多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎大鼠炎性因子及TLR4/NF-κB通路的影響

姚 祺，林東梅，林臻影，楊燕燕，莊 躍

(1.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院婦科，福建 福州 350007；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，福建 福州 350007；3.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350007)

子宮內(nèi)膜炎是內(nèi)膜發(fā)生的炎性反應(yīng)，是育齡女性常見的疾病，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)內(nèi)膜壞死等，也是流產(chǎn)的主要原因[1]。一般內(nèi)膜炎是由細(xì)菌感染所致，革蘭陰性菌是感染的主要致病菌，而脂多糖(LPS)是其外膜主要成分，也是誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎的關(guān)鍵因素[2]。病原微生物侵入體內(nèi)，聚集在子宮內(nèi)膜，釋放大量毒素，引發(fā)炎性反應(yīng)，攻擊人體免疫系統(tǒng)，嚴(yán)重危害患者身體健康[3-4]。多西環(huán)素和甲硝唑?qū)儆趶V譜抗生素，對(duì)于治療子宮內(nèi)膜炎具有良好作用，但針對(duì)二者聯(lián)合用于子宮內(nèi)膜炎的報(bào)道較少。為進(jìn)一步了解其機(jī)制，特建立大鼠模型，通過對(duì)比研究，對(duì)聯(lián)合用藥價(jià)值展開分析。

1 資料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康SPF級(jí)SD大鼠50只(8～12周齡雌鼠)，體重(180±20)g，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、多西環(huán)素組、甲硝唑組、聯(lián)合組，每組各10只大鼠。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)過本院動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

1.2大鼠子宮內(nèi)膜炎模型構(gòu)建:①大鼠全身麻醉：除空白組以外的其余4組用適量麻醉藥劑(速眠新注射液0.67 ml/kg)在大鼠腿肌肉后側(cè)進(jìn)行肌內(nèi)注射，5～10 min后大鼠進(jìn)入全身麻醉狀態(tài)，維持1～2 h。②灌注LPS：得到的全身麻醉大鼠倒提，采用大鼠子宮灌注，向子宮內(nèi)推注2.5～5 ml/kg的脂多糖，灌注量為20 μl/只；灌注后保持倒立姿勢(shì)1～2 min，采用適當(dāng)?shù)谋掣共堪茨?，有助于灌注液均勻分布。灌?2～24 h后可成功建立大鼠子宮內(nèi)膜炎模型。

1.3試驗(yàn)分組:第2天開始給予藥物，1次/d，連續(xù)給藥14 d。具體給藥方式如下：①多西環(huán)素組：按30 mg/(kg·d)灌胃多西環(huán)素片(國(guó)藥準(zhǔn)字H32021676，常州制藥廠有限公司生產(chǎn)，0.1 g/d)；②甲硝唑組：按20 mg/(kg·d)灌胃甲硝唑[國(guó)藥準(zhǔn)字H20003083，金日制藥(中國(guó))有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.2 g]；③聯(lián)合用藥組：灌胃多西環(huán)素30 mg/(kg·d)+甲硝唑20 mg/(kg·d)；④模型組：灌胃同等體積無(wú)菌生理鹽水;⑤空白組：不作任何處理。

1.4子宮組織樣本采集:最后一次給藥2 h后處死大鼠并剪開腹腔，抽取5 ml動(dòng)脈血，離心機(jī)(3 000 r/min)離心15 min后分離得到上層血清，在-80℃冰箱保存過夜。用藥組無(wú)菌環(huán)境下處死大鼠取子宮組織，分成兩份，用多聚甲醛固定并保存于-80℃冰箱中。

1.5檢測(cè)項(xiàng)目

1.5.1血清炎性因子檢測(cè):根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明操作，檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平。

1.5.2宮腔病理變化:蘇木素-伊紅染色法(HE染色)觀察子宮組織，將固定的子宮組織按常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色鏡檢觀察。病理觀察指標(biāo)有：①子宮腔有無(wú)粘連、擴(kuò)張；②子宮內(nèi)膜是否有壞死細(xì)胞；③子宮壁是否有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；④子宮內(nèi)膜是否有充血和水腫。根據(jù)病變程度從輕到重計(jì)分為0～4分，0分為無(wú)病變，1分為極輕度，2分為輕度且病變范圍<1/3，3分為中度病變且病變范圍介于1/3～2/3，4分為重度病變，病變范圍>2/3。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度積分：0分為無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，1分為極少量炎癥細(xì)胞，2分為黏膜固有層有少量，3分為肌層查見，4分為全層都有炎性細(xì)胞。累積病變程度和炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)程度積分，總分?jǐn)?shù)越高表明子宮腔炎癥程度越嚴(yán)重。

1.5.3Western印跡檢測(cè)子宮組織核因子κB p65(NF-κB p65)、Toll樣受體4(TLR4)水平:收集子宮組織，采用RIPA裂解液低溫提取總蛋白。二辛可寧酸(BCA)法測(cè)定總蛋白量，于6%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝胺電泳(SDS-PAGE)行組織蛋白電泳，轉(zhuǎn)于聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，根據(jù)目的蛋白選擇相應(yīng)的條帶，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入稀釋過的一抗NF-kB p65(1∶500稀釋)、TLR4(1∶600稀釋)和β-actin(1∶5 000稀釋)，4℃孵育過夜，二抗反應(yīng)。取出聚偏氟乙烯膜，化學(xué)發(fā)光法獲得膠片后進(jìn)行圖像采集，目標(biāo)條帶A值采用QuantityOne凝膠圖像軟件分析，以目標(biāo)條帶與β-actin條帶A值的比值作為活性NF-κB p65、TLR4相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1血清炎性因子水平:模型組IL-2水平高于空白組，TNF-α、IL-4、IL-6水平低于空白組；聯(lián)合用藥組TNF-α、IL-4、IL-6水平均低于模型組，IL-2高于模型組，且聯(lián)合用藥組TNF-α、IL-4、IL-6低于多西環(huán)素組、甲硝唑組，IL-2高于多西環(huán)素組、甲硝唑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6表達(dá)及子宮內(nèi)膜病理程度評(píng)分

2.2宮腔病理變化：空白組結(jié)構(gòu)清晰，子宮內(nèi)膜正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組組織壞死，上皮細(xì)胞脫落，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜下方部分血管彎曲、粗大；多西環(huán)素組結(jié)構(gòu)規(guī)整，組織輕度水腫、較致密，細(xì)胞分布均勻，偶有血管微微擴(kuò)張，損傷較輕；甲硝唑組存在少許炎性細(xì)胞，無(wú)明顯滲血，內(nèi)膜損傷較少；聯(lián)合用藥組：子宮內(nèi)膜有少許損傷，無(wú)滲血，無(wú)細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性反應(yīng)好轉(zhuǎn)。見圖1。與空白組相比，模型組的病理綜合評(píng)分顯著高于空白組；聯(lián)合用藥組的病理綜合評(píng)分低于模型組，且低于多西環(huán)素組、甲硝唑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 大鼠子宮宮腔病理變化(炎性細(xì)胞：藍(lán)色箭頭；血管擴(kuò)張：黃色箭頭，HE，×200)

2.35組子宮組織NF-κB p65、TLR4蛋白水平對(duì)比：模型組NF-κB p65、TLR4相關(guān)蛋白表達(dá)量均高于空白組；聯(lián)合用藥組NF-κB p65、TLR4均低于模型組，且聯(lián)合用藥組NF-κB p65、TLR4低于單獨(dú)用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組相關(guān)蛋白表達(dá)量

3 討論

子宮內(nèi)膜炎是產(chǎn)后子宮內(nèi)部的炎癥反應(yīng)，一般由細(xì)菌感染所致，多發(fā)生于月經(jīng)期、分娩后，感染后導(dǎo)致子宮出血、不孕、流產(chǎn)等。感染常見病原體有革蘭陰性菌，其外膜主要成分為L(zhǎng)PS，LPS是誘發(fā)內(nèi)膜炎的重要原因。為此，建立動(dòng)物模型模擬女性子宮內(nèi)膜炎感染后的情況，能夠有效預(yù)防和對(duì)預(yù)后有重大的意義[5]。臨床上，治療子宮內(nèi)膜炎主要是消除現(xiàn)有炎性反應(yīng)，保證生育的連續(xù)性，抗生素和殺菌劑運(yùn)用到子宮內(nèi)膜炎中，但治療方案仍然是當(dāng)前研究的主題。相關(guān)資料[6]顯示，多西環(huán)素及甲硝唑聯(lián)用對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠子宮內(nèi)膜炎具有保護(hù)作用。蔡忠群[7]的研究顯示，采用甲羥孕酮片聯(lián)合甲硝唑治療子宮內(nèi)膜炎的有效率為95.83%。本研究采用多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑治療大鼠子宮內(nèi)膜炎，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合運(yùn)用會(huì)明顯緩解子宮內(nèi)膜損傷、壞死、細(xì)胞浸潤(rùn)等，改善子宮內(nèi)膜組織受損。

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是抵抗外來病菌的第一道防線，在阻止內(nèi)膜炎發(fā)病中占據(jù)著重要的地位[8]。研究表明[9]，Toll樣受體識(shí)別細(xì)菌的病原體對(duì)于免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能顯得尤為重要，TLR4是一種關(guān)鍵受體，能夠激活NF-κB轉(zhuǎn)位，調(diào)控并參與下游炎性反應(yīng)。IL-2作為抗炎因子，IL-2水平越高患者身體內(nèi)炎性反應(yīng)水平越低，兩者呈負(fù)相關(guān)。此外，IL-2作為評(píng)估免疫功能的重要指標(biāo)，其本質(zhì)上免疫調(diào)節(jié)因子，輔助T細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，引導(dǎo)Lak細(xì)胞產(chǎn)生抗體，同時(shí)促使T細(xì)胞增殖，加強(qiáng)NK細(xì)胞的殺菌消炎作用[10]。TNF-α也是一種炎性因子，自身存在毒性，同時(shí)也促進(jìn)炎性細(xì)胞產(chǎn)生毒素，釋放膠原酶，進(jìn)一步危害人體免疫細(xì)胞，使得人體免疫功能下降，機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)越多，TNF-α、IL-4、IL-6水平升高與炎性水平呈正相關(guān)。多西環(huán)素是治療子宮內(nèi)膜炎的常用抗菌藥物，其作用機(jī)理是通過抑制蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抑菌作用，改變細(xì)胞膜通透性，且耐藥性較小。甲硝唑?qū)儆谙趸蜓苌?，可以阻斷機(jī)體內(nèi)細(xì)菌核酸合成，有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖，降低細(xì)菌數(shù)量，且能清除陰道細(xì)菌，發(fā)揮強(qiáng)效抗菌消炎作用，同時(shí)能夠促進(jìn)抗炎因子IL-2的分泌，共同發(fā)揮效果，促進(jìn)患者康復(fù)[11]。本研究結(jié)果與張瑞等[12]的研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)了多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑用藥，通過影響TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制TLR4/NF-κB激活，可以有效抑制炎性因子，和改善炎性指標(biāo)。

綜上所述，多西環(huán)素聯(lián)合甲硝唑治療子宮內(nèi)膜炎可以有效改善子宮組織受損情況，參與調(diào)節(jié)炎性因子活性，抑制TLR4及NF-κB激活，進(jìn)一步發(fā)揮理想的治療效果。