粉末X射線衍射法測定消咳寧片中碳酸鈣含量

張建平，孫倩男，周雪梅，王 棟

（內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010020）

消咳寧片為復(fù)方制劑，主要成分為鹽酸麻黃堿、甘草浸膏、苦杏仁、石膏和碳酸鈣. 消咳寧片的功能止咳，碳酸鈣可溫肺平喘. 《中華人民共和國藥典》（2020年版二部）對(duì)碳酸鈣原料藥的描述為“本品為白色極細(xì)微的結(jié)晶性粉末”[2]. 制作消咳寧片時(shí)，碳酸鈣粉末直接入藥. 壓片過程由于施加外界壓力，會(huì)誘導(dǎo)晶型物質(zhì)向更穩(wěn)定的晶型狀態(tài)轉(zhuǎn)化，碳酸鈣的穩(wěn)定晶型為方解石型，通過試驗(yàn)可以明確其晶型結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，因此可以對(duì)碳酸鈣采用X射線衍射法進(jìn)行定性及定量分析.

X射線衍射法（XRD）是目前普遍采用的確定物質(zhì)晶型結(jié)構(gòu)、進(jìn)行物質(zhì)定性分析的方法[3]. 在中成藥中，采用該方法進(jìn)行定量研究的比較少見，但中成藥中對(duì)相關(guān)晶型成分進(jìn)行晶型確證的同時(shí)，也存在定量測定的需求，主要原因在于檢驗(yàn)方法開發(fā)過程中必須采用內(nèi)標(biāo)定量法才能保證方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性符合要求. 王禎旭等[4]采用XRD檢測中成藥及保健品中的11種非法添加壯陽類物質(zhì)，定性檢測采用XRD方便快捷，相比傳統(tǒng)檢驗(yàn)檢測方法速度快、干擾少. 陳樂等[5]通過消除干擾方法的樣品預(yù)處理過程，采用XRD分析金紅石晶種并定量測定了晶種的金紅石轉(zhuǎn)化率. 干泓俠等[6]建立了藏藥佐太的XRD指紋圖譜，并采用全譜擬合法對(duì)佐太樣品進(jìn)行定性和定量分析.

由于消咳寧片中碳酸鈣和硫酸鈣均為鈣鹽，無法通過測定鈣含量單獨(dú)定量碳酸鈣，因此如何測定碳酸鈣含量成為亟待解決的問題. 通過文獻(xiàn)查閱，未發(fā)現(xiàn)有消咳寧片中碳酸鈣含量測定的報(bào)道. 目前檢測碳酸鈣的方法主要是通過測定鈣離子的含量進(jìn)行，包括滴定法[7-9]、儀器測定法[10-12]. 但上述方法均存在無法排除其他鈣鹽干擾的問題，甚至有將有機(jī)物質(zhì)中的鈣離子也計(jì)算在其中的風(fēng)險(xiǎn). 鑒于XRD的專屬特性，本文通過試驗(yàn)，最終確定采用粉末X射線衍射法（PXRD）定量測定消咳寧片中碳酸鈣含量. 并對(duì)該方法進(jìn)行方法驗(yàn)證，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確、可靠且穩(wěn)定.

1 試驗(yàn)部分

1. 1 儀器與試劑

BRUKER D8 ADVANCEX射線衍射儀（布魯克科技有限公司）；全譜分析軟件（Total Pattern Solution，TOPAS軟件）. 碳酸鈣藥材，北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司提供，乙二胺四乙酸（EDTA）滴定法測得碳酸鈣（CaCO3）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%；石膏，北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司提供；氧化鋅（ZnO）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：GBW06108c，純度99.97%. 1、2、3號(hào)樣品，北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司；4、5號(hào)樣品，赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司；6號(hào)樣品，赤峰萬澤藥業(yè)股份有限公司.

1. 2 儀器條件

X射線發(fā)生器電壓：40 kV，電流：45 mA，掃描類型：Coupled Two Theta/Theta，掃描模式：Continuous PSD fast，衍射角（2θ）掃描：8 °～40 °，步長：0.02 °.

1. 3 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)選擇

選用ZnO作為內(nèi)標(biāo)物，且加入量為5%左右.

1. 4 內(nèi)標(biāo)樣品粉末的制備

取樣品適量，研磨成粉末，過六號(hào)篩，精密稱取4 g，精密稱取ZnO 0.2 g，同置研缽中，充分研磨5 min以上使混合均勻，即得. ZnO作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，其相應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式如下：

其中，m為樣品取樣量（g），m0為ZnO取樣量（g）.

1. 5 數(shù)據(jù)采集

取1. 4節(jié)下制備的加內(nèi)標(biāo)樣品粉末適量，采用正壓法壓片后，采用1. 2節(jié)的條件上機(jī)測定（測定前儀器用剛玉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正），即得加內(nèi)標(biāo)樣品PXRD圖譜.

1. 6 結(jié)果計(jì)算

對(duì)采集到的PXRD圖譜進(jìn)行定性分析，通過匹配檢索，確定物相組成，找到CaCO3和ZnO物相的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)（crystallography open database，COD號(hào)）和標(biāo)準(zhǔn)衍射卡片（powder diffraction file，PDF卡片）文件. 在TOPAS軟件中打開掃描得到的加內(nèi)標(biāo)樣品的PXRD圖譜，同時(shí)載入CaCO3和ZnO的PDF卡片，CaCO3、ZnO和樣品PXRD圖譜如圖1、2所示，加內(nèi)標(biāo)樣品的PXRD圖譜如圖3所示. 圖3中峰1、5是CaCO3的定量峰，峰2、3、4是ZnO內(nèi)標(biāo)峰，采用非晶相全譜擬合定量法，設(shè)置ZnO作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)并輸入相應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在非晶漫散射位置插入非晶峰，如圖4所示. 非晶峰以FP函數(shù)插入，運(yùn)行擬合，經(jīng)全譜擬合計(jì)算后給出擬合情況（如圖4所示），包括加內(nèi)標(biāo)樣品的PXRD圖、參與進(jìn)行全譜擬合的PXRD圖、未參與進(jìn)行全譜擬合的峰，同時(shí)軟件運(yùn)算后給出樣品中CaCO3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)合平均每片的質(zhì)量通過計(jì)算得到每片CaCO3的含量. 計(jì)算公式如下：

圖1 CaCO3和ZnO的PXRD衍射圖譜Fig. 1 PXRD diffraction patterns of CaCO3 and ZnO

圖3 樣品加入ZnO后的PXRD衍射圖譜峰1，5是CaCO3定量峰，峰2～4是ZnO內(nèi)標(biāo)峰Fig. 3 PXRD diffraction pattern of sample after adding ZnO

圖4 TOPAS軟件中進(jìn)行全譜擬合計(jì)算后給出的擬合情況Fig. 4 Fitting situation given after full spectra fitting calculation in TOPAS software

其中：X為每片中CaCO3的含量（以CaCO3計(jì)，mg/片），C為CaCO3儀器給出值的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%），M為平均每片的質(zhì)量（g/片）.

圖2 樣品的PXRD衍射圖譜Fig. 2 PXRD diffraction pattern of sample

2 方法驗(yàn)證

2. 1 準(zhǔn)確度

2. 1. 1 加標(biāo)回收試驗(yàn)

采用加標(biāo)回收試驗(yàn)考察檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度. 精密稱定供試品4 g，CaCO30.8 g，ZnO 0.2 g，置于同一研缽中，充分研磨5 min以上使其混合均勻，制備6個(gè)加標(biāo)回收樣品，經(jīng)圖譜掃描、數(shù)據(jù)處理并計(jì)算回收率，平均回收率為98.9%[相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%]，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度較好.

2. 1. 2 模擬樣試驗(yàn)

模擬樣試驗(yàn)在考察方法準(zhǔn)確度上具有較大優(yōu)勢，可以最大程度降低基底效應(yīng)的影響，更加直觀的反應(yīng)檢驗(yàn)方法的優(yōu)劣. 按消咳寧片處方及制法（由于原料難以獲得，其中鹽酸麻黃堿以等量的淀粉代替），以低中高三水平自制6份模擬樣品進(jìn)行測定，每個(gè)水平自制兩份模擬樣，進(jìn)行測定并計(jì)算（結(jié)果如表1所列），得到平均回收率為96.9%（RSD為1.0%），表明該方法有較好的準(zhǔn)確度.

表1 模擬樣試驗(yàn)Table 1 Experimental results of recovery for simulated samples/%

2. 2 重復(fù)性

取2號(hào)樣品，按照“1 試驗(yàn)部分”項(xiàng)下儀器條件和試驗(yàn)方法，制備6份供試品并進(jìn)行平行測定，得到樣品中CaCO3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算6次平行測定的RSD值（結(jié)果如表2所列），RSD（n=6）結(jié)果為1.2%，表明方法重復(fù)性良好.

表2 重復(fù)性測定Table 2 Experimental results of precision/%

2. 3 專屬性

PXRD測定消咳寧片中CaCO3的含量，儀器掃描的圖譜反映的是供試品中晶型物質(zhì)對(duì)X射線的衍射效應(yīng)，非晶形物質(zhì)對(duì)該方法干擾非常小. 從儀器掃描獲取的PXRD圖譜中可以看出（如圖1～3所示），CaCO3、ZnO及樣品的衍射峰角度及峰強(qiáng)度都很利于進(jìn)行分析測定，衍射峰峰重疊的情況也比較少. 另外，該處方中石膏（主成分為硫酸鈣）為晶型物質(zhì)，存在衍射峰，通過對(duì)石膏、CaCO3、ZnO的PXRD圖譜比較，三種物質(zhì)間不存在互相干擾的情況（如圖5所示）. 由此可以判斷方法專屬性好.

圖5 （a）石膏、（b）CaCO3和（c）ZnO的PXRD衍射圖譜Fig. 5 PXRD diffraction patterns of (a) gypsum, (b) CaCO3and (c) ZnO

3 結(jié)果與討論

3. 1 理論探討

在方法開發(fā)過程中，引入了質(zhì)量吸收系數(shù)這一概念. 質(zhì)量吸收系數(shù)Mass Ab.Coeff（單位為cm2/g）的定義是：單位重量物質(zhì)對(duì)X射線的衰減量，與物質(zhì)密度和物質(zhì)狀態(tài)無關(guān)，與物質(zhì)原子序數(shù)（Z）和衰減常數(shù)（μm）及X射線波長有關(guān)，該特性是本研究的基礎(chǔ)，結(jié)合X射線衍射內(nèi)標(biāo)定量分析法，本研究的理論基礎(chǔ)及數(shù)學(xué)模型推導(dǎo)如下：

式中：A內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量吸收系數(shù)，A測為待測物質(zhì)的質(zhì)量吸收系數(shù)，m為樣品與內(nèi)標(biāo)物混合后壓片所得的待掃描片的質(zhì)量，ω內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在待掃描片中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ω測為待測物質(zhì)在待掃描片中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，S為其它影響結(jié)果的參數(shù)，X內(nèi)為X射線圖譜中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰強(qiáng)度，X測為X射線圖譜中待測物質(zhì)的峰強(qiáng)度. 式1除以式2，修約后可得：

式（5）中，A內(nèi)與A測是物態(tài)常數(shù)，ω內(nèi)是已知值，X內(nèi)與X測可以通過儀器測得，所以根據(jù)式（6）即可計(jì)算得出ω測值，進(jìn)而可以計(jì)算樣品中待測物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（x是樣品中待測物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：

3. 2 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)選擇的過程

采用全譜擬合內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，在確定內(nèi)標(biāo)物質(zhì)時(shí)，需要對(duì)被測物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量吸收系數(shù)進(jìn)行比較，兩者相差不得超過3倍，數(shù)值越接近，定量結(jié)果越穩(wěn)定. 如果兩者相差過大，會(huì)造成XRD圖譜吸收峰高度不成比例，無法進(jìn)行定量. 同時(shí)內(nèi)標(biāo)物應(yīng)滿足結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易吸潮、晶型固定等條件.經(jīng)過對(duì)KNO3、K2SO4、PbNO3、CaO、MgSO4、ZnO、CaCl2等多個(gè)物質(zhì)的分析，考慮衍射峰重疊情況、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)穩(wěn)定情況等因素，最后選定ZnO作為內(nèi)標(biāo)物. 兩者的質(zhì)量吸收系數(shù)分別為：CaCO373.95 cm2/g、ZnO 48.66 cm2/g（質(zhì)量吸收系數(shù)數(shù)據(jù)來源：TOPAS軟件給出）.

3. 3 實(shí)際樣品測定結(jié)果

PXRD測定CaCO3含量的結(jié)果如表3所列. 從處方投料量計(jì)算得出CaCO3含量理論值為20 mg/片，測定結(jié)果也在該數(shù)據(jù)附近，說明產(chǎn)品中CaCO3投料量符合要求.

表3 PXRD測定6批樣品數(shù)據(jù)Table 3 Determination results of 6 batches of sample by PXRD

4 結(jié)論

通過方法學(xué)考察可以看出，方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、專屬性都較好，說明該方法適合于消咳寧片中CaCO3的含量測定，測定結(jié)果比較準(zhǔn)確可靠.XRD方便快捷、速度快、干擾少，本研究確定的這種成熟、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的PXRD對(duì)消咳寧片中CaCO3進(jìn)行定量測定，彌補(bǔ)了無法對(duì)CaCO3進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)，為其質(zhì)量控制提供了科學(xué)的技術(shù)手段.