肺癌患者淋巴結內培養(yǎng)CIK細胞的抑瘤實驗和臨床前期研究

滕家俊，周 嚴，劉顯勛，韓寶惠，鐘 華

上海市胸科醫(yī)院呼吸內科，上海 200030

肺癌患者淋巴結內培養(yǎng)CIK細胞的抑瘤實驗和臨床前期研究

滕家俊，周 嚴，劉顯勛，韓寶惠，鐘 華

上海市胸科醫(yī)院呼吸內科，上海 200030

背景與目的：細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells，CIK)兼具T淋巴細胞強大的殺瘤活性與自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)殺瘤的非MHC限制性。CIK細胞可直接殺傷腫瘤細胞，調節(jié)并增強免疫功能，同時不損害機體免疫環(huán)境，其在治療惡性腫瘤中的作用已得到廣泛認可。本研究旨在觀察肺癌手術患者淋巴結培養(yǎng)獲得的CIK細胞的殺瘤活性及其臨床應用的安全性。方法：獲取上海市胸科醫(yī)院6例經(jīng)手術治療的非小細胞肺癌患者的淋巴結及外周血，體外培養(yǎng)分別獲得CIK細胞。通過倒置顯微鏡觀察兩組CIK細胞的形態(tài)，檢測淋巴結組及外周血組CIK細胞表型，應用CCK8顯色法檢測兩組CIK細胞對A549細胞株的抗增殖作用，觀察回輸后血液中癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)的變化及其臨床應用中的不良反應。結果：淋巴結組和外周血組CIK細胞CD3+CD56+T細胞的比例均＞30%。不同效靶比淋巴結組CIK細胞對A549細胞的抑制率均高于外周血組(P＜0.05)?；剌斄馨徒Y內CIK細胞后肺癌患者有不同程度CEA下降。不良反應輕微，主要表現(xiàn)為皮疹和發(fā)熱。結論：肺癌手術患者的淋巴結可用于培養(yǎng)CIK細胞，其活性優(yōu)于外周血來源的CIK細胞，臨床前期實驗證實安全性高。

肺癌；淋巴結；免疫治療

肺癌的發(fā)病率高，死亡率居所有惡性腫瘤的首位。傳統(tǒng)的手術治療、放療和化療雖在不斷地改進，但肺癌患者的總生存率并無明顯改善，5年生存率不足15%［1］。人們在不斷探索新的肺癌治療手段。Schmidt-Wolf等［2］1991年首次報道的細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokineinduced killer cells，CIK)因其在體內外展現(xiàn)出來的強大抗腫瘤活性而備受關注, 迅速成為腫瘤免疫治療的前沿和熱點。到目前為止，CIK細胞用于治療肝癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌、腎細胞癌及各類白血病等都取得良好效果［3-6］。在肺癌治療方面，Kim等［7］、Lin等［8］和Wang等［9］的研究均表明，外周血培養(yǎng)的CIK細胞自體回輸是治療晚期肺癌良好的過繼免疫療法，可延長患者生存期，改善患者的生活狀況，且未見明顯的不良反應。肺癌手術患者淋巴結組織是否可以培養(yǎng)CIK并用作過繼性免疫治療，國內外目前尚無相關研究報道。本實驗將對外科手術患者術中所取得的淋巴結組織進行分離培養(yǎng)得到CIK細胞，將其與外周血CIK進行比較，觀察其生物學特性及對肺腺癌細胞的抗增殖作用，觀察淋巴結中培養(yǎng)的CIK細胞回輸肺癌患者的安全性。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和儀器

肺腺癌A549細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。試劑和儀器包括無血清培養(yǎng)液X-VIVOTM15(美國Lonza公司)、一次性細胞濾網(wǎng)(上海前塵生物科技有限公司)、鼠抗人CD3單克隆抗體(法國Immunotech公司)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的CD3(鼠抗人CD3單克隆抗體)、多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)標記的CD4(鼠抗人CD4單克隆抗體)、多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)標記的CD45(鼠抗人CD45單克隆抗體)、藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標記的CD16CD56(鼠抗人CD56單克隆抗體)(美國BD公司)、上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, Ep-CAM)抗體(C-10)(Santa Cruz公司)、重組人白細胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)、干擾素γ(interferon γ，IFNγ)和CCK-8試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)、FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 患者資料

選取2012年10月—2014年10月在上海市胸科醫(yī)院手術的非小細胞肺癌的患者6例。根據(jù)國際肺癌研究學會(International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC)第7版分類：ⅡB期2例和Ⅲ期4例；病理類型為肺腺癌5例，鱗癌1例。男性5例，女性1例，入組患者中位年齡為(63.00±3.08)歲。手術腫瘤切除加淋巴結清掃，滿足常規(guī)病理診斷要求后，淋巴結體外培養(yǎng)CIK細胞(表1)，回輸給患者。術后化療方案均為長春瑞賓聯(lián)合卡鉑方案(NC：長春瑞濱25 mg/m2，第1、8天+卡鉑AUC=5，第1天)。入選患者均簽署知情同意書。體力評價采用美國東部協(xié)作腫瘤組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)評分標準均≤1。

1.3 方法

1.3.1 外周血及淋巴結內CIK前體細胞的培養(yǎng)

外周血采集，術前30 min抽取患者靜脈血50 mL，16～20 ℃條件下保存。采用Ficoll密度梯度離心法，分離離心(670×g，20 min)。取中間層薄霧狀的外周血單個核細胞層靜置于培養(yǎng)箱中2 h，懸浮細胞制備CIK。

表 1 入組患者一般資料Tab. 1 Characterisitics of patients

淋巴結的采集：在手術中取縱隔淋巴結組織，約10 g(石蠟切片染色病理證實無轉移)。16～20 ℃保存，將其剪碎，剔除脂肪組織及各種纖維成分，再經(jīng)過碾磨、0.9%氯化鈉溶液洗滌重懸后采用細胞濾網(wǎng)過濾后收集細胞。細胞靜置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，收集懸浮細胞并制備CIK細胞。

1.3.2 CIK細胞的誘導與擴增

CIK的誘導擴增：將從外周血中收集獲得的外周血單個核細胞和淋巴組織中收集獲得的CIK前體細胞，用含INF-γ(1 000 μ/mL)和2%患者自體血清的X-VIVOTM15培養(yǎng)液，在溫度為37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將CD3單克隆抗體(500 ng/mL)、rhIL-2 (1 000 U/mL)加入培養(yǎng)液中，隔天補充營養(yǎng)因子(INF-γ和rhIL-2)，共培養(yǎng)10 d。繼續(xù)培養(yǎng)細胞至第14天時，開始收集CIK細胞，使細胞懸浮于50 mL的0.9%氯化鈉溶液中，儲存在輸液袋中(16～20 ℃下保存)；并取兩組細胞標記CD3、CD4、CD8、CD16CD56、Ep-CAM和內毒素的流式抗體，采用流式細胞儀上樣分析。

1.3.3 CCK8法細胞活性測定

取培養(yǎng)14 d后的外周血和淋巴結CIK細胞作為效應細胞，靶細胞為A549肺腺癌細胞，其細胞密度為1×105個/mL(1×104個/孔)，分別以效靶比為12.5∶1、25∶1、50∶1和100∶1的比例加入96孔板(實驗組)，另設單獨靶細胞孔(單獨靶細胞組)和單獨效應細胞孔(單獨效應細胞組)。每組設3個復孔，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用CCK8顯色法檢測波長450 nm處吸光度(D)值。抑制率(%)=(D單獨效應細胞組-D實驗組/D單獨靶細胞組)×100%。實驗重復3次。

1.3.4 CIK細胞形態(tài)的觀察及表型的檢測

取培養(yǎng)14 d后的外周血組及淋巴結組CIK細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。培養(yǎng)第14天時，用流式細胞儀檢測外周血組及淋巴結組CIK細胞表面分子，檢測方法同1.3.2節(jié)。

1.3.5 CIK回輸及回輸后評估

手術當日獲取患者淋巴結，按1.3.1和1.3.2節(jié)方法培養(yǎng)14 d獲得CIK細胞并常規(guī)進行病毒學、病原學檢測。每例患者淋巴結培養(yǎng)的CIK細胞從第15天開始分兩次回輸(1次/天)，計算每例患者回輸細胞總量?；剌敺椒镃IK細胞混懸于250 mL的0.9%氯化鈉溶液，靜脈回輸，回輸前0.5 h用吲哚美辛栓劑半枚納肛，異丙嗉(非那更)半支肌內注射。術后化療于手術后第4周進行，每4周1個療程，共4個療程。分別在手術后和化療4個療程結束后抽取外周血檢測癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)，行血常規(guī)(評估骨髓抑制發(fā)生率)，觀察皮疹、發(fā)熱、過敏性事件的發(fā)生率。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 來源淋巴結及來源外周血培養(yǎng)的CIK細胞表型分析

本實驗所選取的淋巴結均為術中病理提示無轉移的淋巴結，且術后石蠟切片免疫組織化學染色再次證實。試驗中Ep-CAM經(jīng)流式細胞術檢測表達陰性證實無腫瘤細胞。以上三項充分提示腫瘤未累及肺癌引流區(qū)域的淋巴結。來源于外周血與來源于淋巴結組的CD3+CD56+細胞所占的比例分別為(32.9±0.1)%和(31.8±3.0)%。差異無統(tǒng)計學意義(P=0.556，表2)。1例患有典型的來源于淋巴結和同時來源于外周血中培養(yǎng)的CD3+CD56+細胞(圖1)。

表 2 培養(yǎng)14 d外周血組及淋巴結組CIK表型情況Tab. 2 CIK phenotype of two groups after cultivation for 14 d(n=6)

表 2 培養(yǎng)14 d外周血組及淋巴結組CIK表型情況Tab. 2 CIK phenotype of two groups after cultivation for 14 d(n=6)

Group CD3+ CD4+ CD8+ CD3+CD16CD56+(CD3+CD56+) Peripheral blood95.3±4.3 1.7±1.2 93.0±4.2 32.9±0.1 Lymph nodes 96.2±2.5 8.7±2.8 82.6±4.7 31.8±3.0 P value 0.602 0.213 0.479 0.556

圖 1 流式細胞術檢測1例肺癌患者外周血及淋巴結內培養(yǎng)的CIK表型表達Fig. 1 Proportion of CIK cells from 1 patient’s peripheral blood and lymph nodes assayed by flow cytometry

2.2 培養(yǎng)14 d后外周血組及淋巴結組細胞形態(tài)

剛分離出的單個核細胞懸浮于培養(yǎng)基中，細胞體積較小，大小及折光性較一致。培養(yǎng)第5～6天時，細胞體積增大，可成團生長；培養(yǎng)第14天，倒置顯微鏡下淋巴結組和外周血組CIK細胞均呈圓形或橢圓形，體積增大，有細胞集落，細胞膜光滑，細胞質增多、飽滿、透亮、折光性好。

圖 2 來源于淋巴結中培養(yǎng)14 d的CIK細胞形態(tài)Fig. 2 The morphology of CIK cells after cultivation for 14 d

2.3 淋巴結CIK細胞對比外周血CIK細胞對A549細胞抗增殖作用

入組患者外周血及淋巴結分別培養(yǎng)CIK細胞，檢測其對A549細胞的抗增殖作用。當A549細胞取1×105個/mL時，檢測CIK細胞對A549細胞不同效靶比的抑制率。隨著效靶比的增高，對CIK細胞抑制率呈上升趨勢；不同效靶比淋巴結組CIK細胞對A549肺腺癌細胞的抑制能力均高于外周血組(P＜0.05，圖3)。

圖 3 CCK8法檢測CIK細胞對A549的抑制率Fig. 3 The suppression rate of CIK on A549 cells detected by CCK8 assay

2.4 回輸后評估

淋巴結培養(yǎng)擴增所得CIK細胞符合質控要求。按1.3.5節(jié)方法，每例患者分兩次回輸，回輸細胞總量為2.38×109個/例。分別在手術后和化療4個療程結束后抽取外周血檢測CEA，結果表明4例患者CEA出現(xiàn)不同程度下降(下降幅度超過25%定義為CEA下降)。安全性觀察結果顯示：淋巴結培養(yǎng)獲得的CIK細胞回輸安全性高，不良反應少，僅出現(xiàn)皮疹和發(fā)熱，并且都可以耐受，2名患者出現(xiàn)回輸CIK后的Ⅰ度皮疹(包括紅疹、痤瘡和瘙癢癥)，3例患者出現(xiàn)發(fā)熱(Ⅰ度2例，Ⅱ度1例)，臨床上不需要特殊處理。這6例患者在后續(xù)的4次術后輔助化療中，沒有出現(xiàn)超過Ⅰ度化療相關的骨髓移植不良反應。截止至最后一次隨訪日(2015年6月1日)，1例患者出現(xiàn)疾病進展(無進展生存期為11個月)，其余5例均未發(fā)現(xiàn)疾病進展(表3)。

表 3 肺癌患者淋巴結中培養(yǎng)CIK細胞回輸后CEA變化及不良反應Tab. 3 The variation of CEA and side effects of transfusion with the CIK cells derived from lymph nodes in patients suffering from lung cancer

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位，其中非小細胞肺癌占80%，其表現(xiàn)為高發(fā)生率、高死亡率、低生存率［10］。標準的化療及放療雖然可以在一定程度上殺死腫瘤細胞，但其毒性嚴重，易引起腫瘤患者免疫力低下狀態(tài)持續(xù)存在；而肺癌細胞的免疫原性差，這又進一步增加了腫瘤的免疫逃逸，導致肺癌患者的進一步治療嚴重受阻［10-12］。因此，提高機體免疫力，建立有效的免疫應答可能是肺癌治療的一種有效途徑。近年來，癌癥的免疫療法獲得重大的突破。免疫療法毫無疑問將成為主流的抗癌療法。

免疫療法中，過繼性免疫治療占據(jù)重要的位置。過繼性免疫治療可以在沒有損傷機體免疫系統(tǒng)結構和功能的前提下，直接殺傷腫瘤細胞，并且調節(jié)和增強機體的免疫功能。CIK細胞又稱做NK細胞樣T淋巴細胞，擁有T-NK細胞表型及MHC非限制性殺瘤能力。這是一群以CD3+CD8+CTL和 CD3+CD56+(CD3+CD16CD56+)為主的異質細胞群，其活化標志如CD25、CD69、CD95和記憶T細胞標志物CD45RO的表達明顯增加，這些標志與其殺傷腫瘤細胞活性有關。大量的CIK細胞輸入體內可以通過直接的靶向腫瘤細胞進行殺傷或導致其凋亡，也可通過分泌的細胞因子來增強機體已減退的免疫功能［13］。眾多研究表明，CIK細胞對于各種實體腫瘤，包括一些耐藥細胞的細胞毒作用主要來源于CD3+CD56+T細胞群［14-16］。CD3+CD56+T細胞比例越高，其殺瘤能力越強。

淋巴結的主要功能是濾過淋巴液，產(chǎn)生淋巴細胞和漿細胞，參與機體的免疫反應。淋巴結內的T細胞約占淋巴細胞總數(shù)的75%，其他為B細胞及其他免疫細胞［17］。

本研究表明，肺癌手術患者的淋巴結組織在體外經(jīng)細胞因子的誘導同樣可以獲得大量的擴增，培養(yǎng)第14天，CD3+CD56+T細胞比例上升至30%，平均水平不低于同期培養(yǎng)外周血來源的CIK細胞(P＞0.05)。取淋巴結組與外周血組培養(yǎng)14 d所得CIK細胞進行活性實驗，發(fā)現(xiàn)均可有效殺傷A549肺腺癌細胞，并且淋巴結組CIK細胞對A549肺腺癌細胞的抑制率高于外周血組(P＜0.05)。這說明手術患者的淋巴結組織完全可以用于CIK培養(yǎng)，其體外抑瘤活性強大。

肺癌患者免疫防御能力低下，對于剛術后的患者，抽取外周血培養(yǎng)CIK的過繼性免疫療法可能會影響患者術后恢復。因此通過對肺癌手術患者術中取得淋巴結組織培養(yǎng)CIK細胞，再回輸患者體內的方法，一定程度上減少患者的痛苦，依從性更高。

本實驗所選取的淋巴結均為術中病理明確無轉移的淋巴結，且術后石蠟切片免疫組織化學染色再次證實的沒有癌細胞轉移的淋巴結。培養(yǎng)前，應用上皮細胞黏附分子［18］(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)流式檢測淋巴結單細胞懸液。檢測陰性的淋巴結才能用于CIK的培養(yǎng)。因此，來源于手術中肺癌患者的淋巴結培養(yǎng)的CIK細胞，在安全性和無腫瘤細胞污染方面是可控的。

綜上所述，本實驗證實了肺癌手術患者術中取得的淋巴結組織可用作體外CIK細胞培養(yǎng)，增殖速度不低于外周血培養(yǎng)的CIK，并且對肺腺癌細胞株A549有更高效的抗增殖活性。淋巴結中培養(yǎng)的CIK細胞回輸后患者耐受良好，不良反應輕微。

本實驗探索性地應用肺癌手術患者淋巴結分離培養(yǎng)誘導CIK細胞用于過繼性免疫治療，證實了這種創(chuàng)新方法的安全性。未來將設計大規(guī)模的前瞻性對照臨床試驗分析比較此種方法在提高肺癌患者生存期上的作用和價值。

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Anti-tumor activities of CIK cells derived from lymph nodes of lung cancer patients

TENG Jiajun, ZHOU Yan, LIU Xianxun, HAN Baohui, ZHONG Hua
(Department of Pulmonary Disease, Shanghai Chest Hospital, Shanghai, 200030, China)

ZHONG Hua E-mail: eddiedong8@hotmail.com

Background and purpose: Cytokine-induced killer (CIK) has both the advantages of T lymphocytes’ powerful anti-tumor activity and NK cells’ tumor killing capacity without MHC restriction. It could directly kill tumor cells, regulate and enhance immune function, without damaging the structure and functions of the immune system. Its effects on the treatment of malignant solid tumors has been widely recognized. This study aimed to evaluate the anti-proliferation effects of CIK cells obtained and cultivated from lung cancer patients’ lymph nodes. Meanwhile, the safety of clinical transfusion was observed. Methods: The peripheral blood and lymph nodes of 6 surgery patients with lung cancer from Shanghai Chest Hospital were used to cultivate CIK cells for 14 days. The phenotypes of CIK cells were detected by flow cytometry. The anti-proliferation activities of CIK cells on A549 lung cancer cells were detected by CCK8 assay. The morphological changes of CIK cells were observed by invert microscope. The expression of CEA level and adverse events were evaluated after CIK transfusion. Results: The proportion of CD3+CD56+T lymphocyte in two groups were both more than 30%. The CCK8 assay showed that the suppression rate of lymph nodes group was higher than that of peripheral blood group at each effect/target ratio(P＜0.05). The adverse effect of CIK transfusion was mild and tolerable. The expression of CEA level decreased in patients. Conclusion: Lymph nodes of surgery patients with lung cancer can be used for cultivation of CIK cells. The anti-tumor activity of CIK isolated from lymph nodes is better than that of CIK cells cultivated from peripheral blood. Preclinical experiments showed high safety.

Lung cancer; Lymph nodes; Immunotherapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.09.004

R734.2

A

1007-3639(2015)09-0665-06

上海市科委引導課題(124119a6300)；上海市胸科醫(yī)院重大重點項目(2014YZDC20700)。

鐘華 E-mail:eddiedong8@hotmail.com