副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7的抑菌效果及作用機(jī)制

谷恒梅，馬鑫敏，趙 宇，楊衛(wèi)星，孟 鋒，康艷萍，陳 萍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

大腸桿菌O157:H7是造成人類食源性疾病的主要病原體[1]。美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心報(bào)告顯示，2006年美國(guó)每10萬(wàn) 人中就有3.4萬(wàn) 人感染大腸桿菌O157:H7[2]；2012年在德國(guó)因食用被大腸桿菌O157:H7污染的冷凍草莓引起該國(guó)最大的食源性疾病爆發(fā)，約11 000 人感染[3]。

乳酸菌具有抑制致病菌和延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的作用，其主要通過(guò)代謝產(chǎn)物有機(jī)酸、細(xì)菌素來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[4-5]。Wang Ni等[6]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加植物乳桿菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液和控制培養(yǎng)基pH值能有效抑制地衣芽孢桿菌形成生物膜，并延緩細(xì)菌生物膜的形成；孫悅等[7]篩選的乳酸菌XCT1-1無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的粗提物能夠破壞耐藥性大腸桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌作為天然生物抑菌劑被廣泛應(yīng)用于食品安全生產(chǎn)中，其代謝產(chǎn)物副干酪乳桿菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液是能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生積極影響的可溶性物質(zhì)[8]。

殼聚糖是天然的抑菌劑，其相容性較好且安全無(wú)毒[9]。王月慧等[10]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖可與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)反應(yīng)，阻止細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)代謝從而達(dá)到抑菌作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，將具有協(xié)同抑菌作用的殼聚糖與副干酪乳桿菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液粗提物復(fù)配使用可提高抑菌活性，降低單一抑菌劑的使用量，但兩者復(fù)配的抑菌機(jī)理仍有待深入探索。因此，本研究以副干酪乳桿菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液粗提物與殼聚糖復(fù)配作為抑菌劑，對(duì)草莓中大腸桿菌O157:H7進(jìn)行處理，并對(duì)抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜及掃描電子顯微鏡技術(shù)進(jìn)行分析以揭示其抑菌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌O157:H7（CICC21530）、副干酪乳桿菌Z17保藏于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室。

丹東‘九九’草莓購(gòu)于長(zhǎng)春歐亞超市。

碘化丙啶 美國(guó)Beckman Coulter公司；殼聚糖（脫乙酰度大于90%） 深圳市富晟生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DXR3顯微共聚焦激光拉曼光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾公司；SU8010掃描電子顯微鏡 日本日立公司；BDLSRFortessa流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配最佳抑菌條件的確定

1.3.1.1 大腸桿菌O157:H7菌懸液制備

參照王子元等[11]的方法，將大腸桿菌O157:H7菌液以1%的接種量接種于無(wú)菌胰酪大豆胨（tryptic soy broth，TSB）液體培養(yǎng)基，置于搖床中，在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，所得菌液10 000 r/min離心15 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體3 次，加入去離子水稀釋，使菌液濃度達(dá)到108CFU/mL。

1.3.1.2 草莓樣品人工污染

參照Eunice等[12]的方法，草莓用自來(lái)水清洗后再用體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉水溶液浸泡2 min，放入大腸桿菌O157:H7菌懸液中浸泡10 min，自然干燥。

1.3.1.3 副干酪乳桿菌Z17粗提物制備和最小抑菌質(zhì)量濃度的測(cè)定

參照胡誠(chéng)[13]的方法稍作修改，將副干酪乳桿菌Z17菌液以1%的接種量在無(wú)菌MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化2 代，10 000 r/min離心15 min，使用0.45 μm無(wú)菌濾菌器過(guò)濾上清液，將無(wú)細(xì)胞上清液真空冷凍干燥成粉末，制備成副干酪乳桿菌Z17粗提物備用。

用TSB液體培養(yǎng)基將副干酪乳桿菌粗提物溶解并定容至5 mL，使其終質(zhì)量濃度分別為16.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0 mg/mL，分別加入至100 mL 108CFU/mL的大腸桿菌O157:H7懸浮液中，置于搖床中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，用分光光度法和平板涂布法確定副干酪乳桿菌Z17粗提物對(duì)菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度。

1.3.1.4 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液制備和抑菌效果的確定

稱取一定量的殼聚糖粉末溶解于體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸溶液中，加入副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液固體粉末使其達(dá)到最小抑菌濃度，得到副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液。取1.3.1.2節(jié)中草莓樣品隨機(jī)分為7 組，分別靜置于等體積無(wú)菌生理鹽水，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%殼聚糖溶液，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的副干酪乳桿菌-殼聚糖復(fù)配液中，對(duì)應(yīng)記為CK、H、CH0、CH0.5、CH1、CH1.5、CH2組。

將上述處理后的草莓樣品每25 g裝入含有225 mL TSB液體培養(yǎng)基的無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)3 min。用TSB液體培養(yǎng)基稀釋均質(zhì)后的樣品，以平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，按下式計(jì)算減菌率。

1.3.2 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配抑菌機(jī)制分析

1.3.2.1 大腸桿菌O157:H7 DNA胞外釋放量的測(cè)定

參照寧亞維等[14]的方法，將大腸桿菌O157:H7培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入等體積副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液，分別以生理鹽水和體積分?jǐn)?shù)0.1%的Triton X-100為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。37 ℃條件下培養(yǎng)3 h，每小時(shí)用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)上清液中DNA質(zhì)量濃度。

1.3.2.2 大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

參照Hossain等[15]的方法，取1 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期菌懸液經(jīng)過(guò)10 000×g離心30 s后，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.4，下同）重懸菌體使其濃度達(dá)到1×106CFU/mL，加入等體積副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液，以生理鹽水處理作為對(duì)照，混勻靜置10 min后10 000 r/min離心15 min收集菌體，菌體用磷酸鹽緩沖液沖洗并重懸，用質(zhì)量濃度為1 mg/mL碘化丙啶在4 ℃黑暗條件下染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，在650 nm波長(zhǎng)處對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄熒光強(qiáng)度。

1.3.2.3 大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜成分分析

參照Wang Hongsu等[16]的方法，取1.3.2.2節(jié)中加入副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液的菌懸液并進(jìn)行相同處理，以生理鹽水作對(duì)照，10 000 r/min離心15 min后收集菌體。用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液在4 ℃下固定菌體。以體積分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液依次逐級(jí)脫水，再用乙酸異戊酯置換2 次，冷凍干燥樣品。傅里葉變換紅外光譜掃描分析條件：波數(shù)4 000～400 cm-1，最高分辨率4 cm-1，掃描32 次。

1.3.2.4 大腸桿菌O157:H7細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析

參照Lü Xinran等[17]的方法，取1.3.2.2節(jié)中加入副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液的菌懸液并進(jìn)行相同處理，以生理鹽水作對(duì)照，10 000 r/min離心15 min后收集菌體。采用785 nm激發(fā)光收集500～1 750 cm-1范圍內(nèi)的表面增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)，激光功率約為30 mW，曝光時(shí)間為5 s。每個(gè)樣品測(cè)定3 次。取4 μL細(xì)菌樣品溶液進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)。

1.3.2.5 大腸桿菌O157:H7細(xì)胞形態(tài)的觀察

取1.3.2.3節(jié)中乙酸異戊酯置換后冷凍干燥后的樣品粉末，進(jìn)行噴金和掃描電子顯微鏡觀察，電壓1.5 kV、放大倍數(shù)10 000。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，采用SPSS Statistics 19軟件與Origin 2018軟件行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。使用Duncan法進(jìn)行顯著差異性比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7的減除效果

如圖1所示，副干酪乳桿菌粗提物質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL時(shí)即可完全抑制大腸桿菌O157:H7的生長(zhǎng)，同時(shí)用平板涂布法也無(wú)活菌檢出，故確定副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液粗提物對(duì)大腸桿菌O157:H7的最小抑菌質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL。

圖1 副干酪乳桿菌Z17粗提物對(duì)大腸桿菌O157:H7最小抑菌質(zhì)量濃度Fig. 1 Minimum inhibitory concentration of culture supernatant of L. paracei Z17 against E. coli O157:H7

如圖2所示，對(duì)照組鮮食草莓上大腸桿菌O157:H7菌落總數(shù)為4.7（lg（CFU/g）），0、0.5%、1%、1.5%、2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）殼聚糖和副干酪乳桿菌Z17復(fù)配處理組菌落總數(shù)分別為4.131、4.69、2.69、2.74、2.77（lg（CFU/g））。最小抑菌濃度副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液粗提物與1%殼聚糖復(fù)配時(shí)，減菌率已達(dá)到了99%，副干酪乳桿菌Z17（CH0）和殼聚糖（H）單獨(dú)處理組減菌率分別為73%和85%。以上結(jié)果表明，殼聚糖和副干酪乳桿菌Z17復(fù)配有協(xié)同抑菌作用，能有效提高減菌率。選擇1%殼聚糖與最小抑菌質(zhì)量濃度副干酪乳桿菌復(fù)配進(jìn)行后續(xù)抑菌機(jī)制的研究。

圖2 不同濃度副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7的減除效果Fig. 2 Bacteriostatic effect of mixture of different concentrations of chitosan solution with L. paracei Z17 on E. coli O157:H7

2.2 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7 DNA胞外釋放的影響

DNA的釋放情況是判斷其細(xì)胞膜是否被破壞的依據(jù)[18]。由表1可以看出，副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖溶液復(fù)配液處理組大腸桿菌O157:H7 DNA的胞外釋放量遠(yuǎn)高于陰性對(duì)照組，在3 h時(shí)內(nèi)DNA的釋放量不斷增加，在第3小時(shí)DNA釋放量達(dá)（381.00±3.53）ng/μL。因此推斷植物乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)合溶液是通過(guò)破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致大腸桿菌O157:H7死亡。郭行[19]從鼠李糖乳桿菌中分離純化的新型細(xì)菌素也通過(guò)破壞大腸桿菌細(xì)胞膜的方式導(dǎo)致DNA胞外泄漏，在4 h內(nèi)DNA泄漏量可達(dá)187.57 ng/μL，與之相比本實(shí)驗(yàn)中副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖溶液復(fù)配液對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜的破壞作用更劇烈。

表1 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7 DNA胞外釋放的影響Table 1 Effect of chitosan-L. paracei Z17 mixture on extracellular DNA release from E. coli O157:H7

2.3 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜完整性的影響

碘化丙啶是用于檢驗(yàn)細(xì)胞膜完整性的熒光染色劑，只有在細(xì)菌細(xì)胞膜受到破壞或細(xì)胞已經(jīng)死亡時(shí)，碘化丙啶才能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部與DNA或RNA嵌合，從而產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度可表示實(shí)驗(yàn)中所收集的大腸桿菌O157:H7細(xì)胞中受損細(xì)胞所占百分比，即細(xì)胞膜破損率[20]。

由圖3A可知，經(jīng)生理鹽水處理的對(duì)照組，大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜破損率為0.9%。由圖3B可知，副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖溶液復(fù)配處理組大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜破損率為58.3%，處理組的大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜破損率遠(yuǎn)高于對(duì)照組。楊昆等[21]研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7菌懸液加入抗菌肽BCp12培養(yǎng)6 h后，細(xì)胞膜的破壞率可以達(dá)到25.1%。本實(shí)驗(yàn)中副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖溶液復(fù)配處理對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜的破壞作用比其更強(qiáng)。

圖3 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 3 Effect of L. paracei Z17- chitosan mixture on cell membrane integrity in E. coli O157:H7

由此可知，經(jīng)副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配溶液處理組后，菌體細(xì)胞膜受到損傷，通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。初步推測(cè)副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液粗提物中的酶類、蛋白或多肽類抗菌物質(zhì)通過(guò)連接嵌入作用破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜。

2.4 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜成分的影響

傅里葉變換紅外光譜技術(shù)可以分析微生物細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁的組成和成分變化情況。大腸桿菌O157:H7細(xì)胞的紅外光譜圖呈現(xiàn)出革蘭氏陰性菌的特征振動(dòng)峰，它由幾個(gè)重要的峰組成，一般可分為4個(gè)部分用以區(qū)分不同的微生物細(xì)胞成分[22-23]：1）指紋信息區(qū)：900～500 cm-1；2）細(xì)胞壁多糖信息區(qū)：1 200～900 cm-1；3）蛋白和多肽酰胺信息區(qū)：1 800～1 500 cm-1；4）脂肪酸信息區(qū)：3 000～2 800 cm-1。

如圖4所示，1 450～1 230 cm-1附近的吸收峰增強(qiáng)，此吸收峰歸因于肽聚糖中氨基酸和脂肪酸鏈羧酸酯基團(tuán)（—COO—）中C＝O鍵的對(duì)稱拉伸振動(dòng)；1 650 cm-1和1 450 cm-1周圍的特征峰對(duì)應(yīng)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、鞭毛、菌毛和核糖體中酰胺I帶和酰胺II帶；其中，1 650 cm-1處吸收峰歸因于C＝O的振動(dòng)，1 450 cm-1處吸收峰歸因于肽基基團(tuán)N—H鍵和C—N鍵的彎曲和拉伸；圖4中副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配處理組1 650 cm-1和1 450 cm-1附近峰強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照組明顯下降，表明副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配處理對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜或壁上的蛋白質(zhì)造成破壞；2 930 cm-1附近的吸收峰歸因于脂肪酸和脂類中的甲基（—CH3）和亞甲基（—CH2）官能團(tuán)的C—H對(duì)稱拉伸譜帶拉伸振動(dòng)；1 080 cm-1附近吸收峰主要對(duì)應(yīng)糖苷鏈多糖中的醚和許多細(xì)胞的構(gòu)成成分肽聚糖，此外還對(duì)應(yīng)磷脂、核酸、脂肪糖中的含磷基團(tuán)，此處峰強(qiáng)度的降低主要是由于磷脂中官能團(tuán)P—O以及PO2的不對(duì)稱拉伸振動(dòng)；副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液處理組在以上5個(gè)區(qū)間的吸收峰強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，由此可知細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)、肽聚糖成分被破壞，使大腸桿菌O157:H7失去活性。傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果進(jìn)一步證明了副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液對(duì)大腸桿菌O157:H7第一作用靶點(diǎn)是細(xì)胞膜，可能是副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵液和殼聚糖中的基團(tuán)與細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)基團(tuán)相互作用，其大量聚集使膜局部位移變薄，最后形成孔洞，大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)菌內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。

圖4 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜成分的影響Fig. 4 Effect of L. paracei Z17-chitosan mixture on cell membrane composition of E. coli O157:H7

2.5 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

拉曼光譜是一種靈敏的成像工具，大腸桿菌O157:H7細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異可通過(guò)拉曼光譜表征。如圖5所示，大腸桿菌O157:H7在827～840、845～880、1 095～1 100、1 494 cm-1和1 590 cm-1處有明顯的特征峰，對(duì)照組峰強(qiáng)度明顯高于處理組。827～840 cm-1處特征峰能夠表征酪氨酸含量；845～880 cm-1和1 590 cm-1特征峰能夠表征細(xì)胞壁中肽聚糖含量[25-26]；1 494 cm-1處特征峰歸因于C＝C、C—H伸縮振動(dòng)；拉曼光譜分析再次證實(shí)副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配能夠破壞大腸桿菌O157:H7細(xì)胞壁中肽聚糖、糖苷環(huán)、多糖結(jié)構(gòu)。

圖5 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配處理大腸桿菌O157:H7拉曼光譜圖Fig. 5 Raman spectra of E. coli O157:H7 treated with L. paracei Z17-chitosan mixture

2.6 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖6A可知，對(duì)照組樣品飽滿完整、形態(tài)均勻。由圖6B可知，經(jīng)副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液處理后，菌體細(xì)胞表面塌陷、出現(xiàn)孔洞、局部破裂，菌體細(xì)胞壁失去剛性，發(fā)生質(zhì)壁分離、細(xì)胞膨脹，最后裂解死亡。由此可知，副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配液處理可破壞大腸桿菌O157:H7的細(xì)胞完整性。

圖6 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞表面形態(tài)的影響Fig. 6 Effect of L. paracei Z17-chitosan mixture on cell surface morphology of E. coli O157:H7

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究了副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液粗提物對(duì)大腸桿菌O157:H7的抑菌作用，確定其最小抑菌濃度為6.0 mg/mL，其與殼聚糖溶液復(fù)配處理對(duì)草莓中的大腸桿菌O157:H7有協(xié)同抑菌作用，且抑菌效果強(qiáng)于單獨(dú)使用。從大腸桿菌O157:H7細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的完整性、細(xì)胞壁膜成分3個(gè)方面分別探討了副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液粗提物與殼聚糖復(fù)配對(duì)大腸桿菌O157:H7作用機(jī)制。結(jié)果表明，其主要作用點(diǎn)在細(xì)胞膜上，副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液粗提物通過(guò)破壞大腸桿菌O157:H7細(xì)胞壁中肽聚糖、糖苷環(huán)、多糖結(jié)構(gòu)成分，引起菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，從而導(dǎo)致DNA胞外泄漏，細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的流失，細(xì)胞正常生理代謝活動(dòng)被擾亂，這與Smaoui[27]和Kamal[28]等的研究結(jié)果相似。Hoda等[29]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能形成薄膜吸附在細(xì)胞膜上，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入，從而達(dá)到抑菌的作用。李小芳[30]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖通過(guò)滲透作用進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)結(jié)合，影響DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成，從而阻礙mRNA的合成，抑制細(xì)菌的繁殖，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液粗提物與殼聚糖復(fù)配有協(xié)同抑菌效果，推測(cè)可能是副干酪乳桿菌Z17發(fā)酵上清液破壞細(xì)胞膜后，殼聚糖大分子物質(zhì)部分黏附在細(xì)胞壁膜表面，部分隨之進(jìn)入細(xì)胞中，加快了細(xì)胞中內(nèi)容物的泄漏，同時(shí)菌體死亡速度也隨之提升。