毛細管電泳在生物大分子分析中的應用研究進展

彭 樂 ，程佳偉 ，李淑楠 ，李文龍

（1. 天津中醫(yī)藥大學 中藥制藥工程學院，天津 300193；2. 省部共建組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

毛細管電泳（capillary electrophoresis, CE）技術于20世紀60年代首次提出[1]，自20世紀80年代至今發(fā)展快速. 與其他色譜技術相比，CE具有分析速度快、分離模式多、樣品和試劑消耗少等優(yōu)點[2-3]，是一種污染后易清洗的環(huán)境友好型綠色分析技術[4-5]. 如今，CE已廣泛應用于分析化學、生物化學、藥物化學、食品科學等眾多領域，在復雜樣品的分析檢測過程中發(fā)揮了重大作用，具有廣闊的應用前景[6-7]. 自人類基因組計劃以來，CE便廣泛應用于脫氧核糖核酸（DNA）、蛋白質、多肽等生物大分子的分析. 常用于生物大分子分析的毛細管電泳技術包括毛細管區(qū)帶電泳、膠束電動毛細管電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等電聚焦電泳、親和毛細管電泳以及微流控芯片毛細管電泳等，其基本原理和應用特點如表1所列. 本文就CE在多糖、蛋白質、核酸等生物大分子的分離、結構鑒別、定量方法等方面的研究進行了綜述（如圖1所示）.

圖1 毛細管電泳技術分析生物大分子的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of analysis of biomacromolecules by capillary electrophoresis

表1 常用于分析生物大分子的毛細管電泳技術的原理及應用特點[8-9]Table 1 Principles and application characteristics of capillary electrophoresis often used to analyze biological macromolecules [8-9]

近年來，很多相關科研工作者越來越多的關注CE在多糖、蛋白質、核酸等生物大分子分析上的應用. 但在樣品制備、毛細管內壁吸附、儀器的研制等方面仍存在著一些亟待解決的問題. 本文首先對在分析生物大分子中應用最多的毛細管電泳分離模式的技術原理進行簡單介紹，然后對其在生物大分子分析領域的應用報道進行了綜述，最后對這類技術的應用前景及其存在的問題進行了總結和展望，以期為相關的研究提供參考，從而推動這類技術在生物大分子分析領域更大范圍的推廣應用.

1 應用對象

1. 1 多糖

多糖是由10個以上單糖分子通過縮合反應形成的具有復雜空間結構的大分子化合物，是動植物體內最主要的能量來源. 過去人們常將多糖視為非活性成分，近年來隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)了上百種多糖具有藥效活性，如抗凝、增強免疫力、抗腫瘤等作用，其中香菇多糖、肝素、人參多糖等已被制成相關藥物投入臨床[10-11]. CE技術主要應用于檢測多糖的單糖組成及摩爾比、糖苷鍵鑒定以及糖類含量測定等方面[12].

Bai等[13]開發(fā)了一種快速且高效的膠束動力毛細管色譜（MECC）結合二極管陣列檢測器方法，用于確定竹蓀多糖樣品的單糖組成. 該法在原有文獻的基礎上測得竹蓀多糖樣品由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，易于操作、分析時間短、靈敏度高. 林曉燕等[14]采用水提醇沉法從太子參中提取得到粗多糖，經(jīng)分離純化后采用CE測定其單糖組成及比例. 谷楓等[15]選取巴戟天粗多糖，酸水解后進行1-苯基-2-甲基-4-吡唑啉酮（PMP）衍生化，隨后采用CE分析測定其單糖組成. Snyder等[16]使用CE-MS分離并鑒別了77種血清中的N-聚糖，其中31個N-聚糖結構在先前的研究中未被發(fā)現(xiàn). 此外，采用了芯片電泳和毛細管電泳技術結合選擇性電荷中和法，此法通過甲基酰胺化中和唾液酸對N-聚糖的電荷，但嗎啉鹽酸鹽（DMT-MM）在氯化銨條件下選擇性酰胺化α-2, 6鍵，未處理條件下形成α-2, 3鍵，對α-2, 3和α-2, 6鍵異構體進行分離. 此法可鑒別不同糖苷鍵化合物，并可以通過質譜進一步確定其結構. 譚惠文等[17]采用水提醇沉的方法從德國洋甘菊和羅馬洋甘菊中得到多糖，再經(jīng)三氟乙酸（TFA）水解，PMP衍生化，最后使用CE對兩種洋甘菊多糖中單糖組分的摩爾比進行測定，結果表明德國洋甘菊和羅馬洋甘菊的多糖組成分別為半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖. 周艷[18]采用CE測定猴頭菌及其多糖水解物中單糖組成及比例. 優(yōu)化分離條件：電動進樣10 s，以35 mmol/L硼砂緩沖液為電泳介質，分離電壓為20 kV. 測得猴頭菌多糖水解液中含有3種單糖，包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖. 該方法快速準確、重現(xiàn)性較好，可用于中藥糖類組分的分析檢測.

1. 2 蛋白質

蛋白質在生物體中執(zhí)行著大量的生物學功能，蛋白質的結構和功能通常都是通過其酶產(chǎn)生的肽片段來識別的[19]. 在蛋白質組學研究中，常使用一種自下而上的方法，即通過消化成肽間接鑒定蛋白質[20-21]. CE技術是蛋白質組學的主要分析技術之一，廣泛應用于多肽的檢測，蛋白質的分離、定量、結構分析及活性檢測等方面.

王洋洋等[22]在建立并優(yōu)化雙水相法分離純化鱖魚蛋白的基礎上，采用高效毛細管膠束電動色譜（MECC）耦合二極管陣列檢測器（DAD）檢測鱖魚肌動蛋白的含量，背景電解質為四硼酸鈉-十二烷基硫酸鈉（SDS）緩沖溶液. 結果顯示肌動蛋白在10 min左右時出峰，譜圖基線平穩(wěn)無雜峰，重復性良好，為海洋藥物蛋白的定量檢測提供參考. 李振慶等[23]采用脈沖電場毛細管電泳（PFCE）對溶菌酶、生長激素、碳酸酐酶、肌動蛋白、牛血清白蛋白和磷酸化酶B進行測定. 結果表明，相比于直流電場毛細管電泳（DCCE），相同蛋白質分子的分離時間更短，分離度更高. Zhang等[24]報道了一種基于遷移率毛細管電泳（MCE）快速分析蛋白質立體結構和有效電荷的方法. 通過對5種蛋白質在接近自然環(huán)境下的電荷態(tài)和結構的分析，以及不同pH條件下牛血清白蛋白和溶菌酶的構象轉變和電荷態(tài)變化的研究，證明了該法的可行性. He等[25]利用毛細管電泳-質譜（MCE-MS）技術完成了溶菌酶的三維結構分析，并對MCE-MS技術分析復雜基質中微量的生物分子進行了研究，證明了該法是一種功能強大的生物分子結構分析技術. Deyanova等[26]開發(fā)了一種快速而強大的微流控芯片毛細管電泳-質譜（CEMCMS）方法，用于識別具有復雜的唾液化N和O鏈糖型的治療性融合蛋白的完整糖基化指紋. 該方法能有效地分離多種唾液化糖型，并能在6 min內快速檢測糖基化譜的變化. 李悅[27]將毛細管電泳和固定化酶技術結合用于組蛋白去乙?；福℉DACs）抑制劑的在線活性篩選. 在優(yōu)化分離條件后，結果顯示測得的酶促反應動力學與抑制劑動力學結果與文獻報道一致. 此法穩(wěn)定性高、重復性好、操作簡單高效、消耗物料量小且具有較高的自動性，有望成為組蛋白去乙?；敢种苿┭邪l(fā)的重要手段.

1. 3 核酸

核酸是生物遺傳信息載體，包括DNA與RNA，是由多個核苷酸單體聚合而成的長鏈，經(jīng)盤曲折疊形成多級結構. 核酸適配體是RNA或短的單鏈DNA（ssDNA）分子，可與某些目標物如金屬離子、蛋白質等特異性結合. 適配體具有體積小、重復性高、維持可逆變性能力強、容易和可控的修飾以及缺乏免疫原性等優(yōu)點，作為抗體替代品具有巨大的潛力[28]. 目前CE是分析核酸的重要工具，主要在核酸適配體的表征、核酸的分離檢測及核苷酸的測定等方面得到了廣泛應用.

蔡先洪等[29]采用毛細管電泳法-指數(shù)富集配體系統(tǒng)（CE-SELEX）對維吉霉素M1適配體進行篩選分析，并測定了其中親和力最大以及特異性最強的適配體的平衡常數(shù)（Kd）. Wang等[30]利用熒光耦合毛細管電泳法研究了凝血酶與其G-四鏈適配體的動態(tài)結合狀態(tài)及其相互作用對的穩(wěn)定性. Yu等[31]首次建立了毛細管電泳串聯(lián)質譜法同時測定8種RNA修飾核苷酸的方法，并進一步研究了Ni2+對RNA表觀遺傳學的影響. Lu等[32]建立了高分辨CGE分離大分子RNA的方法. 該方法使用了非水凝膠，相較于標準的水性凝膠，對大分子RNA的分辨率提高了6倍. Demelenne等[33]采用親水液相色譜（HILIC）和毛細管區(qū)帶電泳-紫外（CZE-UV）法分析脫氧（胸腺）核酸（dT）和經(jīng)修飾的硫代寡核苷酸（PS），比較了HILIC法和CZE法在選擇性、分離度、重復性等方面的差異，并將HILIC和CZE與漂移管離子遷移四極飛行時間質譜儀（DTIMSQTOF）耦合，檢測PS中核苷酸的數(shù)量. Wei等[34]開發(fā)了一種基于分離輔助雙循環(huán)信號擴增策略的超靈敏CEMC方法，用于檢測細胞裂解液中的microRNA（miRNA）. 該方法以最高靈敏度對微量miRNA進行了檢測，在生物醫(yī)學研究和臨床診斷中具有巨大的潛力. 張麗霞等[35]采用CGE結合熒光檢測器的方法來分離質粒DNA，該方法能很好地將質粒DNA超螺旋、線性及開環(huán)三種構象分開，是一種靈敏度高，可重復性好的分析方法.

1. 4 脂質

脂質也是能量的儲存形式，是細胞膜的重要結構成分，可以分為簡單脂質、復合脂質以及衍生脂質，而CE主要在衍生脂質中的應用較多.

胡月芳[36]建立了毛細管電泳-電化學檢測（CEED）方法，對淮山中3種植物甾醇（麥角甾醇、膽甾醇、β-谷甾醇）進行了含量測定. 結果表明，在優(yōu)化條件下，3種植物甾醇在10 min內實現(xiàn)了基線分離.該方法是測定淮山中植物甾醇類成分的一種簡單可靠、準確、有效的方法. Zhou等[37]報道了一種基于柱上酶促法和激光誘導熒光檢測的毛細管電泳方法，用于測定血漿中的總膽固醇含量. 在這個方法中，毛細管不僅作為分離介質，而且還可以作為反應室，以減少樣品數(shù)量和試劑消耗. 同時整個過程都可以實現(xiàn)自動化，從而使可能出現(xiàn)的誤差最小化，并節(jié)省了試驗時間. 最終試驗結果表明，所建立的方法足以定量血漿中的總膽固醇. Du等[38]利用毛細管電泳結合二極管陣列檢測器對人類尿液中的睪酮/表皮睪酮濃度比進行了測定，最佳分離條件：壓力進樣10 s，以15 mmol/L 醋酸-醋酸鈉溶液為電泳介質，分離電壓為20 kV. 方法考察表明，所建立的方法能夠簡單、靈敏、經(jīng)濟、準確地測定人尿液中睪酮與表皮睪酮的比例. Geda等[39]采用毛細管電泳紫外吸收檢測方法對大鼠大腦和小腦中的5種神經(jīng)節(jié)苷脂進行了測定. 通過方法學考察，該方法的適用性得到了證明，可用于研究神經(jīng)節(jié)苷脂組成在各種病理條件下的變化以及對不同藥物治療的反應. Barakat等[40]建立了一種采用環(huán)糊精修飾的CZE方法研究脂質寡核苷酸（LONs）的組成，同時采用ACE來確定LONs的結合常數(shù). 該方法成功研究了LONs的組成. 表2總結了近年來毛細管電泳技術在一些生物大分子中的應用實例.

表2 毛細管電泳技術在生物大分子分析中的應用Table 2 Application of capillary electrophoresis in analysis of biological macromolecules

2 總結與展望

雖然利用CE技術分析生物大分子的應用很多，但在分析的過程中仍會遇到一些難題. 例如，多數(shù)多糖類化合物是電中性的，沒有紫外或熒光發(fā)射基團，且分子量巨大也不易用質譜檢測，所以一般要對其進行預處理，如衍生化，使其變成帶有電荷且具有一定紫外吸收或熒光發(fā)色基團的物質. 然而，一般的衍生化步驟比較復雜，同時衍生化試劑也是有害且不環(huán)保，所以針對這一問題，有待尋找一些簡單且環(huán)保的衍生化步驟，或采用一些非衍生化的方法來檢測，如電化學檢測法. 電化學檢測法靈敏度高，操作簡便，適用于糖類化合物的測定.

對于一些堿性大分子，如堿性蛋白質，在采用CZE分析時，由于毛細管內壁表面的硅羥基在pH大于3時會發(fā)生電離形成帶負電的吸附點，使管壁對堿性蛋白質產(chǎn)生強烈的吸附，從而導致分離效率下降，所以克服吸附是分析蛋白質樣品的首要任務.目前最常見的減少蛋白質吸附的方法包括改變緩沖溶液的性質或惰化毛細管內壁. 但惰化毛細管內壁比較復雜，所以主要的辦法還是在緩沖液中加入添加劑，通過改變毛細管壁的狀態(tài)以及樣品的性質來抑制蛋白質的吸附. 近年來發(fā)展起來的離子液體（lonic liquids, ILs）和 低 共 熔 溶 劑（deep eutectic solvents, DES）有望成為一種有效的添加劑來減少蛋白質的吸附作用.

CE技術在分離生物大分子方面已經(jīng)表現(xiàn)出巨大的潛力，但是定性分析仍然存在難題. 毛細管電泳與質譜儀的結合為定性問題提供了有力的手段，非常適合蛋白質、肽等生物大分子的分析. 毛細管電泳和電噴霧質譜結合是最為常見的分析方法之一，但其仍然存在一些缺點，如電接觸不穩(wěn)定，所以需要研發(fā)更多的儀器來彌補這些缺陷，毛細管電泳基質輔助激光解吸電離質譜、毛細管電泳感應耦合等離子體質譜等可以彌補這個缺陷.