蛋白激酶的磷酸化，進(jìn)而通過miR-21影響宮頸癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。此外，F(xiàn)ANG等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3的調(diào)節(jié)下，GAS5通過GAS5/miR-21/程序性死亡因子4途徑增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。研究表明，年輕女性患者宮頸癌細(xì)胞GAS5多呈低表達(dá)[28,48]，因此，增加 GAS5的表達(dá)有望提高年輕宮頸癌患者對順鉑的敏感性，進(jìn)而改善年輕宮頸癌患者的預(yù)后。

6 GAS5與宮頸癌的放射治療敏感性

目前，放射治療是宮頸癌的常用治療方法[44]，但腫瘤細(xì)胞對放射治療的抵抗力是宮頸癌患者放射治療失敗的主要原因[49]。為了探索GAS5表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞放射治療敏感性的影響，有研究者用pcDNA-GAS5或siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染了SiHa和ME180細(xì)胞，結(jié)果表明，GAS5的過表達(dá)增加了宮頸癌細(xì)胞對放射治療的敏感性；且通過生物信息學(xué)軟件(DIANA，lncBase prediction v.2)的目標(biāo)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，GAS5是miR-106b的分子海綿；并進(jìn)一步通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來研究GAS5/miR-106b在宮頸癌放射治療敏感性中的分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放射治療抵抗組宮頸癌患者的腫瘤組織中GAS5表達(dá)水平較放射治療敏感組降低，但miR-106b較放射治療敏感組升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GAS5可能是通過miR-106b來影響宮頸癌對放射治療的敏感性[23,50]。綜上所述，宮頸癌放射治療聯(lián)合GAS5 的過表達(dá)可能會(huì)是宮頸癌治療的有效策略。

7 GAS5在宮頸癌免疫治療中的應(yīng)用前景

晚期宮頸癌患者傳統(tǒng)的治療方式主要為放射治療和化學(xué)治療，由于放射治療敏感性的下降和化學(xué)治療耐藥性以及治療以后的易復(fù)發(fā)性，以上治療方法效果欠佳[46,49]。目前，基于腫瘤微環(huán)境的免疫治療已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，免疫治療已成為包括宮頸癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤的一種新型治療選擇[51]。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后受腫瘤免疫微環(huán)境的影響，參與宮頸癌進(jìn)展的lncRNA(尤其是與免疫相關(guān)的lncRNA)在腫瘤免疫過程中發(fā)揮重要作用[52]。XU等[53]研究確定了與宮頸癌免疫治療和預(yù)后相關(guān)的多個(gè)lncRNA在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可能成為篩查宮頸癌和鑒別免疫治療敏感性患者的潛在標(biāo)志物。GAS5作為lncRNA中重要的一員，是一種腫瘤抑制因子，其參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[13-14]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)，GAS5與系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病有關(guān)[54]。目前，國內(nèi)外尚無GAS5與宮頸癌免疫相關(guān)的研究，提示研究人員未來可以進(jìn)行相關(guān)研究，為宮頸癌免疫治療提供新思路。

8 小結(jié)與展望

綜上所述，GAS5在宮頸癌細(xì)胞存活、生長分化及侵襲遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時(shí)，越來越多的研究表明，GAS5是一種參與宮頸癌進(jìn)展的新型分子，可成為潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。隨著分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究的不斷推進(jìn),GAS5有望在宮頸癌的早期診斷、基因治療、預(yù)后評估及靶向和免疫治療等方面展現(xiàn)更大價(jià)值。因此，需要更多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究來探索 lncRNA 參與宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移、化學(xué)治療抗性、放射治療抗性以及靶向免疫治療的機(jī)制，為未來更好地診斷和治療宮頸癌提供新思路。