凍結(jié)及凍藏溫度對小龍蝦凍藏過程中脂質(zhì)氧化的影響

楊海琦，陳季旺，徐 言，田宏偉，廖 鄂,3,4，王海濱,3,4

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北周黑鴨食品工業(yè)園有限公司，湖北 武漢 430000；3.湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點實驗室，湖北 武漢 430023；4.國家小龍蝦加工技術(shù)研發(fā)分中心（潛江），湖北 潛江 433100）

小龍蝦養(yǎng)殖具有季節(jié)性和地域性，這嚴重影響了其加工生產(chǎn)和銷售，因此，小龍蝦需要更長的貯藏期（3個月以上）以延長加工和銷售周期。凍藏能夠最大程度地延緩水產(chǎn)品的品質(zhì)變化，抑制微生物和酶的活性，延長水產(chǎn)品的貯藏期[1-3]。雖然小龍蝦中的脂質(zhì)含量較低，但是不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFAs）含量高，在長期的凍藏過程中，這些脂質(zhì)易發(fā)生氧化。脂質(zhì)氧化不僅改變了小龍蝦的風味，還會導致小龍蝦色澤和質(zhì)地的劣變[4-6]。

國內(nèi)外有關(guān)凍藏水產(chǎn)品脂質(zhì)氧化的報道較多，水產(chǎn)品中UFAs在較低的溫度下能保持液體狀態(tài)，受到冰晶擠壓后更容易被轉(zhuǎn)移到外界，與氧接觸而發(fā)生氧化[7-9]。此外，冰晶可以在凍藏過程中擠壓甚至破壞肌肉細胞，使其釋放誘導脂質(zhì)氧化的促氧化劑（游離鐵等），加快脂質(zhì)氧化[10-11]。傅寶尚等[12]研究凍藏條件（預熟制和直接凍藏）對鮑魚腹足脂質(zhì)變化的影響，通過水蒸氣蒸餾法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric reactive substances，TBARS）值和游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）含量。結(jié)果顯示，鮑魚中的脂質(zhì)氧化主要發(fā)生在凍藏時期，預熟制工藝較好地延緩了凍藏過程中脂質(zhì)的氧化。徐坤華等[13]研究了藍鰭金槍魚的脂質(zhì)和肌紅蛋白在-18、-30、-40、-50 ℃凍藏溫度下的氧化動力學，結(jié)果顯示，隨著凍藏溫度的升高，TBARS值和高鐵肌紅蛋白的含量增加，且變化規(guī)律符合Arrhenius化學反應(yīng)動力學方程。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)中常采用液氮凍結(jié)或者鼓風凍結(jié)小龍蝦原料及其制品。然而，凍結(jié)和凍藏溫度的選擇通常依靠經(jīng)驗判斷，造成了不同批次產(chǎn)品風味、質(zhì)構(gòu)、色澤等品質(zhì)的不穩(wěn)定。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，凍結(jié)及凍藏溫度顯著影響了小龍蝦凍藏過程中的品質(zhì)和蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，但有關(guān)凍結(jié)溫度、凍藏溫度如何影響凍藏小龍蝦脂質(zhì)氧化的研究目前鮮見報道。因此，本研究測定經(jīng)不同溫度凍結(jié)和凍藏小龍蝦肉的脂肪、FFAs含量、脂肪酸組成以及過氧化值（peroxide value，POV）和TBARS值，分析小龍蝦凍藏過程中的脂質(zhì)氧化規(guī)律，探討凍結(jié)及凍藏溫度對小龍蝦脂質(zhì)氧化的影響，以期為小龍蝦加工原料的周年供應(yīng)提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦 湖北周黑鴨食品工業(yè)園有限公司提供。

石油醚、三氯乙酸、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、甲苯、吡啶乙酸銅、正丁醇、甲醇（均為分析純）和正己烷（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；0.01 mol/L硫代硫酸鈉、三氟化硼-甲醇溶液 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-60W388超低溫冰柜 青島海爾生物醫(yī)療有限公司；S2F-06C脂肪測定儀 浙江托普儀器有限公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技有限公司；7200型可見光分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；7890B氣相色譜-質(zhì)譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 凍藏小龍蝦的制備

將大小均一（約10～15 g）的鮮活小龍蝦用自來水沖洗，超聲波清洗（水的添加量以覆蓋蝦體為準）20 min，然后放入沸水中熱燙1 min，裝盒（每盒1 kg小龍蝦），盒中灌入清水（水的添加量以覆蓋蝦體為準）后抽成真空。盒裝小龍蝦分別置于-20、-40、-55 ℃冰柜中凍結(jié)至中心溫度為-15 ℃。將凍好的蝦隨機分為兩組，分別置于-20 ℃和-40 ℃冰柜中凍藏，凍藏周期為24 周，每6 周取樣用于檢測。每次隨機取約1 kg小龍蝦，使用流動水解凍。取蝦肉時去除頭、殼和腸線，蝦肉置于-55 ℃冷柜中放置3 h，使水分凍結(jié)成冰后放入真空冷凍干燥機中，-55 ℃、30 kPa冷凍干燥后粉碎，置于真空袋中，抽真空封口備用。

1.3.2 脂肪質(zhì)量分數(shù)的測定

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[14]的索氏抽提法測定脂肪質(zhì)量分數(shù)。取3 g凍干蝦肉粉移入濾紙筒中，濾紙筒兩端塞入脫脂棉，并用脫脂棉線將濾紙筒固定。將濾紙筒置于索氏抽提器內(nèi)的抽提筒中，然后將抽提筒放進接收瓶（已烘干至恒質(zhì)量）內(nèi)。接收瓶內(nèi)加入瓶容積2/3左右的石油醚，水浴加熱（60 ℃），使石油醚不斷回流并抽提脂肪，抽提時間3.5 h。提取結(jié)束時，用磨砂玻璃棒蘸取一滴提取液，若無油斑則表明提取完畢。取下接收瓶，等瓶內(nèi)溶劑蒸發(fā)至剩余1～2 mL后，于60 ℃水浴加熱0.5 h，蒸發(fā)接收瓶內(nèi)多余的石油醚。蒸發(fā)完全后置于105 ℃烘箱中干燥1 h，干燥器內(nèi)冷卻至室溫（25 ℃）后稱量。脂肪質(zhì)量分數(shù)按公式（1）計算。

式中：ω為蝦肉中的脂肪質(zhì)量分數(shù)/%；m1為恒質(zhì)量的接收瓶和脂肪質(zhì)量/g；m0為接收瓶的質(zhì)量/g；m2為蝦肉粉的質(zhì)量/g。

1.3.3 總脂質(zhì)的提取

采用Folch法提取總脂質(zhì)[15]。將20 g蝦肉粉用200 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）溶解，勻漿至分散后，室溫（25 ℃）下用磁力攪拌器將整個混合物攪拌20 min。過濾勻漿物，收集過濾液。在過濾液中加入一定量的去離子水（每20 mL過濾液加4 mL水），渦旋10 s，離心（5 000 r/min）混合物至分離成兩相。用甲醇-水（1∶1，V/V）溶液沖洗兩液交界面2 次，注意不要沖洗到下層液相。將混合液移入分液漏斗中，靜置分層3 h，取下層液相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)含有脂質(zhì)的下層氯仿相，即得到脂質(zhì)。

1.3.4 FFAs含量的測定

參照Lowry等[16]的方法測定FFAs含量。稱取0.1 g脂質(zhì)，溶于5 mL甲苯中，然后加入1 mL吡啶乙酸銅溶液（質(zhì)量分數(shù)5%，pH 6.0），振蕩2 min?；旌弦河谑覝兀?5 ℃）下3 000 r/min離心5 min，測定上清液在715 nm波長處的吸光度。FFAs含量用每100 g脂質(zhì)中FFAs的質(zhì)量表示。

1.3.5 脂肪酸組成的測定

脂肪酸組成的測定參考文獻[17]的方法。

樣品甲酯化：稱取30 mg脂質(zhì)，氮氣吹掃，加入1 mL 2 mol/L NaOH-甲醇溶液，混合均勻后于60 ℃水浴保溫2 min，再加入1 mL 2 mol/L三氟化硼-甲醇溶液，混勻后于水浴中繼續(xù)放置5 min，取出，于室溫（25 ℃）下加入2 mL正己烷，振蕩搖勻后靜置。待分層后取含脂肪酸甲酯的上層正己烷，加入一定量無水硫酸鈉脫除水分，使用0.22 μm孔徑的有機相濾膜過濾后進行氣相色譜-質(zhì)譜分析，進樣量1 μL。

色譜條件：分析柱為HP-5MS（30 cm×0.25 mm，0.25 μm），高純氦氣為載氣，采用恒壓模式，壓力為16 psi。進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為150 ℃，柱溫以2 ℃/min由150 ℃上升到210 ℃，并且于210 ℃下保持15 min，整個分析過程為45 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃，電子電離離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描周期2.84 次/s，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500。

1.3.6 POV的測定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》[18]中的滴定法測定POV。稱取3 g脂質(zhì)，置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，輕輕振搖使脂質(zhì)完全溶解。準確加入1 mL飽和碘化鉀溶液，塞緊瓶蓋，并輕輕振搖0.5 min，在暗處放置3 min。取出加100 mL水，搖勻后立即用0.01 mol/L硫代硫酸鈉標準液滴定析出的碘，滴定至淡黃色時，加1 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定并強烈振搖至溶液藍色消失為終點。同時進行空白實驗，空白實驗所消耗0.01 mo1/L硫代硫酸鈉溶液體積不得超過0.1 mL。POV按公式（2）計算。

式中：V為脂質(zhì)消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積/mL；V0為空白消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積/mL；c為硫代硫酸鈉標準溶液濃度/（mol/L）；m為脂質(zhì)質(zhì)量/g。

1.3.7 TBARS值的測定

參照李學英等[19]的方法。取3 g攪碎的蝦肉，加入15 mL質(zhì)量分數(shù)為7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1%乙二胺四乙酸），均質(zhì)1 min后過濾。取5 mL過濾液加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，沸水浴加熱20 min，混合物冷卻至室溫（25 ℃）后離心，得到上清液。上清液中加入5 mL質(zhì)量分數(shù)為7.5%的三氯甲烷溶液渦旋混勻，靜置分層，取上清液。用分光光度計分別測定532 nm和600 nm波長處的吸光度。TBARS值按公式（3）計算。

式中：A532nm為在532 nm波長處測得的吸光度；A600nm為在600 nm波長處測得的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組數(shù)據(jù)重復測定3 次，結(jié)果用平均值±標準差表示。應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用方差分析、Duncan多重極差檢驗比較平均值的差異顯著性，P＜0.05判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小龍蝦凍藏過程中脂肪含量的變化

水產(chǎn)品凍藏過程中脂肪含量的變化受自身氧化或被酶水解的影響，金屬催化劑和其他促氧化因子都可以加快氧化過程[20]。由表1可以看出，6 組小龍蝦肉的脂肪含量隨著凍藏時間的延長均呈先下降然后趨于穩(wěn)定的趨勢，且第24周較第12周脂肪含量顯著下降。這是因為凍藏過程中冰晶體積增大，破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)，使得膜上的非血紅素鐵被釋放、氧自由基轉(zhuǎn)化成羥自由基，加快了脂質(zhì)氧化的發(fā)生[21]。

表1 小龍蝦凍藏過程中脂肪質(zhì)量分數(shù)的變化Table 1 Changes in fat content of red swamp crayfish during frozen storage %

凍藏溫度相同時，凍結(jié)溫度對小龍蝦肉中脂肪質(zhì)量分數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）；凍結(jié)溫度相同時，在第18～24周，-40 ℃凍藏小龍蝦肉中的脂肪質(zhì)量分數(shù)顯著高于-20 ℃組（P＜0.05）。這是因為小龍蝦在-20 ℃凍藏過程中更容易發(fā)生重結(jié)晶，更嚴重地破壞了肌肉細胞膜，釋放出更多的非血紅素鐵，促進脂肪氧化。同時，由于包裝盒內(nèi)的真空度較低，小龍蝦肉與空氣接觸可能發(fā)生自動氧化，-20 ℃凍藏溫度較高，自動氧化速度較快，導致脂肪含量較低[4-5]。此外，-40 ℃凍藏溫度可能更好地抑制了蝦肉中脂肪酶的作用，降低了脂肪被水解的程度[22]。

2.2 小龍蝦凍藏過程中FFAs含量的變化

脂質(zhì)的水解程度是評價小龍蝦品質(zhì)劣變程度的常用指標，F(xiàn)FAs是脂質(zhì)被酯酶水解或者化學水解的產(chǎn)物，通過測定FFAs含量可以反映脂質(zhì)的水解程度[23]。由圖1可以看出，6 組小龍蝦肉的FFAs含量隨凍藏時間的延長逐漸增加（P＜0.05），可能是隨著冰晶體積的增大，破壞了肌肉細胞，釋放的脂質(zhì)被酯酶水解，導致FFAs含量增加[24]。同時，在第12～24周FFAs含量較高（P＜0.05），導致脂質(zhì)更快的氧化酸敗。這與脂肪含量在第12～24周顯著減少相印證（P＜0.05）。

圖1 小龍蝦凍藏過程中FFAs含量的變化Fig. 1 Changes in FFAs contents of red swamp crayfish during frozen storage

凍藏溫度相同時，凍結(jié)溫度對FFAs含量的影響不顯著（P＞0.05）；凍結(jié)溫度相同時，-40 ℃的凍藏溫度相較-20 ℃明顯降低了FFAs含量。這與武華等[25]的研究結(jié)果類似，-40 ℃凍藏更好地抑制了小龍蝦中酯酶的活性，降低了脂質(zhì)被酶水解的程度。

2.3 小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化

小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化見表2～4。小龍蝦肉中被檢測出的脂肪酸合計13種，可分為飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）和UFAs兩類，其中UFAs又可以分為單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）。小龍蝦肉中，UFAs含量較多，SFAs含量較少，且PUFAs含量高于MUFAs含量。脂質(zhì)的氧化速率與組成脂質(zhì)的脂肪酸不飽和度、雙鍵位置和構(gòu)型有關(guān)，共軛雙鍵數(shù)目越多，氧化速度越快[26]。UFAs含量較高，脂質(zhì)氧化速度加快，這也是小龍蝦肉脂肪含量在凍藏期間顯著下降的原因之一。

隨凍藏時間的延長，6 組小龍蝦肉中的SFAs相對含量顯著上升（P＜0.05），UFAs和PUFAs相對含量顯著下降（P＜0.05），同時MUFAs相對含量變化不顯著（P＞0.05），說明在整個凍藏周期里，主要發(fā)生氧化的是PUFAs。

在所有的脂肪酸中，油酸（C18:1n9）、二十碳五稀酸（C20:5n3）和棕櫚酸（C16:0）相對含量較高。油酸（C18:1n9）是MUFA的一種，在整個凍藏周期內(nèi)，油酸相對含量變化不顯著（P＞0.05）。MUFAs不含共軛雙鍵，被氧化需要接觸更多氧，而小龍蝦經(jīng)過液封并抽真空處理，凍藏過程中可接觸的氧較少，所以MUFAs相對含量總體無顯著變化（P＞0.05）；二十碳五稀酸（C20:5n3）是PUFAs的一種，隨著凍藏時間的延長其相對含量顯著下降（P＜0.05）。這可能是PUFAs所含共軛雙鍵較多，在凍藏過程中易被氧化。Oh[27]和Sover[28]等均報道凍藏過程中的蛋白質(zhì)變性會導致一部分非血紅素鐵被釋放出來，可能促進脂肪酸氧化。因此，蛋白質(zhì)變性可能也是PUFAs不斷被氧化而減少的原因；棕櫚酸（C16:0）是一種SFA，隨著凍藏時間的延長其相對含量逐漸增加。脂質(zhì)在酯酶的作用下水解產(chǎn)生SFAs，SFAs較穩(wěn)定[24]，因此在小龍蝦肉中的相對含量逐漸增加。

表2 －20 ℃凍結(jié)的小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化Table 2 Changes in fatty acid composition of red swamp crayfish frozen at -20 ℃ during frozen storage %

表3 －40 ℃凍結(jié)的小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化Table 3 Changes in fatty acid composition of red swamp crayfish frozen at –40 ℃ during frozen storage %

表4 －55 ℃凍結(jié)的小龍蝦凍藏過程中脂肪酸組成的變化Table 4 Changes in fatty acid composition of red swamp crayfish frozen at –55 ℃ during frozen storage %

凍藏溫度相同時，凍結(jié)溫度對小龍蝦肉的脂肪酸組成有輕微影響；凍結(jié)溫度相同時，凍藏溫度對脂肪酸組成有明顯影響。顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，-20 ℃凍藏的小龍蝦中形成的冰晶較大（圖未顯示），對肌原纖維蛋白的破壞程度較高，釋放出的非血紅素鐵促進了游離脂肪酸的氧化。同時，-20 ℃凍藏提高了脂質(zhì)的自動氧化速度，加重了脂質(zhì)的氧化程度[4-5]，導致-20 ℃凍藏小龍蝦的PUFAs含量低于-40 ℃凍藏。

2.4 小龍蝦凍藏過程中POV的變化

POV代表脂質(zhì)初級氧化產(chǎn)物的含量。由圖2可以看出，6 組小龍蝦肉POV隨凍藏時間的延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。這是因為小龍蝦肉中UFAs含量較高，共軛雙鍵數(shù)目較多，氧化速度較快[29]。

凍藏溫度相同時，-20 ℃凍結(jié)的小龍蝦肉POV總體高于-40 ℃和-55 ℃。這是因為較高的凍結(jié)溫度會形成更大的冰晶，這些冰晶擠壓蝦肉細胞，使其形變甚至破裂，造成促氧化劑和脂質(zhì)等流出，加快了脂質(zhì)氧化的速度，導致POV更高[29]；凍結(jié)溫度相同時，-40 ℃凍藏的小龍蝦肉的POV明顯低于-20 ℃組。這可能由兩種原因造成：一是-40 ℃凍藏小龍蝦的冰晶增大速度較慢，使得冰晶在整個凍藏周期內(nèi)均小于-20 ℃凍藏組，冰晶越小，破壞的蝦肉細胞越少，減少了促氧化劑和脂質(zhì)等的流出；二是-40 ℃凍藏降低了脂質(zhì)自動氧化的速度，減輕了脂質(zhì)被氧化的程度。

圖2 小龍蝦凍藏過程中POV的變化Fig. 2 Changes in POV of red swamp crawfish during frozen storage

2.5 小龍蝦凍藏過程中TBARS值的變化

TBARS值代表小龍蝦脂質(zhì)氧化次級產(chǎn)物的含量。由圖3可以看出，小龍蝦肉的TBARS值隨凍藏時間的延長總體呈顯著上升的趨勢（P＜0.05）。這與林二妹[30]報道的結(jié)果類似，可能是小龍蝦肉脂質(zhì)氧化的初級產(chǎn)物不斷降解生成丙二醛所致。

凍藏溫度相同時，凍結(jié)溫度對TBARS值的影響總體不顯著（P＞0.05）；凍結(jié)溫度相同時，在凍藏前期，-20 ℃凍藏小龍蝦肉的TBARS值略高于-40 ℃凍藏組；凍藏至第24周時，-20 ℃凍藏小龍蝦肉的TBARS值略高于-40 ℃凍藏組，可能是凍藏溫度-40 ℃較-20 ℃更好地抑制了脂質(zhì)的自動氧化[31-32]。這個結(jié)果與脂肪和FFAs含量、脂肪酸組成及POV的變化趨勢類似，進一步說明了較低的凍結(jié)及凍藏溫度抑制了脂質(zhì)的水解，減輕了凍藏過程中脂質(zhì)的氧化。

圖3 小龍蝦凍藏過程中TBARS值的變化Fig. 3 Changes in TBARS values of red swamp crayfish during frozen storage

3 結(jié) 論

-40 ℃和-55 ℃凍結(jié)的小龍蝦肉中形成的冰晶較小，對肌肉細胞的破壞程度較輕，減少了促氧化劑和脂質(zhì)等的釋放，抑制了脂質(zhì)的水解和氧化；-40 ℃凍藏更好地抑制了重結(jié)晶及蝦肉中酯酶的活性，減輕了對小龍蝦肌肉細胞的損傷，減緩了脂質(zhì)的水解速率。同時，-40 ℃凍藏減緩了脂質(zhì)自動氧化的速率。因此，較低的凍結(jié)及凍藏溫度減輕了凍藏過程小龍蝦肉中脂質(zhì)的氧化程度。在-20～-55 ℃區(qū)間，低溫加快了凍結(jié)速率，但并非選擇更低的凍結(jié)溫度能使小龍蝦達到更佳的貯藏效果，而較低的凍藏溫度（-40 ℃）更好地抑制了小龍蝦凍藏過程中的脂質(zhì)氧化。該研究結(jié)果可為小龍蝦加工原料的周年供應(yīng)提供科學指導。