泡菜發(fā)酵中微生物的研究

趙虎威，陳燕飛，燕平梅

(太原師范學(xué)院 生物系，太原 030619)

1 概述

泡菜常常作為其他食物的輔料來食用，以使其他食物更有食欲或更容易消化?，F(xiàn)在泡菜已經(jīng)成為全世界各國人們飲食的重要組成部分。泡菜發(fā)酵過程中原料或底物的多樣性或工藝參數(shù)的不同，使發(fā)酵產(chǎn)品種類繁多，這種多樣性也反映在微生物的多樣性上，這些微生物是影響和推動(dòng)泡菜發(fā)酵和工業(yè)化過程的主要因素和生物化學(xué)控制因素。泡菜微生物在泡菜發(fā)酵中被培養(yǎng)和發(fā)現(xiàn)，這些微生物對(duì)經(jīng)過發(fā)酵的泡菜最終產(chǎn)品的影響及其味道、質(zhì)地和氣味都至關(guān)重要。研究泡菜的成果引起了人們的重視和興趣，經(jīng)常食用新鮮的泡菜可以有效促進(jìn)人們大腸和胃的正常蠕動(dòng)，從而有效防止了肥胖和便秘。泡菜可以有效幫助抵抗和抑制細(xì)菌，還可幫助人體預(yù)防惡性腫瘤的發(fā)生和癌細(xì)胞的形成，以及幫助調(diào)節(jié)和維持人體的正常生理和內(nèi)分泌機(jī)能等。泡菜的發(fā)酵，由一些在蔬菜及其制品表面產(chǎn)生或附著的微生物來進(jìn)行發(fā)酵和完成，參與各種用于泡菜及其制品發(fā)酵的微生物種類比較多，數(shù)量也較大，其中主要包括常見的乳酸菌、酵母菌、霉菌、腸桿菌、其他同科的各類中性細(xì)菌、假單胞雙胞芽桿菌及其他同屬的各類細(xì)菌等。對(duì)泡菜發(fā)酵過程起主要輔助作用的微生物是乳酸菌，而除乳酸菌之外的其他酵母菌、醋酸菌和霉菌等各種微生物則對(duì)泡菜發(fā)酵起到了各種輔助發(fā)酵的重要作用[1]。此外，某些泡菜在其整個(gè)發(fā)酵期間與其酵母中的菌類還通過酯化發(fā)酵加成反應(yīng)合并生成乳酸乙醇以及其他芳香醇類[2]。目前，對(duì)來自世界各國的各種泡菜及其相關(guān)制品中各種乳酸菌及其他微生物菌種的化學(xué)發(fā)酵機(jī)理作用問題研究很多，據(jù)各國媒體報(bào)道，韓國的各類泡菜中仍存在各種發(fā)酵乳酸菌及其微生物高達(dá)30多種。而且近年來，世界各國和我國本土對(duì)于泡菜制品發(fā)酵中乳酸菌類微生物的發(fā)酵作用研究也愈發(fā)深入。

2 文獻(xiàn)綜述

2.1 泡菜的腌制

泡菜的制作源于我國， 制作的原料主要是各種新鮮的蔬菜，把它們一起放入低鹽溶液中，經(jīng)過與乳酸菌等多種常見微生物混合進(jìn)行發(fā)酵從而加工產(chǎn)生的一種美味可口的食品。在我國、日本、德國和朝鮮等國的歷史悠久，從古至今發(fā)酵泡菜都受到了許多家庭和消費(fèi)者的青睞和喜愛。泡菜略帶咸味和酸性，味道鮮嫩，可以增進(jìn)食欲，幫助消化，并具有一定的醫(yī)療和保健益處。

容器、鹵水和調(diào)味料是制作泡菜的3個(gè)關(guān)鍵因素。制備泡菜的容器應(yīng)具有良好的耐熱性、搪瓷性、吸水性，無裂紋、無沙眼和清脆的鋼聲音的泡菜壇。正確的原料選擇是使用新鮮和季節(jié)性的泡菜品種來提高泡菜的營養(yǎng)價(jià)值，且需質(zhì)地鮮嫩，肉厚、肉質(zhì)硬健，無任何蚊蟲叮咬、爛痕、斑點(diǎn)者為佳；泡菜鹽水的正確配制對(duì)新鮮泡菜產(chǎn)品的質(zhì)量也具有重要性的影響，一般可以選擇使用含鹽和礦物質(zhì)較多的水來配制泡菜鹽水， 制作鹵水的食鹽應(yīng)選用品嘗起來含有苦味較少、礦物質(zhì)含量也極少等品質(zhì)良好的。泡菜鹵水中食鹽成分含量對(duì)其內(nèi)的微生物數(shù)量和種類影響很大，而微生物的數(shù)量又與泡菜中的pH、酸度密切相關(guān)，所以食鹽要適宜[3]。不同發(fā)酵原料和鹽水中含鹽量和pH值均會(huì)影響泡菜中酵母菌數(shù)量的多少[4]。料酒、蔗糖、高粱酒、蔥、姜、蒜、辣椒、八角、草果、花椒、胡椒等調(diào)味料則是泡菜風(fēng)味形成的關(guān)鍵，白酒和料酒使鹽味更好地滲透進(jìn)泡菜中，還可以殺死發(fā)酵過程中的某些有害菌；蔗糖和辣椒可以調(diào)和味道、增加鮮味以及防止泡菜變質(zhì)；八角、花椒等可以起到增香、除去泡菜鹵水中腥味的功效。周佳等研究表明泡菜的最適宜發(fā)酵條件為：鹵水中食鹽濃度為0.04，發(fā)酵溫度為30 ℃，蔗糖濃度為0.03，乳酸菌、植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的最佳配比為3∶1∶1，該條件下得到的泡菜口感較佳[5]。

制作泡菜要先將蔬菜原料清洗干凈放在一旁瀝干水分，瀝干后將其切成適宜大小，在其表面撒上一層薄薄的鹽，然后將其放入泡菜壇中先腌制7～8 h，讓鹽分充分融入蔬菜中。接著將白酒、紅糖、辣椒、八角、花椒、胡椒等調(diào)味料放入泡菜壇中，充分?jǐn)嚢?，使其和泡菜充分混合，再用泡菜壇蓋蓋上壇口，將涼水倒置其上,摻滿壇沿即可，然后將其放在溫度適宜的環(huán)境中發(fā)酵。熊濤等研究不同發(fā)酵溫度對(duì)鹵水的pH值、微生物數(shù)量和種類、有機(jī)糖、乳酸、乙酸和乙醇等含量的影響[6]。結(jié)果表明：鹵水的溫度會(huì)影響泡菜發(fā)酵中乳酸菌的生長繁殖。泡菜發(fā)酵環(huán)境的溫度越高，越適宜乳酸菌的繁殖和代謝；當(dāng)泡菜環(huán)境溫度低時(shí)，適合酵母菌和大腸桿菌的存活和繁殖。所以，泡菜發(fā)酵的溫度以15～25 ℃為宜。

2.2 泡菜微生物研究概況

2.2.1 國外泡菜微生物研究概況

泡菜一直以來都受到人們的關(guān)注，尤其是在“注重健康”的發(fā)達(dá)國家，其健康效益也在不斷增加。蔬菜是營養(yǎng)物質(zhì)的豐富來源，如維生素A、B、C、D等各類礦物質(zhì)，益生菌纖維和生物活性植物化合物，包括酚酸、黃酮類、植物雌激素和生物活性肽。越來越多的科學(xué)研究表明，食用富含蔬菜的飲食與降低和年齡相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)之間存在著積極的關(guān)系。因此，越來越多的國外學(xué)者對(duì)研究泡菜發(fā)酵中的微生物與身體健康等方面越發(fā)感興趣。Sebastian等[7]主要敘述了蔬菜和水果有一個(gè)微生物種群，該微生物區(qū)系中，主要由有益的微生物組成，包括酵母菌、畢希亞、念珠菌、托拉斯波真菌屬(根霉)、有氧(芽孢桿菌和醋桿菌)和厭氧(乳酸菌)細(xì)菌，通常負(fù)責(zé)生蔬菜和水果的自然發(fā)酵，有助于它們的保存和穩(wěn)定性。Carl等則綜述了泡菜中的維生素含量，并對(duì)泡菜的細(xì)菌學(xué)變化進(jìn)行了研究[8]，表明泡菜的發(fā)酵是由Leuconostoc、短乳桿菌和植物乳桿菌3種微生物生長和發(fā)酵的結(jié)果。

2.2.2 國內(nèi)泡菜微生物研究概況

我國泡菜的微生物研究起源于20世紀(jì)30年代，典型成果有“乳酸菌主導(dǎo)發(fā)酵”，20世紀(jì)40年代則是采用傳統(tǒng)方法鑒定并首次提出“乳桿菌屬主導(dǎo)發(fā)酵”，這是我國老一輩科學(xué)家在泡菜微生物研究領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)。20世紀(jì)80年代和90年代，我國泡菜微生物研究進(jìn)入了快速發(fā)展時(shí)期，結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，我國的學(xué)者們首次提出了中國泡菜的三階段式發(fā)酵，這也說明了泡菜發(fā)酵的動(dòng)態(tài)變化。這一時(shí)期，大量的專家和學(xué)者采用可培養(yǎng)乳酸菌等微生物的手段深入研究了我國泡菜中的微生物，大大地豐富了我們對(duì)中國泡菜中微生物品種和菌群的了解和認(rèn)識(shí)。

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著我國分子泡菜微生物學(xué)研究技術(shù)的快速進(jìn)步和發(fā)展，采用了一種將傳統(tǒng)泡菜分離乳酸菌的純化與現(xiàn)代分子泡菜微生物學(xué)鑒定(如16S rDNA)的方法使有機(jī)結(jié)合的技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于對(duì)泡菜乳酸菌微生物的科學(xué)研究中，2005年以后逐漸出現(xiàn)了PCR-DGGE、克隆文庫等免培養(yǎng)方法研究泡菜微生物，過去一些難以培養(yǎng)的如嗜鹽微生物、非乳酸菌細(xì)菌等大量被發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步推動(dòng)了泡菜微生物學(xué)的發(fā)展。而近年來宏基因組測(cè)序、定量PCR等手段的興起也帶動(dòng)了泡菜微生物學(xué)研究的深入開展。尤其是四川在泡菜研究方面，在傳統(tǒng)微生物學(xué)方法的基礎(chǔ)上，應(yīng)用現(xiàn)代分子微生物技術(shù)系統(tǒng)開展了四川省內(nèi)各個(gè)不同地區(qū)的泡菜微生物菌群結(jié)構(gòu)及變化的研究，第一個(gè)確定了明串珠菌、乳桿菌和乳球菌這3個(gè)屬17個(gè)種的乳酸菌是主要優(yōu)勢(shì)菌群，之后應(yīng)用多重PCR、高通量測(cè)序等方法進(jìn)一步確定了泡菜中的主要優(yōu)勢(shì)菌群，建成我國國內(nèi)首個(gè)泡菜微生物菌種的資源庫。

2.3 泡菜所含微生物的種類

2.3.1 乳酸菌對(duì)泡菜發(fā)酵的作用

乳酸菌幾乎無法直接分解植物纖維素并且不能水解植物蛋白質(zhì)，因此乳酸菌幾乎不會(huì)在泡菜植物發(fā)酵的過程中直接破壞植物細(xì)胞的纖維組織。乳酸菌可以產(chǎn)生多種氨基酸、維生素和酶，從而提高和改善泡菜的營養(yǎng)價(jià)值。乳酸菌通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、丙酸等，可以使泡菜中形成一些酸性細(xì)菌，使泡菜產(chǎn)品具有柔軟的酸味，并且可以抑制泡菜發(fā)酵環(huán)境中某些腐敗微生物和致病微生物的生長。同時(shí)，泡菜在發(fā)酵過程中自然產(chǎn)生的庚酮和壬酮的類乳酸菌素還可以幫助使蔬菜產(chǎn)品的口感更加清新。乳酸菌屬的微生物還可以分解產(chǎn)生許多具有一定抗菌活性的化學(xué)物質(zhì)，如乙醇、二乙?；?、過氧化氫等，可以有效防止泡菜變質(zhì)，延長其保質(zhì)期[9]。植物乳酸菌發(fā)酵可以豐富各種泡菜產(chǎn)品以滿足市場(chǎng)需求并創(chuàng)造更多的經(jīng)濟(jì)效益。

乳酸菌是參與調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡的主要菌系，具有益生菌的潛力[10]，它們也使得泡菜具有醫(yī)療保健的作用。Cortés-Rodríguez Viridiana等研究發(fā)現(xiàn)，泡菜發(fā)酵主要是乳酸菌的作用，并已經(jīng)顯示益生菌的特點(diǎn)包括：膽固醇還原和膽固醇同化；抗氧化活性離體；抗腫瘤活性；免疫調(diào)節(jié)；抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性致病菌的生長發(fā)育[11]。這些從泡菜發(fā)酵中分離出來的乳酸菌的特性支持了食用這些乳酸菌可能有益于人類健康的觀點(diǎn)。

2.3.2 酵母菌對(duì)泡菜發(fā)酵的作用

酵母菌能產(chǎn)生少量氣體，能產(chǎn)生有機(jī)醇，不產(chǎn)有機(jī)酸，利用還原糖的能力強(qiáng)，能產(chǎn)生脂類物質(zhì)，更能適應(yīng)高酸和高鹽環(huán)境；酵母菌與其他植物乳桿菌共同進(jìn)行發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生更多的酸[12-13]。酵母菌與乳酸菌共同混合發(fā)酵不僅要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他菌與乳酸菌共同發(fā)酵時(shí)的各項(xiàng)理化性能指標(biāo)和感官味覺性能，而且發(fā)酵形成的泡菜成品還具有更好的泡菜風(fēng)味和特殊口感[14]。酵母菌還具有一定的對(duì)DPPH酶等自由基酶的清除培養(yǎng)能力以及抗體細(xì)胞自動(dòng)化的聚集培養(yǎng)能力。酵母菌可以促進(jìn)植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和腸膜明串珠菌這3種乳酸菌的生長繁殖[15]。

2.3.3 醋酸菌對(duì)泡菜發(fā)酵的作用

因?yàn)榕莶税l(fā)酵過程中用到了醋這類調(diào)味品，所以泡菜中會(huì)存在一定量的醋酸菌。醋酸菌是一種原核生物，在自然界中分布廣泛，屬于異養(yǎng)需氧型微生物，在泡菜發(fā)酵過程中需要氧氣。醋酸桿菌在泡菜的整個(gè)發(fā)酵過程中能將其中形成的少量乙醇氧化成醋酸，然后將生成的醋酸和少量乳酸氧化成少量二氧化碳和水，并且醋酸菌還具有較高的抗乙酸能力[16]。醋酸菌在泡菜發(fā)酵過程中主要起到在泡菜發(fā)酵中輔助乳酸菌共同完成發(fā)酵泡菜的作用。因?yàn)橛行┚昴軌蚝铣衫w維素組成細(xì)胞壁外的基質(zhì)，而細(xì)菌則埋置于纖維素微絲纏結(jié)的片層中。

2.3.4 霉菌對(duì)泡菜發(fā)酵的作用

霉菌屬于真菌，生長和繁殖速度較快，菌落呈絨毛或蜘蛛網(wǎng)狀。發(fā)酵產(chǎn)品中常用的霉菌主要是曲霉菌、毛霉菌和青霉菌。霉菌在泡菜發(fā)酵過程中主要將蔬菜等原料轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，如有機(jī)糖、淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)等。在泡菜發(fā)酵的起始時(shí)間，霉菌起著重要的作用。但是，霉菌還會(huì)污染泡菜產(chǎn)品，并使其變質(zhì)，甚至致畸、致癌和致突變。在泡菜發(fā)酵的后期，霉菌會(huì)分解原料中的蛋白質(zhì)，嚴(yán)重影響泡菜的味道，還為其他有害微生物的生長繁殖提供了適宜的條件[17]。

2.4 微生物的研究方法

2.4.1 傳統(tǒng)的鑒定方法

通過對(duì)泡菜中的微生物進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng)一系列操作，對(duì)其在特定培養(yǎng)基上所表現(xiàn)出來的特性進(jìn)行研究以鑒定微生物種類，這些特征包括形狀、大小、正反面顏色、邊緣形狀、隆起、黏稠度、透明度、氣味等。

除上述物理特征外，還可采用生理生化反應(yīng)來對(duì)其進(jìn)行研究，如對(duì)碳源、氮源等能源的需求，對(duì)生長因子的要求，其代謝產(chǎn)物的類型，進(jìn)行染色反應(yīng)所表現(xiàn)出來的特征以及研究微生物生長的溫度范圍，最適、最低和最高生長溫度。

2.4.2 16S rRNA寡核苷酸的序列分析

細(xì)菌中包括3種核糖體RNA，分別為5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。5S rRNA雖然易分析，但其中含有的基因核苷酸只有幾十個(gè)bp長度，沒有提供足夠的具體遺傳化學(xué)信息；23S rRNA含有的基因核苷酸的個(gè)數(shù)則太多，進(jìn)行遺傳分析時(shí)較困難。而16S rRNA序列基因中的核苷酸各個(gè)序列之間長度變化適宜，序列長度變化與基因進(jìn)化距離相符合適應(yīng)，對(duì)各類微生物細(xì)胞進(jìn)行基因序列變化分析的研究結(jié)果更準(zhǔn)確。所以，現(xiàn)在一般建議采用16S rRNA對(duì)微生物進(jìn)行基因測(cè)序優(yōu)化分析。

16S rRNA序列分析的具體步驟為：對(duì)原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括條碼序列解復(fù)用、質(zhì)量濾波、去噪、嵌合體檢測(cè)和數(shù)據(jù)歸一化；然后進(jìn)行微生物多樣性分析：先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析和可視化。

2.4.3 變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)

變性梯度凝膠電泳被廣泛地應(yīng)用于微生物科學(xué)分子群體生態(tài)學(xué)學(xué)術(shù)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)逐步發(fā)展并成為專門研究各類微生物分子群落形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要分子形態(tài)生物學(xué)研究方法之一。DGGE系統(tǒng)是一種基于DNA材料片段的變性熔融分解梯度特性將其加熱分離的凝膠電泳系統(tǒng)。DGGE是根據(jù)DNA片段在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多樣性基因調(diào)查、親緣之間關(guān)系活性鑒定、基因突變活性檢測(cè)等領(lǐng)域。

2.4.4 高通量測(cè)序(high-throughput sequencing)

利用高通量序列測(cè)序分析技術(shù)可以一次對(duì)幾十萬到幾百萬條諸如DNA的分子序列進(jìn)行細(xì)致序列分析測(cè)定。高通量測(cè)序技術(shù)的主要工作原理為：將測(cè)序目標(biāo)中的DNA分子剪切為小塊的片段；然后將DNA兩個(gè)分子相互結(jié)合后放到一個(gè)固相分子表面；并對(duì)單片段DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增；一次復(fù)制一個(gè)堿基，然后檢測(cè)信號(hào)；最后運(yùn)用高分辨率的分子成像排序系統(tǒng)。

應(yīng)用高通量分子測(cè)序不僅為我們提供了豐富的分子遺傳學(xué)類信息，而且可以使每次測(cè)序的測(cè)量費(fèi)用和排序時(shí)間大大縮短。技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步使得這一方法變得更加可靠，絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(包括那些表達(dá)量極少的轉(zhuǎn)錄本)都能夠被精準(zhǔn)地定量。隨著序列讀長的增加，454焦磷酸測(cè)序法的使用頻率將大增，進(jìn)一步增加在非模式物種中鑒定基因的概率。

2.4.5 熒光定量PCR

在實(shí)時(shí)PCR熒光反應(yīng)系統(tǒng)中首先添加了一個(gè)熒光團(tuán)，將其與反應(yīng)模板中的DNA混合后，進(jìn)行了由高溫反應(yīng)變性、低溫復(fù)性到適溫反應(yīng)延伸的一系列反應(yīng)過程，通過實(shí)時(shí)儀器檢測(cè)溫度不斷變化時(shí)的實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)信號(hào)并利用實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)信號(hào)分析來快速完成對(duì)各個(gè)起始反應(yīng)模板的定量分析。此檢測(cè)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)之處在于它可實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR的起始擴(kuò)增，并在起始擴(kuò)增的每個(gè)指數(shù)檢測(cè)階段內(nèi)可定量檢測(cè)起始擴(kuò)增模板。

2.5 各種微生物的分離和鑒定研究結(jié)果

Xiong分析了泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌群的變化；結(jié)果表明腸系膜乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和玉米乳桿菌等主導(dǎo)泡菜的發(fā)酵[18]。腸系膜乳桿菌在蔬菜腌制后立即出現(xiàn)在鹵水中，發(fā)酵過程中依次出現(xiàn)其他乳酸菌。乳酸主要發(fā)生在發(fā)酵初期，后期消失；腸系膜乳桿菌直到第5天才消失；玉米乳桿菌在中期存在，在第5.5天消失。植物乳桿菌和干酪乳桿菌主導(dǎo)了發(fā)酵的最后階段。

曾駿采用26S rDNA序列分析法鑒定從泡菜樣品中分離到的具有不同菌落特點(diǎn)的酵母菌。燕平梅等采用稀釋涂布的方法分離所研究泡菜中的微生物[19]。通過運(yùn)用傳統(tǒng)微生物研究技術(shù)和16S rRNA基因?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定，結(jié)果表明東北泡菜中乳酸菌具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用。另外，他們采用PCR-DGGE技術(shù)分析了泡菜中乳酸菌的多樣性[20]。

魏雯麗等利用宏基因組測(cè)序技術(shù)深入解析了抑制泡菜在乳酸菌發(fā)酵和培養(yǎng)過程中的活性微生物。結(jié)果表明Pediococcus，Lactobacillus，Starmerella，Weissella，Weisugiyamaella,Millerozyma是抑制泡菜在乳酸菌發(fā)酵和培養(yǎng)過程中的主要活性微生物菌屬[21]。呂嘉櫪等采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，分析研究了自然發(fā)酵泡菜的樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性[22]。泡菜中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群均為Ascomycota(子囊菌門)。而李恒等對(duì)泡菜研究結(jié)果表明，在泡菜發(fā)酵過程中，Ascomycota占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，是泡菜中的主要真菌群類[23]。

裴樂樂等采用了構(gòu)建16S rRNA基因文庫、18S rRNA基因文庫及23S rRNA的ARDRA分型方法進(jìn)行分析，對(duì)4種以細(xì)菌為原料的不同四川泡菜樣品的分型進(jìn)行了研究[24]。研究結(jié)果充分揭示了我國四川省生產(chǎn)泡菜的主要微生物來源的多樣性，反映了不同的原料制成四川省傳統(tǒng)泡菜的主要微生物來源群落的結(jié)構(gòu)及其之間存在的差異性，為進(jìn)一步深入探究傳統(tǒng)泡菜的主要發(fā)酵過程和機(jī)理、泡菜的風(fēng)味影響因子的形成和機(jī)制以及我國傳統(tǒng)泡菜微生物在發(fā)酵過程中的工業(yè)化生產(chǎn)過程提供了一定的科學(xué)理論和基礎(chǔ)[25]。田偉等也采用了此研究方法來鑒別泡菜中所分離的乳酸菌類別[26]。

2.6 引起泡菜變質(zhì)的腐敗微生物

2.6.1 腐敗微生物

在泡菜的發(fā)酵過程中，乳酸菌可以將發(fā)酵泡菜制作過程中原料中的某些營養(yǎng)物質(zhì)迅速轉(zhuǎn)化為大量的養(yǎng)生風(fēng)味營養(yǎng)物質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)，如天然乳酸、氨基酸、維生素等，乳酸菌本身對(duì)發(fā)酵泡菜的這些營養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì)功能破壞較小[27]。泡菜腐敗或者變質(zhì)的原因是泡菜中有害微生物的嚴(yán)重污染。泡菜腐敗變質(zhì)主要由酵母菌、霉菌和芽孢菌等微生物造成，這些腐敗微生物所引起的變質(zhì)可以認(rèn)為是泡菜汁液中的某種生物胺和其他微生物中的毒素等含量過高所導(dǎo)致。日常使用的泡菜食物中的某些蛋白質(zhì)和糖分子在腐敗菌和其他微生物的光合作用下可以發(fā)生快速水解，分解后成為其中游離的各種氨基酸，然后使其脫落氨基并釋放出糖和氨。陳岑等近年研究發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌、G.candidum、解芽霉頭孢桿菌、C.xestobii等能夠直接引起各種泡菜不同品種程度的腐敗，是主要的腐敗有害微生物[28]。在泡菜中大量存在的亞丁酸菌、丁酸菌和腐敗菌能分解泡菜中的營養(yǎng)物質(zhì)，使其產(chǎn)生刺激性惡臭味；大腸桿菌可以從泡菜中釋放出硫化氫和吲哚，這些都可使泡菜產(chǎn)生惡臭味，引起各類泡菜的腐敗和變質(zhì)。

2.6.2 腐敗微生物的抑制

對(duì)泡菜發(fā)酵過程中的環(huán)境，如pH值、溫度、食鹽濃度、調(diào)味料的多少等進(jìn)行控制，可以有效抑制腐敗微生物的生長繁殖。pH值在4.5以下可減少微生物對(duì)泡菜的影響，使泡菜不易腐敗變質(zhì)；泡菜存放環(huán)境的溫度和光照也會(huì)影響腐敗微生物的生存和繁殖，陰涼避光的環(huán)境不適宜有害微生物的生存，適宜泡菜的保存。泡菜中所含的鹽分也對(duì)有害微生物有重要的影響，鹽分較高時(shí)會(huì)抑制微生物的生長，但不僅影響腐敗微生物也抑制了乳酸菌等的生長繁殖，而且影響泡菜的口感；當(dāng)泡菜中所含鹽分較少時(shí)不能起到抑制微生物的作用，所以食鹽含量以4%為宜。姜、大蒜和鮮紅辣椒等添加進(jìn)泡菜中都會(huì)有效降低一些泡菜香氣中的刺激性氣味化學(xué)物質(zhì)，增加了一些泡菜的辛辣香氣并有效抑制了一些泡菜的腐敗，大蒜和鮮紅辣椒對(duì)多數(shù)酵母菌株具有較強(qiáng)的消化抑制殺菌作用，生姜?jiǎng)t對(duì)少數(shù)有害菌株具有促進(jìn)生長的作用，當(dāng)其在泡菜中的濃度均值超過6%時(shí)會(huì)有效抑制有害微生物的正常生長。花椒對(duì)大多數(shù)酵母菌都具有促進(jìn)生長的作用，對(duì)少數(shù)酵母菌也具有較明顯的抗菌抑制生長作用[29]，多酚也具有與上述花椒類似的抑制效果。

3 結(jié)論

關(guān)于泡菜微生物的研究和發(fā)展也存在著許多需要我們進(jìn)一步思考和改進(jìn)的問題：(1)目前關(guān)于泡菜發(fā)酵研究較多的是單批次發(fā)酵，對(duì)于多批次連續(xù)發(fā)酵的研究報(bào)道不多。(2)傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜的菌群較多，對(duì)其風(fēng)味品質(zhì)影響較大，目前對(duì)泡菜中菌群結(jié)構(gòu)多樣性研究較多的是以細(xì)菌為主，而對(duì)其中的真菌群落結(jié)構(gòu)研究較少。(3)現(xiàn)在國內(nèi)外關(guān)于各類泡菜食用微生物的相關(guān)研究主要集中在關(guān)于泡菜中多功能益生菌的有效篩選和推廣應(yīng)用以及關(guān)于泡菜食物發(fā)酵利用過程中泡菜微生物的環(huán)境變化影響分析這兩個(gè)方面[30]。(4)最近由于DNA測(cè)序技術(shù)的普及，在探索這種微生物多樣性的研究中可以觀察到從基于文化的技術(shù)向基于測(cè)序的技術(shù)的轉(zhuǎn)變。雖然這些獨(dú)立于文化的技術(shù)有其自身的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于新的與工業(yè)相關(guān)的菌株的選擇和鑒定來說，獲得物理分離物是必要的。(5)傳統(tǒng)上，采用變性梯度凝膠電泳、DGGE技術(shù)或16S rRNA基因的Sanger測(cè)序?qū)ξ⑸镞M(jìn)行鑒定。最近，全基因組測(cè)序(WGS)隨著測(cè)序成本的降低而日益流行，與單個(gè)標(biāo)記基因的測(cè)序相比，WGS獲得了更多關(guān)于感興趣菌株的信息。因此，要開發(fā)并使用更先進(jìn)的計(jì)算分析，如利用WGS獲得基因組信息。雖然基于WGS的識(shí)別方法比傳統(tǒng)方法花費(fèi)更高，并且需要大量的生物信息學(xué)專業(yè)知識(shí)，但是能夠獲得基因組序列草稿或完整的基因組序列有助于探索分離微生物的功能潛力。泡菜中的微生物具有更高的易于培養(yǎng)的潛力，這樣可以更容易地操作和更深入地研究。