金銀花綠原酸提取方法研究

李 輝 ，逯桃桃 ，陳 佳 ，趙 亮 ，邱洪燈

（1. 中國(guó)科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2. 蘭州城市學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

金銀花（別名：子風(fēng)藤），忍冬科忍冬屬多年生半常綠纏繞灌木，味甘、性寒，廣泛分布于山東、陜西、河南、湖北及江西等地，具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱之功效[1]. 研究發(fā)現(xiàn)金銀花的活性成分主要為有機(jī)酸、黃酮、三萜及揮發(fā)油等[2-4]，其中綠原酸、木犀草苷生物活性顯著[5]，對(duì)金黃葡萄球菌及上呼吸道感染致病病毒等有較強(qiáng)的抑制力[6-7]. 因此，為了開發(fā)利用金銀花，其有機(jī)酸類活性成分的分離純化一直是金銀花高值化利用的重要依據(jù)[8].

綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸[9-10]，含有一定量R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氫自由基，以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性，從而保護(hù)組織免受氧化作用的損害，同時(shí)有消炎、降血脂及增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等多藥理作用[11-12]，且綠原酸在醫(yī)藥保健、日用化工及食品等行業(yè)應(yīng)用廣泛[13-14]. 目前綠原酸提取方法眾多，與其他方法相比，熱回流法因提取高效、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低且提取率高于煎煮法等優(yōu)勢(shì)而廣泛應(yīng)用[15-16].鑒于此，本文優(yōu)化了熱回流法提取金銀花綠原酸，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度及提取時(shí)間等對(duì)提取率的影響，采用正交試驗(yàn)分析最優(yōu)提取參數(shù).

1 試驗(yàn)部分

1. 1 儀器與試劑

液相色譜儀為Waters 2487（雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器+waters1525泵），N-3000色譜工作站（浙江大學(xué)），DF-101S攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），MH-5000調(diào)溫電熱套（西安常儀儀器設(shè)備有限公司），R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），TG16-WS型高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），F(xiàn)A1004電子秤（上海良平儀器儀表有限公司）.

金銀花為市售，甲醇（邁瑞達(dá)，色譜純），磷酸（科密歐，≥85.0%），綠原酸（麥克林，純度99.6%），無(wú)水乙醇（天津大茂，99.7%），去離子水（摩爾1010a 30L/H型）.

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 液相色譜條件

色譜柱：Hibar ? C18 （250 mm×4.6 mm, 5 μm），流動(dòng)相條件為0.4%磷酸溶液∶乙腈（體積比為87∶13），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，進(jìn)樣體積10 mL，柱溫為25 ℃.

1. 2. 2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

準(zhǔn)確稱取0.10 g綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用80%乙醇溶液溶解后移至100 mL容量瓶中搖勻、定容，制得1.0 mg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液. 吸取不同體積標(biāo)準(zhǔn)溶液配制一定濃度綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液，采用“1. 2. 1”條件測(cè)定吸光度峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1. 2. 3 提取率計(jì)算公式

綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2005版第一部），“金銀花”項(xiàng)下綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm. 因此在327 nm測(cè)定綠原酸吸光度，以吸光度作縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.其中金銀花中綠原酸提取率公式為：

式中，a為金銀花綠原酸提取率，C為綠原酸提取液稀釋后濃度，V為提取液的體積（mL），n為稀釋倍數(shù)，M為金銀花質(zhì)量（g）[17-20].

1. 2. 4 提取條件

本方法采用熱回流法提取，提取流程為：金銀花→干燥→粉碎處理→過(guò)178 μm篩→熱回流法提取→過(guò)濾→8 000 r/min離心5 min→綠原酸提液合并定容→稀釋→測(cè)定. 依照此步驟對(duì)金銀花中綠原酸進(jìn)行熱回流提取，并對(duì)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和金銀花提取液進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定（如圖1所示）.

圖1 （a）綠原酸和（b）金銀花提取液HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of (a) chlorogenic acid and (b) honeysuckle extract

1. 2. 5 單因素試驗(yàn)

采用熱回流法提取金銀花綠原酸，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（0、20%、40%、60%、80%、100%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL）、提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、提取溫度（25、40、60、80、100 ℃）等因素對(duì)綠原酸提取率的影響.

1. 2. 6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以金銀花綠原酸的提取率為檢測(cè)指標(biāo)，正交試驗(yàn)因素與水平如表1所列.

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

2 結(jié)果與討論

2. 1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0~9.0 mL轉(zhuǎn)移至10.0 mL容量瓶中搖勻、定容，配制0.1~1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用待測(cè). 分別吸取上述不同濃度對(duì)照品溶液10 μL測(cè)樣，以吸光度值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo). 試驗(yàn)結(jié)果表明：綠原酸吸光度值與質(zhì)量濃度滿足Y=1.83×107C+495 058，r為0.999，R2為0.998，說(shuō)明在0.1~1.0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（如圖2所示）.

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of chlorogenic acid

2. 2 單因素考察

2. 2. 1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率影響

設(shè)定提取溫度100 ℃，提取時(shí)間2 h，料液比1∶20，考察純水和乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、40%、60%、80%和100%時(shí)對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響（如圖3所示）. 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～80%范圍內(nèi)，綠原酸提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增大.當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，綠原酸的提取率最高，進(jìn)一步增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率反而降低，可能是金銀花中的一些脂溶性成分溶出，導(dǎo)致提取率下降. 故選乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、80%、100%進(jìn)行正交試驗(yàn).

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率影響Fig. 3 Effect of ethanol volume fraction on extraction yield

2. 2. 2 提取溫度對(duì)綠原酸提取率影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間2 h，料液比1∶20，考察提取溫度25、40、60、80、100 ℃對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響（如圖4所示）. 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在25～100 ℃范圍內(nèi)，綠原酸提取率隨溫度升高而增大，可能因溫度升高，細(xì)胞壁破裂加快，綠原酸溶解或擴(kuò)散到溶劑中的速度加快，提取率增大. 當(dāng)溫度升高至100 ℃時(shí)，綠原酸的提取率最高，故選60、80、100 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn).

圖4 提取溫度對(duì)提取率影響Fig. 4 Effect of extraction temperature on extraction yield

2. 2. 3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度100 ℃，料液比1∶20，考察提取時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響（如圖5所示）. 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在0.5~1.5 h提取時(shí)間內(nèi)，綠原酸提取率隨時(shí)間增加而增大，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，提取率達(dá)到最大，進(jìn)一步增加時(shí)間提取率反而下降，可能長(zhǎng)時(shí)間使得細(xì)胞壁中雜質(zhì)溶出而提取率降低，故選擇1.5、2.0、2.5 h進(jìn)行正交試驗(yàn).

圖5 提取時(shí)間對(duì)提取率影響Fig. 5 Effect of extraction time on extraction yield

2. 2. 4 料液比對(duì)綠原酸提取率影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度100 ℃，提取時(shí)間2 h，考察料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響（如圖6所示）.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綠原酸提取率隨料液比增加而增大. 當(dāng)料液比1∶20時(shí)提取率達(dá)到最大，進(jìn)一步增加料液比提取率反而下降，可能由于糖類物質(zhì)溶出而下降，故選擇1∶5、1∶20及1∶25進(jìn)行正交試驗(yàn).

圖6 料液比對(duì)提取率影響Fig. 6 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield

2. 3 正交試驗(yàn)

在上述單因素考察基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以綠原酸提取率為檢測(cè)指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所列. 由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，金銀花中綠原酸最佳提取條件為A2B3C2D2，其中ki為i水平數(shù)據(jù)的綜合平均，R為極差. 由極差分析可知，4種因素對(duì)提取率影響強(qiáng)度依次為提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間. 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度100℃、提取溶劑pH為6，提取時(shí)間2 h，料液比為1∶20.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

3 結(jié)論

本文提供的熱回流法提取具有操作方法簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、效率高等優(yōu)勢(shì)，可為富含綠原酸的植物高值化利用提供有效手段. 本研究以乙醇-水溶液為提取試劑考察綠原酸最佳提取條件，結(jié)合單因素考察和正交試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化金銀花綠原酸提取最佳條件，并確定其提取參數(shù)，提高了綠原酸的收率，可為規(guī)?；a(chǎn)及綜合利用提供理論依據(jù).