半胱氨酸蛋白酶抑制劑C對胃癌侵襲與轉移的影響

劉 浩，劉 文，向 輝，劉永輝，尚國臣，唐 明

(1.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化科，新疆 石河子 832008；2.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院功能科，新疆 石河子 832008；3.新疆生產(chǎn)建設兵團第三師總醫(yī)院圖木舒克院區(qū)消化科，新疆 圖木舒克 843800)

胃癌是威脅人類健康的重大疾病之一，其死亡率和發(fā)病率分別位居所有癌癥中的第二位和第三位[1-2]，且近年來發(fā)病率有上升趨勢[3]，目前胃癌診斷的金標準仍然是胃鏡檢查和病理活檢，但受限于人們對于胃鏡的接受程度及檢查費用偏高，胃鏡檢查目前仍未能成為胃癌大規(guī)模篩查的方法，因此，尋找適宜的胃癌血清學標志物應用于胃癌的篩查是有必要的。癌胚抗原(CEA)是目前消化道腫瘤常用的標記物，在胃癌的診斷中有著一定的診斷價值。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cys C)是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，研究表明其在炎性反應和腫瘤發(fā)生過程中起著重要的作用[4-5]。本研究通過測定Cys C在胃癌患者血清中的水平及組織中的表達并進行比較，進而評估其在胃癌診斷中的價值及在侵襲及轉移中的作用，進而尋找胃癌診斷新的血清學標志物，也為胃癌的治療提供新的思路和途徑。

1 資料與方法

1.1研究對象：選取2019年6月～2021年6月就診于石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院早期胃癌患者40例納入早期胃癌組，進展期胃癌患者40例納入進展胃癌組；另選取同期就診于本院的慢性胃炎患者40例作為正常組；進展期胃癌診斷標準為經(jīng)電子胃鏡及病理明確診斷為胃癌，術后病理證實腫瘤侵犯固有肌層以上；早期胃癌診斷標準為內(nèi)鏡下粘膜剝離術后及外科術后病理證實腫瘤局限于黏膜層及黏膜下層，無論病灶大小及有無淋巴結轉移。正常組男20例，女20例；年齡27～74歲，平均(56.67±11.50)歲；早期胃癌組男26例，女14例；年齡44～83歲，平均(61.15±12.04)歲；進展胃癌組男24例，女16例；年齡47～90歲，平均(64.18±11.06)歲。三組研究對象在性別、年齡、抽煙和飲酒比例、高血壓、糖尿病等基礎病患病比例上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

表1 三組患者一般情況比較[n(%)，n=40]

1.2納入和排除標準：所有患者病史資料完整，均為首次診斷胃癌及早期胃癌，針對腫瘤未接受任何治療；腎小球濾過率異?；颊哂枰耘懦?。

1.3檢測試劑及方法

1.3.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清Cys C 、CEA水平：采集所有研究對象空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min 離心10 min，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ訣LISA法完成Cys C 、CEA的檢測，所用酶標儀為DNM-9606型，相關操作遵循試劑盒說明書完成，相關試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司。分析各組 CEA、Cys C表達水平。

1.3.2免疫組化法檢測組織中Cys C表達：分別取正常胃組織、早期癌胃組織、進展期癌胃組織及進展期癌癌旁組織置于10% 甲醛溶液中固定，進展期癌旁組織為距癌組織邊緣2 cm的組織。石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水甲醇中浸泡10 min。枸櫞酸修復液微波爐中高火修復至冒泡后再低火修復20 min，冷卻至室溫，加Cys C一抗，置于4℃冰箱過夜。次日PBS沖洗5 min ×3次，滴加二抗(兩步法)，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Cys C主要表達在腫瘤細胞的胞質內(nèi),正常細胞內(nèi)表達弱。每張標本切片隨機選擇5個高倍視野區(qū)域計數(shù)陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算陽性表達率，陽性表達率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。主要儀器:RM2135型石蠟切片機，德國LEICA公司;免疫組化圖像分析系統(tǒng)，日本OLYMPUS株式會社。主要試劑:兔抗人Cys C多克隆一抗，英國Abcam公司。

1.4統(tǒng)計學方法：采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗與χ2檢驗。CEA與Cys C的檢測胃癌的效能通過受試者工作特征(ROC曲線)分析。

2 結果

2.1三組患者血清中CEA與Cys C水平比較：三組患者血清中CEA與Cys C呈遞增趨勢，各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組患者血清CEA與Cys C水平比較

2.2Cys C與CEA檢測胃癌ROC曲線分析：單獨CEA檢測靈敏度63.75%，特異度80.00%，單獨Cys C檢測靈敏度87.50%，特異度62.50%，Cys C與CEA檢測胃癌ROC曲線下面積相近(0.795 vs 0.753)，有著相同的診斷價值。見圖1。

圖1 CEA與Cys C檢測胃癌ROC曲線

2.3Cys C在正常及不同分期癌組織中的表達：Cys C陽性反應物表達位于胞質內(nèi)，呈棕褐色，在正常組織[7.50%(3/40)]及癌旁組織[37.50%(15/40)]中表達較弱，在早期癌[22.50%(9/40)]及進展期癌[67.50%(27/40)]組織中表達較正常組織增強，且進展期癌中表達較早期癌增強，進展期癌組織中的表達高于進展期癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖2。

圖2 Cys C在正常及不同分期癌組織中的表達(DAB，×200)

3 討論

Cys C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，是一種從血清中分離出來的新型半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在人體大部分組織中穩(wěn)定表達，并且不受年齡、性別等因素的影響，臨床上常用來評估早期腎功能損傷及肺動脈高壓程度[6-7]，近年來也有研究發(fā)現(xiàn)Cys C在腫瘤生長、血管生成、浸潤、轉移等方面發(fā)揮重要作用[8]。

本研究結果顯示，Cys C在診斷胃癌方面與CEA有著相同的診斷價值，且其敏感性高于CEA，用于腫瘤的篩查更具有優(yōu)勢，而其特異度卻較CEA偏低，提示需聯(lián)合其他指標檢測提高其診斷能力。既往關于Cys C在腫瘤患者血清中的水平結果表明，Cys C在食管癌[9]、乳腺癌[10]、 腎細胞癌[11]、前列腺癌[12]、多發(fā)性骨髓瘤[13]、肺癌[14]、卵巢癌[15]患者血清中水平增高，而在眼部腫瘤患者血清中其水平較正常者低[16]，提示Cys C可能在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中其發(fā)揮作用的機制不同，進而血清中CysC的變化趨勢不同，但總體來說，腫瘤患者與正?；颊哐逯蠧ys C的水平是存在差異的，提示Cys C參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

作為一種存在于組織內(nèi)的蛋白酶抑制劑，Cys C是目前發(fā)現(xiàn)的對組織蛋白酶B抑制作用最強的抑制物，而組織酶B是腫瘤生長、侵襲、轉移、血管形成等過程中起重要作用的蛋白酶[17]。因此Cys C 的一個生理學功能可能是調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶的活性,進而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。有研究表明，Cys C可能通過調(diào)節(jié)組織蛋白酶B的活性，進而調(diào)節(jié)組織蛋白酶B對組織和細胞的水解作用，進而使得癌細胞向深層組織浸潤發(fā)展[18]。直接浸潤蔓延是胃癌的轉移方式之一，本研究結果表明Cys C可能參與了胃癌的侵襲和轉移。有研究表明，Cys C在結直腸癌患者血清中水平增高，在癌組織中的陽性率也顯著高于癌旁組織，提示Cys C在結直腸癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[19]。另一項關于Cys C在卵巢癌組織中表達的研究表明，Cys C在癌組織中的表達高于正常組織，且可能通過組織蛋白酶B的表達來參與卵巢癌的發(fā)生[18]。

綜上所述，Cys C在胃癌患者血清及組織中較正常者存在差異性表達，對胃癌的診斷具有一定的意義。不同分期胃癌患者Cys C的差異性表達，也提示Cys C可能參與了胃癌的侵襲和轉移，其具體機制有待進一步研究證實。