天然精油協(xié)同等離子體對鹽水鴨殺菌保鮮及脂質(zhì)氧化的調(diào)控

錢 婧，王 晨，嚴(yán)文靜，章建浩

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

鹽水鴨作為醬鹵肉制品，水分活度高，具有現(xiàn)做即食、不適宜貯藏的特點(diǎn)，因此產(chǎn)品的貨架期普遍較短。此外，由于其特殊的低溫煮制工藝，不適宜進(jìn)行高溫高壓的傳統(tǒng)滅菌，故難以大規(guī)模生產(chǎn)和擴(kuò)大銷售范圍[1]。雖然現(xiàn)有的真空包裝或經(jīng)商業(yè)殺菌的鹽水鴨具有較長的保質(zhì)期，但其特有的香酥口感和風(fēng)味會受到影響。因此，開發(fā)一種適用于低溫肉制品的新型殺菌技術(shù)是目前該行業(yè)發(fā)展的重要瓶頸。

低溫等離子體（cold plasma，CP）作為食品行業(yè)的一種新型殺菌技術(shù)，具有處理溫度低、營養(yǎng)物質(zhì)破壞小、不破壞產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)、顯著延長食品保質(zhì)期等優(yōu)點(diǎn)，近年來備受關(guān)注[2-4]。在高壓條件下，空氣被電離形成含有活性氧、活性氮、原子、電子、離子的第4態(tài)，即為等離子體[5-6]。CP處理過程中產(chǎn)生的活性氧和活性氮等活性物質(zhì)已被證明有利于微生物的失活[7-8]，但當(dāng)CP應(yīng)用于肉類等食物時(shí)，會導(dǎo)致脂質(zhì)氧化，影響其感官品質(zhì)[3,9]。Choi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，魚干經(jīng)等離子體處理后其硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值與對照組相比增加1.5 倍。Wang Xiaoting等[11]采用介質(zhì)阻擋放電CP處理牛肉餅，結(jié)果表明，在貯藏過程中CP處理組樣品的TBARs值顯著升高。但當(dāng)一種新的殺菌技術(shù)應(yīng)用于食品時(shí)，在保證高效殺菌的同時(shí)必須確保不會對產(chǎn)品產(chǎn)生重大影響。微生物污染和脂質(zhì)氧化是肉質(zhì)惡化的主要原因，會導(dǎo)致肉的色、香、味發(fā)生不良變化，營養(yǎng)價(jià)值和安全性降低[12]，因此，調(diào)控肉的脂質(zhì)氧化現(xiàn)象具有重要意義。富含酚類物質(zhì)的精油是一個(gè)很好的選擇，它已被廣泛應(yīng)用于食品的抗氧化[13-14]。此外，精油也可用于食品的抗菌保鮮，其抗菌活性與單萜類、酚類、醛類和酮類化合物密切相關(guān)[15]。Viuda-Martos等[16]發(fā)現(xiàn)，精油中活性成分會作用于細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂層，并破壞脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。El Atki等[17]進(jìn)一步指出，不同精油經(jīng)復(fù)合后，在不增加濃度的情況下可提高其抗菌效果，如將肉桂精油與其他植物精油復(fù)合后，與單一精油相比，對細(xì)菌的抑菌效果顯著提高。

本研究采用復(fù)合精油（牛至精油、肉桂精油、迷迭香精油）協(xié)同CP技術(shù)對鹽水鴨進(jìn)行處理，以實(shí)現(xiàn)在殺菌和保持產(chǎn)品品質(zhì)上達(dá)到平衡。研究CP處理對復(fù)合精油基礎(chǔ)理化性質(zhì)，包括大腸桿菌抑菌性、總酚含量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的影響；并將復(fù)合精油協(xié)同CP處理鹽水鴨，對貯藏期內(nèi)鹽水鴨的菌落總數(shù)、大腸桿菌菌落總數(shù)、色澤及TBARs值進(jìn)行測定，為復(fù)合精油協(xié)同CP技術(shù)在低溫肉制品保鮮中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽水鴨由南京鹽水鴨加工企業(yè)提供。

牛至精油 上海Macklin科技有限公司；肉桂精油上海源葉生物科技有限公司；脂溶性迷迭香 上海瑞祥生物科技有限公司；福林酚 上海瑞永生物科技有限公司；沒食子酸 上海阿拉丁生物科技有限公司；DPPH 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MAP-H360盒式氣調(diào)保鮮包裝機(jī) 蘇州森瑞保鮮設(shè)備（科技）有限公司；BK130/36介質(zhì)阻擋放電CP設(shè)備美國Phenix Technologies公司；CR-400色差儀日本柯尼卡-美能達(dá)控股公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合精油的制備

用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)均分別為0.050%、0.075%、0.100%、0.125%的牛至精油和肉桂精油，將2 種相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的精油再與0.3 g/kg脂溶性迷迭香混合，復(fù)合精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)以牛至精油/肉桂精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)。復(fù)合精油的具體配制方法如下：稱取30 mg脂溶性迷迭香提取物于250 mL燒杯中，加入50 μL相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛至精油和肉桂精油，加入40 mL無水乙醇，超聲至完全分散，再加入60 mL無菌超純水，超聲15 min。

1.3.2 CP協(xié)同復(fù)合精油的抑菌實(shí)驗(yàn)

從-40 ℃取出傳代培養(yǎng)2 次的大腸桿菌菌種保藏管，加至營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行活化，于37 ℃、300 r/min的條件下培養(yǎng)10 h。菌液4 ℃、7 500 r/min離心10 min，去上清，生理鹽水清洗3 次，通過調(diào)整菌液光密度將菌液濃度稀釋至108CFU/mL。

將菌液轉(zhuǎn)移至無菌12 孔板中，每5 mL菌液中加入1 mL復(fù)合精油，輕微混勻。將孔板置于聚乙烯熱成型盒（17 cm×12 cm×3.2 cm）內(nèi)，用包裝機(jī)進(jìn)行聚丙烯薄膜密封。隨后置于CP設(shè)備內(nèi)進(jìn)行處理，處理電壓65 kV[18]，處理時(shí)間30 s，處理后放置2 h。將未經(jīng)CP處理的組別作為對照組，經(jīng)CP處理的組別記為CP組。參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》對大腸桿菌菌落數(shù)進(jìn)行測定。

1.3.3 復(fù)合精油總酚含量的測定

參照Thiruvengadam等[19]的方法并略作修改。用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液配制0.1 mg/mL沒食子酸溶液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒食子酸溶液置于具塞玻璃管中，分別加入6 mL超純水和0.5 mL 1 mol/L福林酚試劑，輕微振蕩后，避光靜置10 min。用0.1 g/mL Na2CO3溶液分別定容至10 mL，充分混勻，置于暗處反應(yīng)2 h，用紫外分光光度計(jì)于763 nm波長處測定吸光度，并繪制該質(zhì)量濃度梯度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取0.1 mL經(jīng)CP處理或未經(jīng)CP處理的復(fù)合精油，加入6 mL超純水和0.5 mL福林酚試劑，振蕩混勻避光靜置10 min后，加入3.4 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，置于暗室使其充分反應(yīng)2 h，于763 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到總酚含量。樣品中總酚含量以每克樣品所含沒食子酸質(zhì)量計(jì)，單位為mg/g。

1.3.4 復(fù)合精油DPPH自由基清除率的測定

參照Li Xican等[20]的方法稍作改進(jìn)。稱取8 mg DPPH，用100 mL無水乙醇充分溶解，制得0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。吸取2 mL經(jīng)CP處理或未經(jīng)CP處理的復(fù)合精油于具塞試管中，并與等體積DPPH溶液振蕩均勻，室溫暗處靜置反應(yīng)0.5 h，于517 nm波長處測定吸光度。同時(shí)，測定2 mL DPPH溶液與2 mL體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液混合后的吸光度。復(fù)合精油的DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A0為DPPH溶液與體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液反應(yīng)后的吸光度；A樣為DPPH溶液與復(fù)合精油反應(yīng)后的吸光度。

1.3.5 鹽水鴨樣品處理

將鹽水鴨切塊，部分樣品置于聚乙烯熱成型盒（17 cm×12 cm×3.2 cm），每盒100 g，用包裝機(jī)進(jìn)行聚丙烯薄膜密封；另一部分樣品置于0.100%復(fù)合精油（由1.3.2節(jié)得出的最優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)）中浸泡5 min，瀝干后包裝密封。按表1條件進(jìn)行處理，于4 ℃貯藏。貯藏至0、6、12、18 d時(shí)，從4 組中各隨機(jī)抽取3 盒進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

表1 鹽水鴨樣品的不同處理?xiàng)l件Table 1 Different treatment conditions for salted duck samples

1.3.6 鹽水鴨中菌落總數(shù)及大腸桿菌的測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》進(jìn)行菌落總數(shù)測定，參照GB 4789.3—2016進(jìn)行大腸桿菌測定。

1.3.7 鹽水鴨色差值的測定

采用色差儀測定樣品表面亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*），每個(gè)樣品測定3 次，每組隨機(jī)選3 個(gè)樣品，樣品總色差（ΔE）按式（2）計(jì)算[21]。

式中：L0*、a0*和b0*為樣品初始顏色參數(shù)；L*、a*和b*為樣品貯藏過程中的顏色參數(shù)。

1.3.8 鹽水鴨TBARs值的測定

參照Xiong Zhenjie[22]、彭澤宇[23]等方法并加以修改。稱取（10.0±0.1）g肉樣，剪碎后加入50 mL 75 g/L三氯乙酸溶液，混勻，加塞密封，于37 ℃下恒溫水浴振蕩30 min，用雙層濾紙過濾2 次，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，混勻，于90 ℃下水浴40 min，取出冷卻至室溫，7 000 r/min離心10 min，取上清。在上清液中加入5 mL氯仿，混勻，靜置分層，取上清于532 nm波長處測定吸光度。TBARs值按式（3）計(jì)算。

式中：m為樣品質(zhì)量/g；A532nm為樣品在532 nm波長處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。對于總酚含量和DPPH自由基清除率測定結(jié)果采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CP協(xié)同復(fù)合精油對大腸桿菌的抑菌效果

由圖1可知，當(dāng)不添加復(fù)合精油時(shí)，40%乙醇溶液對大腸桿菌幾乎沒有抑菌性，協(xié)同CP處理30 s后，對大腸桿菌的抑菌效果仍不明顯，僅能降低0.56（lg（CFU/mL））。隨著復(fù)合精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，大腸桿菌菌落數(shù)隨之降低，且當(dāng)復(fù)合精油協(xié)同CP處理時(shí)，對大腸桿菌的抑菌效果更為明顯。當(dāng)復(fù)合精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.075%且協(xié)同CP處理時(shí)，大腸桿菌菌落數(shù)由5.2（lg（CFU/mL））降至2.75（lg（CFU/mL））。當(dāng)復(fù)合精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.100%～0.125%且協(xié)同CP處理時(shí)，大腸桿菌未檢出。El Atki等[24]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂精油與百里香酚和香芹酚復(fù)合使用對大腸桿菌具有顯著的抑菌作用。此外，肉桂精油中的主要活性成分肉桂醛具有較好的保鮮抑菌性，但分子遇光、熱、氧不穩(wěn)定易降解，與天然多酚復(fù)配可有效提高肉桂醛的穩(wěn)定性[25]。以上結(jié)果表明，CP協(xié)同復(fù)合精油處理會加速細(xì)菌的死亡。

圖1 復(fù)合精油協(xié)同CP處理對大腸桿菌抑菌效果的影響Fig.1 Inhibitory effect of essential oil blend combined with CP on E.coli

2.2 CP處理對復(fù)合精油總酚含量和DPPH自由基清除率的影響

由表2可知，隨著復(fù)合精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其總酚含量和DPPH自由基清除率顯著提高。且隨著總酚含量的增加，對應(yīng)的DPPH自由基清除率也隨之增強(qiáng)，表明復(fù)合精油的抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，這與盧俊宇等[26]研究中茶多酚復(fù)合膜總酚含量和DPPH自由基清除率的變化趨勢一致。與對照組相比，CP組總酚含量略有下降，由0.27～0.43 mg/g降至0.25～0.41 mg/g；DPPH自由基清除率也略有降低，從89.11%～94.25%降至88.91%～93.52%。以上結(jié)果表明，CP處理并不會對復(fù)合精油的總酚含量和DPPH自由基清除率造成顯著影響。但Umair等[27]研究表明，CP處理會對胡蘿卜汁中酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性造成影響；同時(shí)Kodama等[28]研究發(fā)現(xiàn)，CP處理會造成柑橘精油中烯萜類物質(zhì)含量降低。這可能歸因于復(fù)合精油的初始總酚含量相對較高，且CP處理電壓及時(shí)間相對較低/短，故未對復(fù)合精油的抗氧化特性造成顯著影響。

表2 CP處理對復(fù)合精油總酚含量和DPPH自由基清除率的影響Table 2 Effect of CP on the total phenol content and DPPH radical scavenging capacity of essential oil blend

2.3 不同處理?xiàng)l件對鹽水鴨菌落總數(shù)及大腸桿菌的影響

由圖2可知，對照組菌落總數(shù)在貯藏18 d內(nèi)由4.46（lg（CFU/g））增至6.52（lg（CFU/g）），CP組由2.97（lg（CFU/g））增至5.69（lg（CFU/g）），EO組由3.12（lg（CFU/g））增至6.23（lg（CFU/g）），而EO＋CP組僅由2.12（lg（CFU/g））增至5.01（lg（CFU/g））。以上結(jié)果表明，CP處理和EO處理均對樣品具有抑菌效果，且EO協(xié)同CP處理的抑菌效果更為顯著。按照GB 2726—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》，對照組菌落總數(shù)貯藏6 d已達(dá)到臨界值4.903（lg（CFU/g）），相比之下，EO＋CP組抑菌效果最佳，當(dāng)貯藏至12 d時(shí)其菌落總數(shù)為3.75（lg（CFU/g）），仍低于臨界值，且貯藏18 d時(shí)才增至5.01（lg（CFU/g））。由此可知，EO協(xié)同CP處理可顯著降低鹽水鴨中的菌落總數(shù)，這與Moradi[29]、Gao Yue[30]等的研究相一致。

圖2 復(fù)合精油協(xié)同CP處理對貯藏期內(nèi)鹽水鴨菌落總數(shù)的影響Fig.2 Effect of essential oil blend combined with CP on the total bacterial count of salted duck during storage

由圖3可知，貯藏0 d時(shí)，EO組與EO＋CP組大腸桿菌菌落數(shù)無顯著差異，分別為1.08、0.87（lg（CFU/g）），對照組和CP組分別為2.65、1.89（lg（CFU/g））。但隨著貯藏時(shí)間的延長，EO組與EO＋CP組的差異增大，EO＋CP組菌落數(shù)增長更為緩慢，表明CP處理和復(fù)合精油具有較好的協(xié)同抑菌作用。

圖3 復(fù)合精油協(xié)同CP處理對貯藏期內(nèi)鹽水鴨大腸桿菌菌落數(shù)的影響Fig.3 Effect of essential oil blend combined with CP on E.coli count of salted duck during storage

2.4 不同處理?xiàng)l件對鹽水鴨色澤的影響

肉品的色澤和外觀是消費(fèi)者首要考慮的產(chǎn)品屬性[31]。ΔE越大，表明樣品的色差值與原始色澤之間的差異越大。由圖4可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，鹽水鴨ΔE顯著上升，這可能與樣品表面的腐敗變質(zhì)程度有關(guān)[32]。

圖4 復(fù)合精油協(xié)同CP處理對貯藏期內(nèi)鹽水鴨ΔE的影響Fig.4 Effect of essential oil blend combined with CP on the ΔE of salted duck during storage

由圖5可知，當(dāng)4 組樣品貯藏18 d時(shí)，對照組已經(jīng)明顯發(fā)生腐敗變質(zhì)，肉色變暗，樣品表面出現(xiàn)小顆粒狀物質(zhì)，且具有黏性。相比之下，在貯藏過程中，CP組和EO組間的ΔE差異不顯著（圖4），在貯藏末期，2 組樣品表面只是部分出現(xiàn)顆粒狀異物。EO＋CP組樣品則在外觀色澤上品質(zhì)最佳。

圖5 復(fù)合精油協(xié)同CP處理對貯藏18 d后鹽水鴨外觀的影響Fig.5 Effect of essential oil blend combined with CP on the appearance of salted duck after 18 days of storage

2.5 不同處理?xiàng)l件對鹽水鴨TBARs值的影響

TBARs值反映丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，MDA是脂質(zhì)二級氧化的主要產(chǎn)物，也是肉類制品中最常用的脂質(zhì)氧化指示物。由圖6可知，樣品的TBARs值隨著貯藏時(shí)間的延長而增加，對照組樣品由1.91 mg/kg增至5.84 mg/kg，CP組由3.29 mg/kg增至6.87 mg/kg，EO組由0.94 mg/kg增至3.95 mg/kg，而EO＋CP組僅由1.12 mg/kg增至4.58 mg/kg。在所有組別中，CP組樣品的TBARs值最高，EO組最低。此外，EO＋CP組樣品的TBARs值低于對照組。表明復(fù)合精油處理不僅能緩解CP處理對鹽水鴨造成的脂質(zhì)氧化，且能減弱樣品自身在貯藏期內(nèi)的脂質(zhì)氧化現(xiàn)象。這與Gao Yue等[30]的研究結(jié)果一致，在雞肉餅中添加1%迷迭香提取物可顯著降低CP處理和非CP處理組樣品貯藏期內(nèi)的TBARs值。

圖6 復(fù)合精油協(xié)同CP處理對貯藏期內(nèi)鹽水鴨TBARs值的影響Fig.6 Effect of essential oil blend combined with CP on TBARs value of salted duck during storage

3 結(jié) 論

本研究分析復(fù)合精油協(xié)同CP處理對鹽水鴨品質(zhì)的影響，以調(diào)控CP處理導(dǎo)致的肉品脂質(zhì)氧化現(xiàn)象。結(jié)果表明：當(dāng)復(fù)合精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.100%～0.125%且協(xié)同CP處理大腸桿菌菌液時(shí)，大腸桿菌未檢出；且CP處理未對復(fù)合精油的抗氧化特性造成顯著影響；同時(shí)，復(fù)合精油協(xié)同CP處理可使鹽水鴨貯藏時(shí)間顯著延長，且對表觀品質(zhì)無顯著影響，并能減緩產(chǎn)品貯藏過程中的脂質(zhì)氧化現(xiàn)象。本研究結(jié)果為低溫肉制品的保鮮提供了參考，為分析其在肉制品中應(yīng)用的可行性及前景，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討精油與CP聯(lián)合處理對產(chǎn)品風(fēng)味的影響。