基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析合成聚合物樣品制備的研究進展

代莉莉

（武漢大學 科研公共服務條件平臺，湖北 武漢 430072）

目前，化學、化工、醫(yī)藥等領域?qū)﹂_發(fā)新材料具有極大的需求，越來越多高性能的合成聚合物類新材料被開發(fā)出來. 這些材料的功能特性與化學結(jié)構密切相關，因此對合成聚合物的結(jié)構剖析顯得尤為重要. 質(zhì)譜是高分子化合物結(jié)構分析的重要手段，與核磁、紅外等表征手段相互補充[1]. 合成聚合物通常是具有不同鏈長分子的混合物，存在分子量分布，因此，簡單的聚合物也會有相對復雜的質(zhì)譜圖.1985年，Karas等[2]提出基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）的概念. MALDI技術的引入使各種大分子得以解離為氣相離子進行質(zhì)譜分析，解決了大分子質(zhì)譜分析的難題，現(xiàn)已成為表征核酸、多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子的重要手段[3]，也逐漸成為合成聚合物的有力表征手段. 合成聚合物的質(zhì)譜分析中使用最多的是電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）、基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-MS）和二次離子質(zhì)譜（SIMS）3種. De Bruycker等[4]對3種電離技術分析聚合物的效果進行了比較（如圖1所示），結(jié)果表明，ESI質(zhì)譜會產(chǎn)生多電荷離子，可能導致不同荷電狀態(tài)樣品峰的重疊，同時質(zhì)譜信號受ESI源的電位和溫度影響大，可能導致質(zhì)量偏移[5-6]. MALDI產(chǎn)生的多是準分子離子，在低質(zhì)量區(qū)存在基質(zhì)碎片等信號干擾. SIMS對分析物具有更強的破壞性，在低質(zhì)量區(qū)形成的碎片多，而完整的聚合物信號少. 相比較而言，對于分子量一般較大的聚合物來說，MALDI是更合適的質(zhì)譜分析方法. MALDI還具有很多不可替代的優(yōu)點：分析速度快、靈敏度高、分辨率高、準確度高、質(zhì)量上限高、樣品用量少，可進行高通量分析[7]. 同時，MALDI質(zhì)譜是基于“軟電離”技術，能提供完整的分子離子峰，測定絕對分子量，避免了多重電離帶來的復雜性[8]. 因此，MALDI質(zhì)譜能夠精確分析合成聚合物分子質(zhì)量分布、重復單元、末端基團以及嵌段長度[9]，對聚合物合成機理和工業(yè)生產(chǎn)具有指導意義[10-11]. 但相比生物大分子，合成聚合物的質(zhì)譜分析難度較大，更具挑戰(zhàn)性[12]. 原因在于合成聚合物通常是混合物，存在分子量分布. 由于本身結(jié)構特點，合成聚合物不易被電離，因此，樣品制備是分析成功的關鍵. 樣品制備與激光器的類型有一定關系，目前，許多類型的激光器已被用于MALDI質(zhì)譜，波長范圍從紅外到紫外，脈沖寬度從納秒到飛秒. 紅外激光器包括2.94 μm的Er:YAG激光器和10.6 μm的CO2激光器，紫外激光器包括337 nm的N2激光器、355 nm的Nd:YAG激光器、266 nm的 Nd:YAG激光器以及349 nm的Nd:YLF激光器. 由于可見光的吸收問題，可見激光尚未廣泛用于MALDI，目前已有532 nm的Er:YAG激光器. 不同的激光器激發(fā)波長不同，適用的基質(zhì)也不盡相同[13]. 目前，絕大多數(shù)使用的是紫外激光器（337和355 nm）. 355 nm 的N2激光器是一種耐用且相對便宜的激光源，355 nm的Nd:YAG激光器滿足了MALDI成像對于高重復頻率固體激光器的需求[14]. 除此之外，合成聚合物MALDI-TOF-MS的樣品制備需要合適的基質(zhì)、陽離子化試劑以及混樣方法等方面共同作用.

圖1 ESI、MALDI以及SIMS 3種技術分析聚合物示意圖[4]Fig. 1 Schematic diagrams of polymer analysis by ESI,MALDI and SIMS[4]

1 基質(zhì)

在MALDI-TOF-MS分析中，通常使用較高濃度的基質(zhì)溶液與較低濃度的聚合物溶液相混合來輔助樣品電離. 合適的基質(zhì)對于能否成功表征聚合物樣品至關重要. 選擇基質(zhì)時，遵循3個基本原則：基質(zhì)能分散包裹樣品，基質(zhì)和樣品共溶，基質(zhì)能促進電離[15]. 好的基質(zhì)具備以下優(yōu)點：具有良好的真空穩(wěn)定性、較低的蒸汽壓，在溶解樣品的溶劑中具有良好的溶解性以及在固態(tài)下與分析物具有良好的混溶性[16].

常用來分析合成聚合物的基質(zhì)如表1所列. 其中α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、2, 5-二羥基苯甲酸（DHB）、2-(4-羥基苯偶氮)苯甲酸（HAHB）等常被用作生物分子分析的基質(zhì)，也可用于一些分子量較小或者溶解度較好的聚合物樣品. 某些聚合物修飾的生物分子也可用此類基質(zhì)，如檢測聚乙二醇修飾的蛋白使用CHCA有很好的效果[17-18]. 但對于一些難溶或者分子量較大的聚合物，通常需要專門用于聚合物的基質(zhì)來進行分析才能得到好的效果.

表1 常用于合成聚合物分析的基質(zhì)Table 1 Matrices commonly used for synthetic polymer analysis

因此常規(guī)基質(zhì)的普適性有時依然較差. 為了得到更好的分析結(jié)果，探索新基質(zhì)是必然的選擇.

Améduri等[19]提出了一種新的基質(zhì)制備方法：使用7, 7, 8, 8-四氰基喹二甲烷、三氟苯甲酸和2, 3,4, 5, 6-五氟肉桂酸的混合物為基質(zhì)，分析常規(guī)基質(zhì)難以分析的聚偏氟乙烯以及含氟量高的聚合物，可得到分辨率很高的譜圖. Yerra等[20]使用低成本合成的2-氰基-3-(2-噻吩基)丙烯酸為基質(zhì)，即使在低濃度（2.5 pmol）下，也能對高分子質(zhì)量聚乙二醇（PEG103000）顯示出好的信噪比和分辨率. Ramirez-Pradilla等[21]使用α-氰基苯乙烯衍生物作為基質(zhì)，分析性質(zhì)不穩(wěn)定、高反應性的功能材料，如納米顆粒、聚合物、卟啉和富勒烯等，與常用基質(zhì)DCTB相比，具有更好的真空穩(wěn)定性和質(zhì)譜效果.

Carraher等[22]將二號鉛筆中的石墨作為基質(zhì)分析了含金屬的縮聚聚合物，與CHCA相比能得到更高質(zhì)量的譜圖，且證明石墨在600 u以上不會形成碳團簇，是一種干擾較小的基質(zhì). 石墨基質(zhì)使用時可直接將鉛筆涂覆在靶板上，方法簡便，同時適用于活潑聚合物樣品[9]，之后該課題組還用該方法分析了合成有機錫聚酯[23]. 此后，各種碳基材料被作為基質(zhì)材料得以應用，如碳納米管、石墨烯、有機金屬框架化合物等，尤其是用于低分子量或非極性化合物的分析. Cho等[24]將多層石墨烯作為基質(zhì)用于1 000 u的極性聚乙二醇和650 u的非極性聚甲基丙烯酸甲酯的分析，獲得了沒有低質(zhì)量區(qū)干擾信號的高質(zhì)量譜圖. Wu等[25]制備了沒食子酸官能化的鋯1, 4-二羧基苯金屬有機框架化合物作為新基質(zhì)，對200~10 000 u 質(zhì)量范圍內(nèi)的聚乙二醇都有很好的效果.

Armstrong等[26]使用一系列離子液體為基質(zhì)，分析了肽、蛋白質(zhì)和PEG，某些離子液體比固體基質(zhì)顯示出更高的真空穩(wěn)定性. 使用離子液體N,N-二異丙基乙基銨α-氰基-4-羥基肉桂酸酯分析可生物降解的極性聚合物，與常規(guī)基質(zhì)相比離子液體基質(zhì)所需的激光強度小，能最大限度地減少聚合物降解，從而準確靈敏地分析不穩(wěn)定極性聚合物的數(shù)均分子量、重均分子量和多分散性[27]. Gabriel等[28]使用MALDI成像方法檢測了離子液體作為基質(zhì)時樣品的均勻性，表明離子液體基質(zhì)方法的均勻性和重現(xiàn)性提高，改善了傳統(tǒng)干滴法制樣時聚合物樣品與基質(zhì)分離的缺點.

面對某一個或某一類樣品，如何從眾多候選基質(zhì)中選擇合適的基質(zhì)至關重要. Yoo等[29]比較了CHCA、DHB和蒽三酚3種基質(zhì)分析多種合成聚合物的效果，結(jié)果表明，雖然通常使用CHCA和DHB獲得的譜圖較好，但對某些樣品中，只有使用蒽三酚作為基質(zhì)時，鬼峰才會消失. Yang等[30]選擇3種市售聚合物胍殺菌劑為對象來研究基質(zhì)的選擇，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)能同時檢測出3種聚合物的基質(zhì). 以基質(zhì)和分析物的質(zhì)子親和力來解釋，質(zhì)子親和力較低的基質(zhì)對質(zhì)子親和力較低的聚合物胍更敏感. 從另一個角度，樣品需與基質(zhì)固體結(jié)合，并且被基質(zhì)分離，樣品需和基質(zhì)有很好的混溶性，即樣品在基質(zhì)中（而非在溶劑中）能很好的溶解，否則在溶劑蒸發(fā)過程中基質(zhì)將與樣品分層，影響后續(xù)測試結(jié)果. 反相液相色譜法研究表明，如果樣品與基質(zhì)的保留時間相匹配，即極性相似，則可以獲得較好的MALDI-TOFMS結(jié)果，這與我們熟知的“相似相溶原理”相一致[31-32]. 因此，可首先選擇與聚合物極性類似的基質(zhì)來進行測試[33].

基質(zhì)添加劑在某些情況下可以改善MALDITOF-MS分析結(jié)果，有時基質(zhì)單獨使用沒有信號，加入添加劑則能夠獲得理想的圖譜. Kassis等[34]在以二苯甲酚為基質(zhì)分析聚甲基丙烯酸甲酯體系中，添加N-辛基-D-吡喃葡萄糖苷等3種非離子表面活性劑，顯著改善了質(zhì)譜信號. 表面活性劑可降低兩個不互溶相之間的界面張力，在臨界膠束濃度值附近，表面活性劑分子形成膠束，聚合物和基質(zhì)分子更容易聚集. Bara等[35]使用HPA為基質(zhì)，檸檬酸銨為基質(zhì)添加劑，分析了分子量為50 000~60 000的聚酰胺，并由此推斷鏈中重復單元在45到55個之間.

2 離子化試劑

生物分子在MALDI-TOF-MS分析之前，應盡量去除緩沖液、金屬離子等以避免信號干擾，但對于有些合成聚合物，則需要離子化試劑幫助電離，電離機制是陽離子結(jié)合而不是質(zhì)子化電離. 金屬鹽是常用的離子化試劑，離子化試劑的選擇與樣品相對應. 堿離子可與含氧聚合物（如聚酯和聚醚）或含其他雜原子的聚合物加成，堿金屬多是單同位素或含較少同位素，通常不會擴大分布[1]. 含雙鍵或芳香族體系的聚合物（如聚苯乙烯和聚丁二烯）可與過渡金屬離子（如銀和銅）加成. 不飽和聚合物中的π體系與陽離子作用，常常能夠觀察到分析物與離子加合物的峰. 既不含雜原子又沒有不飽和度的樣品最難離子化，例如聚乙烯類材料[36]. 使用易溶于有機溶劑的堿性鹽（如三氟乙酸銀）或者基質(zhì)對應的堿性鹽可有更好的效果. 離子化試劑的選擇對聚合物樣品的成功分析也至關重要. 郝歆愚[37]分別使用銀鹽和鈉鹽測試含二甲硅烷基的聚苯乙烯樣品，由于結(jié)構中有易氧化的Si-H基團存在，當使用有氧化性的銀鹽作為陽離子試劑時，譜圖中形成較明顯的氧化物峰，對譜圖解析、結(jié)果判斷造成干擾. 選用無氧化性的鈉鹽作為陽離子試劑則避免了這種干擾. 李仕誠等[38]對非極性聚合物分析時離子化試劑的選擇進行了研究. 以DCTB為基質(zhì)，以聚丁二烯、不同聚合度的聚苯乙烯、聚乙烯等為樣品，考察了9種銅鹽的促離子化作用. 結(jié)果表明，Cu(NO3)2作為離子化試劑對3類非極性聚合物的分析均能獲得最佳信號強度和分辨率. 使用掃描電子顯微鏡進行形貌分析發(fā)現(xiàn)，相比于其它銅鹽，Cu(NO3)2與樣品和基質(zhì)混合干燥后可得到更均勻的樣品結(jié)晶. Ehlers等[39]通過理論計算表明匹配的陽離子的大小與聚合物鏈的長短密切相關. PEG鏈在與較大的陽離子相互作用時可以形成更穩(wěn)定的復合物. Shimada等[40]研究了不同聚合度的PEG與陽離子的親和力，表明較長鏈的PEG傾向于與更大的陽離子結(jié)合. 例如，PEG的聚合度n為34~39時，與Cs離子結(jié)合更穩(wěn)定. PEG的聚合度n為12~17時，與Na離子結(jié)合更穩(wěn)定. Conway等[41]使用LiCl分析PEG200，可觀察的聚合度n低至2.

3 混樣方法

樣品、基質(zhì)及陽離子化試劑以合適的濃度和比例混合可以改善信號強度和分子量分布等[42-43]. 樣品濃度過高，即溶劑揮發(fā)時，樣品將最先達到溶解極限發(fā)生沉淀，共結(jié)晶的效果很差. Gabriel等[44]使用光學顯微鏡、MALDI成像質(zhì)譜和紅外成像光譜儀等分析了當改變基質(zhì)與樣品的比例和基質(zhì)的濃度時，干滴法制備的樣品點的形貌和均勻性. 結(jié)果表明，使用常規(guī)基質(zhì)質(zhì)量濃度（10 mg/mL）時，樣品點呈環(huán)狀（咖啡環(huán)效應），而較高濃度的基質(zhì)溶液傾向于形成均勻的樣品層. 樣品和基質(zhì)的分離主要是由干燥過程中的基質(zhì)遷移引起的，基質(zhì)遷移是馬蘭哥尼效應和毛細管效應相互作用的結(jié)果. 使用高濃度的基質(zhì)溶液可以避免基質(zhì)和聚合物以及不同分子量的聚合物同系物之間的分離. 基質(zhì)濃度高，則沉淀（伴隨晶體生長）進行快，毛細管效應無法對較大的基質(zhì)晶體進行傳輸及固定. 基質(zhì)/分析物的質(zhì)量比（M/A）通常在100∶1到106∶1范圍內(nèi)，該比例往往隨著聚合物分子大小的增加而增加，即需要更多的基質(zhì)作為每個分析物分子的分散劑、解吸劑和電離劑[45-46]. 增加M/A比例可減少多聚體的形成，但對分子量較大的聚合物來說，過大的M/A導致可電離的分析物較少[47]. Wang等[48]在聚合物/基質(zhì)比例不變時，不斷增加陽離子化試劑的用量，起初能夠增加聚合物的信號強度，之后譜圖信號沒有明顯改善，反而會因陽離子加成簇峰干擾分析. Hoteling等[49]發(fā)現(xiàn)當添加的銀的濃度與聚合物近似化學計量時，可獲得好的MALDI譜圖. 當銀的濃度高出一個數(shù)量級時，過多陽離子化試劑會形成基質(zhì)鹽團簇，抑制樣品信號. Schriemer等[50]使用聚苯乙烯研究了試驗所得的數(shù)均分子量（Mn）與聚合物、基質(zhì)、陽離子試劑三者的比例關系. 試驗發(fā)現(xiàn)，當添加高質(zhì)量組分時，所得Mn降低，這可能與多聚體的形成有關，質(zhì)量較高的組分更易形成多聚體，降低了主分布強度，如圖2所示. 改變M/A也會影響Mn測定，M/A較高時，由于在計算Mn時僅考慮主分布，更多的基質(zhì)將有助于更好地分離聚合物鏈，多聚體的減少使Mn隨著基質(zhì)與分析物的比例增加. 此外，低質(zhì)量組分和高質(zhì)量組分解吸/電離效率存在根本差異，低濃度下，解吸/電離有利于高質(zhì)量組分. 對陽離子化試劑研究發(fā)現(xiàn)，陽離子化試劑種類的不同也可引起不同組分的質(zhì)量歧視.

圖2 多聚體形成對Mn值的影響（a） 聚苯乙烯5 050（100 pmol）和聚苯乙烯11 600（100 pmol），Mn期望值為8 245，（b）聚苯乙烯5 050（100 pmol）和聚苯乙烯11 600（100 pmol）以及聚苯乙烯35 000（75 pmol）[50]Fig. 2 Effect of multimer formation on measured Mn values(a) polystyrene 5 050 (100 pmol) and 11 600 (100 pmol),expected Mn value was 8 245, (b) polystyrene 5 050(100 pmol), 11 600 (100 pmol) and polystyrene 35 000 (75 pmol) [50]

溶劑也是混合制樣時的重要因素之一. 所用溶劑對樣品形態(tài)和分子量分布檢測有很大影響，應避免使用難以溶解聚合物樣品的溶劑[51]. 根據(jù)經(jīng)驗，如果樣品難溶于溶劑，呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)或者底部沉淀狀態(tài)，通常在后續(xù)分析中都無法得到質(zhì)譜信號. 使用快干溶劑（即薄層法）可以促進共結(jié)晶的形成[52]. 因此，具有溶解范圍寬和揮發(fā)速度快的溶劑是聚合物樣品制備的理想選擇. 但是通常聚合物或者基質(zhì)都不一定具有好的溶解度. 一些較難溶解的聚合物可能需要添加適當?shù)挠袡C溶劑進行溶解，如二氯甲烷、四氫呋喃、六氟異丙醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲苯、二甲基甲酰胺等. 聚合物MALDI-TOF-MS分析常見的兩個問題是質(zhì)量歧視和重現(xiàn)性差，使用二元溶劑可能會造成上述問題，因此最好將基質(zhì)和樣品溶解在同一種溶劑中[53]. 如果使用二元溶劑，優(yōu)先使用共沸物，揮發(fā)時可保持溶劑組成不變，使樣品點保持均勻穩(wěn)定[18]. Wu等[54]研究了尼龍-6和基質(zhì)HABA在6組溶劑中的效果. 使用共聚焦激光掃描顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察共晶的形態(tài)，表明溶解度更好的溶劑結(jié)晶更小，具有更高的比表面積，因此可能具有更高效的能量轉(zhuǎn)移，從而使MALDI質(zhì)譜的效果也更好. 有研究證明小尺寸晶粒也可在點與點之間提供更好的重現(xiàn)性[55]. Wang等[48]選取甲醇、四氫呋喃、丙酮溶解不同聚合物進行MALDI分析，表明極性最弱的四氫呋喃與非極性聚合物PEG6000獲得的譜圖信號最佳，這可能是由于它們的極性都相對較小，因而具有好的相溶性，從而具有好的離子化效果.

4 總結(jié)及展望

合成聚合物的MALDI-TOF質(zhì)譜分析中樣品制備非常關鍵. 合適的樣品制備可以使樣品均勻地混溶于液體基質(zhì)乃至結(jié)晶后的固體基質(zhì)中，從而產(chǎn)生良好的質(zhì)譜信號. 基質(zhì)的選擇是第一步也是最重要的一步. 合適的離子化試劑以及混樣方法對于檢測結(jié)果也有重要影響. 探索出更多適合于聚合物分析同時具有一定普適性的基質(zhì)，簡化樣品制備時的試錯過程，仍是未來MALDI-TOF質(zhì)譜技術的研究方向.