超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定化妝品中50種非法添加藥物

廖文榕，黃健浩

（福州市食品藥品檢驗(yàn)所，福建 福州 350007）

近年來，化妝品中非法添加禁用化學(xué)藥物的現(xiàn)象越發(fā)引起國家市場監(jiān)督管理部門的重視. 廣東省藥品檢驗(yàn)所[1]對2010至2020年期間1 180批次不合格的化妝品進(jìn)行分析，含非法添加抗感染藥物及抗組胺藥物的不合格化妝品分別為515批次及46批次，占總不合格項(xiàng)目比率的36.04%及3.22%. 按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[2]（以下簡稱《規(guī)范》）中的標(biāo)準(zhǔn)方法，檢出16種抗感染及抗組胺藥物. 此外，按照非標(biāo)準(zhǔn)方法檢出夫西地酸和甲氧芐啶2種抗生素藥物. 化妝品中非法添加的禁用藥物具有不確定性，不同生產(chǎn)企業(yè)可能添加不同的禁用藥物. 目前化妝品標(biāo)準(zhǔn)方法所檢測的組分無法充分涵蓋市場上易添加的抗感染藥物組分，且檢測方法多樣，操作繁瑣，檢測多組分的成本高昂.

紅霉素、莫匹羅星、夫西地酸、多粘菌素B、特比萘芬、甲氧芐啶、伊曲康唑等抗生素藥物常作為通用外用軟膏劑或口服制劑協(xié)同用于皮膚的抗感染治療. 西咪替丁和雷尼替丁等抗組胺藥物（H2受體拮抗藥物）具有抗雄性激素、抑制皮脂分泌的特性，可與抗菌藥物聯(lián)合用藥治療痤瘡等皮膚病[3]. 這些藥物屬于處方藥，不法廠商可能在宣稱具有“祛痘”功效的化妝品中違禁添加這些常見的化學(xué)藥物，甚至在兒童化妝品中也檢出用于抗感染治療的化學(xué)藥物. 而在《規(guī)范》[2]以及國家藥品監(jiān)督管理局2019年第66號通告附件2中發(fā)布的關(guān)于《化妝品中抗感染類藥物的檢測方法》[4]中尚未見到化妝品中上述成分的檢測方法.

液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）是快速發(fā)展的一種分析技術(shù)，具有檢出限低、選擇性高、靈敏度高等特點(diǎn)，尤其在組分分離、結(jié)構(gòu)鑒定、定性篩查、定量分析中具有優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于化妝品中化學(xué)藥物非法添加篩查領(lǐng)域[5-6]. 近年來，文獻(xiàn)所報道的多粘菌素B（多粘菌素B1及多粘菌素B2）[7-9]、夫西地酸[10]、甲氧芐啶[10]、莫匹羅星[11-12]、特比萘芬[13-16]、西咪替丁[3,17]、雷尼替丁[3,17]、紅霉素[18-22]、伊曲康唑[23-24]等抗生素及抗組胺藥物大都采用HPLC-MS/MS法進(jìn)行單組分測定或少數(shù)幾種組分同時測定的方法學(xué)研究. 但對化妝品中上述10種組分及甲硝唑等40種組分（化合物名稱如表1所列）同時檢測的方法未見報道.

本研究在標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)包含的36種組分基礎(chǔ)之上，拓展考察《規(guī)范》[2]“2.1 氟康唑等9種組分”中包含的萘替芬、益康唑、咪康唑、環(huán)吡酮胺，以及常用的皮膚病治療藥物：紅霉素、莫匹羅星、夫西地酸、多粘菌素B（多粘菌素B1及多粘菌素B2）、甲氧芐啶、特比萘芬、伊曲康唑、西咪替丁和雷尼替丁等14種組分，共計50種禁用化學(xué)藥物（含48種抗感染藥物和2種抗組胺藥物，化合物名稱如表1所列）同時測定的方法學(xué)研究.

本研究通過考察常見基質(zhì)（如：液態(tài)水基、乳液和膏霜）化妝品，探索上述50種非法添加化學(xué)藥物的UPLC-MS/MS定性篩查及定量分析方法. 氟康唑、西咪替丁等50種化學(xué)藥物采用同一種液相條件進(jìn)行分離. 同時，簡化環(huán)吡酮胺的前處理方式，優(yōu)化多肽類大分子（分子量超過1 000）硫酸多粘菌素B（多粘菌素B1及多粘菌素B2）的質(zhì)譜條件，考察不同基質(zhì)對結(jié)果數(shù)據(jù)的影響. 本方法在對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行整合的基礎(chǔ)上，增加了10種常用于皮膚抗感染治療的化學(xué)藥物，為化妝品中禁用物質(zhì)的監(jiān)督管理提供更為全面、快速的篩查方法，也為化妝品標(biāo)準(zhǔn)方法的改進(jìn)提供技術(shù)參考.

1 試驗(yàn)部分

1. 1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀 1 290 UPLC（Agilent公司）串聯(lián)AB SCIEX QTRAP 5 500三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司）；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)（Fisher Scientific公司）；XS105DU雙量程精密電子天平（梅特勒-托利多公司）；VortexGenius3漩渦混合器（德國IKA公司）；XM-1000UVF超聲波清洗器（小美超聲儀器公司）；Milli-Q-Reference超純水機(jī)（默克密理博公司）；甲醇、乙腈和四氫呋喃（HPLC級，德國Merck公司），甲酸（HPLC級，阿拉丁公司），氯化鈉及乙二胺四乙酸二鈉（均為GR級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）.

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：硫酸多粘菌素B（多粘菌素B1及多粘菌素B2的混合物）（德國Dr. Ehrenstofer公司），紅霉素（Bepure，北京曼哈格生物科技有限公司），伊曲康唑、莫匹羅星（中國食品藥品檢定研究院），其余標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（FirstStandard?，美國A Chemtek公司），純度均大于91%.

30批化妝品均為市售品.

1. 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1. 2. 1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

準(zhǔn)確稱取各待測組分標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg（精確至0.01 mg），置于10 mL棕色容量瓶中，使用甲醇（其中伊曲康唑加入2 mL四氫呋喃助溶）配制成質(zhì)量濃度約1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（?18 ℃保存）. 準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，使用甲醇配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1. 2. 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

使用乙腈（0.5%甲酸）-2 mg/L乙二胺四乙酸二鈉水溶液（EDTA-2Na），體積比為1∶1，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.

1. 2. 3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別稱取6份化妝品基質(zhì)空白樣品0.2 g（精確到0.000 1 g），加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1. 3項(xiàng)下樣品的制備同法進(jìn)行處理，配制成質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.

1. 3 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取化妝品樣品0.2 g（精確到0.000 1 g），置于15 mL離心管中，加3 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋分散均勻，加5 mL乙腈（含0.5%甲酸），渦旋30 s，超聲提取30 min，渦旋混合30 s，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速0 ℃冷凍離心5 min，吸取上清液，加EDTA-2Na水溶液（2 mg/L）定容至10 mL容量瓶，混勻后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液為待測試樣.

1. 4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；離子噴霧電壓（IS）：5 500~4 500 V；離子源溫度（TEMP）：500 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描，氣簾氣（CUR）：0.24 MPa，碰撞氣（CAD）：0.24 MPa，霧化氣（GS1）：0.34 MPa，輔助氣（GS2）：0.34 MPa. 去簇電壓（DP）及碰撞電壓（CE）等質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定如表1所列.

表1 50種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 50 compounds

續(xù)表 1

續(xù)表 1

1. 5 色譜條件

CAPCELL CORE C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流動相A：甲醇，流動相B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL，流速：0.3 mL/min. 梯度洗脫程序如表2所列.

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure of mobile phases

2 結(jié)果與討論

2. 1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)50種化合物的電離性質(zhì)，分別在ESI+及ESI-離子化模式下，以注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式，尋找目標(biāo)化合物的母離子信號，確定定量子離子及定性子離子信息，同時優(yōu)化DP、CE等質(zhì)譜參數(shù). 氯霉素和夫西地酸在負(fù)離子模式下響應(yīng)值最大，準(zhǔn)分子離子為[M-H]–. 硫酸多粘菌素B是常用的多肽類陽離子型表面活性劑抗生素，分子量超過1 000的為多粘菌素B1和多粘菌素B2的混合物. 帶有多電荷，在正離子模式下容易質(zhì)子化，碎裂后得到的可能是帶有兩個電荷、三個電荷或者更多電荷的離子. 最終選擇響應(yīng)值大的[M+2H]2+峰（m/z602.7）和[M+3H]3+峰（m/z402.1）作為多粘菌素B1的母離子，以及[M+2H]2+峰（m/z595.7）和[M+3H]3+峰（m/z397.5）作為多粘菌素B2的母離子，并確定相應(yīng)的子離子. 其余46種化合物均在正離子模式下響應(yīng)值最大，準(zhǔn)分子離子為[M+H]+. 質(zhì)譜參數(shù)信息如表1所列.

2. 2 色譜柱及流動相的選擇

影響液相色譜分離的3個主要因素為化合物屬性、色譜柱及流動相. 待分析化合物確定后，考察適合的色譜柱及流動相分離條件.

試驗(yàn)考察了色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）及CAPCELL CORE C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）對50種化合物的分離效果. 結(jié)果表明：目標(biāo)化合物在CAPCELL CORE色譜柱上的峰型更尖銳、對稱，響應(yīng)值更強(qiáng)，故選擇核殼色譜柱CAPCELL CORE C18進(jìn)行分離檢測（50種化合物的總離子流譜圖如圖1所示）.

圖1 50種化合物的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatogram for 50 compounds

參考標(biāo)準(zhǔn)[4]中的流動相組成：乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液（甲酸調(diào)至pH值為4.0），多粘菌素B未見色譜峰出現(xiàn). 同時考察了不同流動相的組成：乙腈-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水（含0.1%三氟乙酸）、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%三氟乙酸）和甲醇-水（含0.1%甲酸）的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)值.由于多粘菌素B含有多個氨基和羧基，易和C18柱中的硅醇基發(fā)生相互作用，導(dǎo)致拖尾. 甲酸可以使色譜柱中的硅醇基質(zhì)子化，減弱其和多粘菌素B之間的相互作用. 同時在正離子檢測模式下，甲醇對酸堿性強(qiáng)或電負(fù)性強(qiáng)的化合物具有更高的選擇性.試驗(yàn)最終采用甲醇-水（含0.1%甲酸）為流動相，并對梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，大大提高了多粘菌素B的響應(yīng)值，且所有正離子及負(fù)離子待測化合物均能獲得良好的色譜峰型和質(zhì)譜響應(yīng).

2. 3 前處理方法的選擇

由于環(huán)吡酮胺中的N-OH基團(tuán)會與分析系統(tǒng)中存在的微量金屬離子發(fā)生強(qiáng)螯合作用[25]，導(dǎo)致色譜峰產(chǎn)生嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性.如《規(guī)范》[2]2. 1中采用硫酸二甲酯進(jìn)行衍生化處理的方式測定環(huán)吡酮胺. 有文獻(xiàn)報道[25]采用強(qiáng)螯合劑EDTA-2K參與競爭，可以阻止環(huán)吡酮胺與金屬離子產(chǎn)生螯合，改變色譜峰拖尾現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)直接測定. 本研究選擇實(shí)驗(yàn)室常見的EDTA-2Na試劑作為金屬離子螯合劑，試驗(yàn)結(jié)果表明，采用5 mL乙腈（含0.5%甲酸）提取樣品中的待測組分，再用5 mL EDTA-2Na溶液（2 mg/L）稀釋定容進(jìn)行前處理的方法，適用于環(huán)吡酮胺及其余49組分的測定.

2. 4 基質(zhì)效應(yīng)考察

化妝品基質(zhì)復(fù)雜，樣品中的共提取物（例如：胺類、鹽類、硬脂酸以及甘油酸酯等）與待測化合物同時從噴霧針流出，將影響目標(biāo)化合物的霧化、揮發(fā)、裂分、化學(xué)反應(yīng)及帶電過程，導(dǎo)致發(fā)生離子增強(qiáng)或離子抑制的效應(yīng)，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性. 本研究選取水基、乳液和膏霜三種類型的基質(zhì)對基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）進(jìn)行考察. 分別制備溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線測定比較法考察基質(zhì)效應(yīng). 根據(jù)式（1）[2]計算：

式中：Bs表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，As表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率. 計算結(jié)果正值為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，負(fù)值為抑制效應(yīng). 試驗(yàn)表明，化妝品基質(zhì)對大多數(shù)待分析化合物的測定結(jié)果有不同程度的抑制或增強(qiáng)作用（如表3所列）. 因此，本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法進(jìn)行定量分析，以降低或消除基質(zhì)效應(yīng)對定量分析結(jié)果的影響.

2. 5 方法學(xué)考察

2. 5. 1 線性范圍和檢出限

分別配制溶劑和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，以50種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度、定量離子峰面積擬合線性回歸方程，結(jié)果表明所有組分在10～100 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.991 0.取液態(tài)水基化妝品基質(zhì)空白溶液，添加適量低濃度水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行前處理，在信噪比（S/N）分別為3和10時計算方法的檢出限和定量限，結(jié)果如表3所列. 由表3可見，稱樣量為0.2 g時，方法檢出限為0.05～33 ng/g，定量限為0.15～99 ng/g. 其中40種組分與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)相比，檢出限與定量限更高，具有更高的靈敏度.

2. 5. 2 加標(biāo)回收率及重復(fù)性

分別在液態(tài)水基、乳液及膏霜基質(zhì)空白樣品（不含50種組分）中，按50、100、200 ng/g 3個濃度水平加入50種禁用藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平制備3個平行樣，進(jìn)行加標(biāo)回收率考察，結(jié)果如表4所列. 由表4可見，各組分的平均回收率范圍為87.2%~109.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不超過10%. 取液態(tài)水基空基質(zhì)白樣品6份，添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為50 ng/g的加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，進(jìn)行重復(fù)性考察，RSD值均小于5%，表明重復(fù)性良好，結(jié)果詳見表4.

表4 50種化合物的回收率結(jié)果Table 4 Recoveries of 50 compounds(%, n=3)

續(xù)表 4(%, n=3)

2. 6 樣品的測定

應(yīng)用本文建立的方法對市售30批不同基質(zhì)的化妝品包括洗面奶（祛痘化妝品）、化妝水、乳液（含兒童、祛痘化妝品）、膏霜（含兒童、祛痘化妝品）及面膜等進(jìn)行測定，均未檢出方法中的50種禁用藥物.

3 結(jié)論

本文建立UPLC-MS/MS法同時對化妝品中50種非法添加化學(xué)藥物進(jìn)行測定. 各組分的線性范圍、選擇性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性等指標(biāo)均滿足方法學(xué)的要求. 對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[4]及《規(guī)范》[2]2.1測定方法進(jìn)行整合完善，優(yōu)化了樣品的制備方法以及流動相分離體系，將現(xiàn)行兩個標(biāo)準(zhǔn)所含的40個組分用同一方法進(jìn)行檢測，并拓展性增加了10種常用化學(xué)藥物的檢測，擴(kuò)大了化妝品中現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中禁用組分的篩查范圍. 本方法操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高，

可應(yīng)用于化妝品中禁用藥物的定性篩查和定量分析，為化妝品質(zhì)量市場監(jiān)管提供有效的技術(shù)參考.

續(xù)表 3