黃瓜枯萎病拮抗菌Burkholderia gladioli L1-3的分離鑒定及防病促生效果

李亞莉 侯 棟 岳宏忠 張東琴 段艷巧

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070）

黃瓜枯萎病又叫死秧病、蔓割病、萎蔫病，是一種土傳性病害，其病原菌為尖孢鐮孢菌黃瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.cucumerinum Owen）。尖孢鐮孢菌可以通過根毛及植株傷口處侵染，使黃瓜根莖部維管束變褐腐爛，病原菌進(jìn)一步侵染繁殖后，可使整株枯萎死亡（曹云娥 等，2020）?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用以及長期使用同種農(nóng)藥，致使病菌產(chǎn)生抗藥性，根際土壤中的有益微生物數(shù)量減少；同時化學(xué)農(nóng)藥的大量使用還會對環(huán)境造成污染，危害人、畜健康（Wang et al.，2020）。培育抗病黃瓜新品種是防治枯萎病較安全的一種措施，但由于品種選育需要較長時間，實(shí)際生產(chǎn)中的抗病黃瓜品種并不多見。嫁接技術(shù)在黃瓜枯萎病的防治上應(yīng)用最廣泛，但由于嫁接需要一定的技術(shù)，人工成本較高，且砧木對接穗果實(shí)風(fēng)味有一定的影響，在一定程度上限制了嫁接技術(shù)的發(fā)展。常年種植同一種作物易使根際土壤微生物環(huán)境被破壞，有害微生物數(shù)量增加，土傳病害越來越嚴(yán)重（賈紅梅等，2020；劉會芳 等，2021）。利用有益拮抗微生物防治土傳病害，對環(huán)境無污染，對人畜無害，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展趨勢。

本試驗(yàn)從甘肅省蘭州、武威、靖遠(yuǎn)等地22 塊多年連作黃瓜的枯萎病發(fā)生地塊采集土樣，采用平板對峙法從分離純化的細(xì)菌中篩選拮抗菌株，基于形態(tài)特征、生理生化特性及基因序列分析進(jìn)行菌株鑒定；然后測定拮抗菌株的抑菌譜，并通過盆栽試驗(yàn)評價其對黃瓜枯萎病的防病促生效果，以期為蔬菜病害生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜品種為甘豐袖玉，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

供試病原菌為尖孢鐮孢菌黃瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.cucumerinum Owen）、辣椒腐霉菌（Pythium spinosum）、辣椒灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、辣椒立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、茄鏈格孢（Alternaria solani）、尖孢鐮孢菌甜瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.melonis）、尖孢鐮孢菌西瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.niveum）、尖孢鐮孢菌十字花科?；停‵usarium oxysporumSch1.f.sp.conglutinans），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所、北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所、甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所和本所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌株的分離鑒定 2021 年3 月，從甘肅省蘭州、武威、靖遠(yuǎn)等地22 塊多年連作黃瓜的枯萎病發(fā)生地塊采集土樣，每份100 g，采集深度10～20 cm；分別裝入無菌自封袋，帶回本所實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃的恒溫冰箱，用于拮抗菌的分離。

采用土壤稀釋法分離細(xì)菌。分別將22 份土樣充分混勻，隨機(jī)稱取10 g，加入90 mL 無菌水，置于搖床28 ℃、180 r·min-1振蕩30 min，此時菌懸液濃度為1×10-1g·mL-1；然后取1 mL 菌懸液，加入9 mL 無菌水，配制成濃度為1×10-2g·mL-1的菌懸液；依次類推，配制成濃度分別為1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7g·mL-1的菌懸液。分別取濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7g·mL-1的菌懸液0.2 mL，加入牛肉膏蛋白胨平板中，迅速混勻、倒置，每個濃度3 皿；28～30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，將單菌落劃線培養(yǎng)至純，保存于20%甘油中，放置于-80 ℃的恒溫冰箱保存。

拮抗菌株的篩選采用平板對峙法。在PDA 平板中央接種直徑7 mm 的拮抗菌菌餅，在距離拮抗菌菌餅2 cm 處接種病原真菌菌餅，以僅接種病原真菌菌餅為對照，每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)3 皿；于28～30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d，當(dāng)對照長滿整個平板后，測定抑菌帶寬度（抑菌圈直徑），篩選抑菌效果好的細(xì)菌菌株。初篩采用抑菌帶法，復(fù)篩采用抑菌圈法。

采用形態(tài)特征觀察、生理生化特性測定和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析的方法，對拮抗菌株進(jìn)行鑒定。將拮抗菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落顏色和形態(tài)，利用透射電鏡觀察菌體形態(tài)，同時參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）的方法，對拮抗菌株進(jìn)行革蘭氏染色、生長溫度等生理生化試驗(yàn)。使用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA。根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)引物gyrB-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和gyrB-R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）（Sharga &Lyon，1998）。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）為：DNA 模板4 μL，上、下游引物各2 μL，mix 25 μL，ddH2O 17 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，16S rDNA測序工作由甘肅科美意生物科技有限公司完成。將所測菌株的16S rDNA 序列上傳Ezbiocloud 網(wǎng)站進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析與模式菌的親緣關(guān)系。

1.2.2 拮抗菌株的抑菌譜測定 采用平板對峙法測定拮抗菌株對辣椒腐霉菌、辣椒灰葡萄孢菌、辣椒立枯絲核菌、辣椒疫霉菌、茄鏈格孢、尖孢鐮孢菌甜瓜?；?、尖孢鐮孢菌西瓜?；?、尖孢鐮孢菌十字花科?；偷戎匾卟俗魑锊≡囊志Ч?。以培養(yǎng)皿中心不接種拮抗菌株的平板為對照，每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)3 皿，28～30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，測定抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.3 拮抗菌株對黃瓜枯萎病的防效試驗(yàn) 菌劑制備。將拮抗菌株接種于50 mL 液體LB 培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫?fù)u床220 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。施用前用無菌水調(diào)節(jié)拮抗菌劑濃度為1×108cfu·mL-1。

黃瓜枯萎病菌菌懸液制備。將保存?zhèn)溆玫募怄哏犳呔M(jìn)一步活化，待PDA 培養(yǎng)基布滿菌絲后，倒入適量無菌水刮取菌絲，經(jīng)雙層紗布過濾除去菌絲，濾液用無菌水稀釋為濃度1×106個·mL-1的孢子懸浮液。

2021 年9 月，挑選無病蟲害的飽滿黃瓜種子催芽，待胚根長約1 cm 時充分浸沒在黃瓜枯萎病菌菌懸液中30 min，撈出后播種于直徑8 cm 的花盆中，每盆1 株；育苗基質(zhì)由山東聊城魯億育苗基質(zhì)有限公司與山東齊魯大學(xué)聯(lián)合研發(fā)，有機(jī)質(zhì)含量35%～45%，腐殖酸含量15%～25%，pH 值5.5～6.5。播種后穴施5 mL 拮抗菌劑，以不施用拮抗菌劑為對照（CK1），以清水浸泡種子、不施用拮抗菌劑為空白對照（CK2）；每處理150 株，3 次重復(fù)。常規(guī)育苗管理，播種后30 d 調(diào)查黃瓜枯萎病發(fā)病情況，并測定幼苗根系活力、葉綠素含量、脯氨酸（Pro）含量、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標(biāo)。

黃瓜枯萎病發(fā)病程度及分級標(biāo)準(zhǔn)參考方中達(dá)（1998）的標(biāo)準(zhǔn)：0 級，根、莖、葉生長正常；1 級，1/4 以下根、莖變黃，植株稍有矮化；2 級，1/4～1/2根、莖變黃，下部葉片葉脈褪色；3 級，1/2～3/4根、莖變黃，莖基部縱裂；4 級，3/4 以上根、莖變黃或植株直接枯萎死亡。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)× 100%

病情指數(shù)=∑（病級株數(shù)×代表級數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）× 100

防治效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)× 100%

采用紅四氮唑（TTC）還原法測定根系活力，采用丙酮提取法測定葉綠素含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量，采用紫外分光光度法測定POD、SOD 活性和Pro 含量（李小方和張志良，2016）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010 和SPSS 20.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離及拮抗菌株的篩選

從22 份土樣中分離得到205 株細(xì)菌菌株，通過平板對峙法初篩獲得抑菌帶寬度大于1 mm 的拮抗菌株107 株，占比為52.20%。其中，抑菌帶直徑大于4 mm 的菌株55 株，大于5 mm 的菌株38株。采用抑菌圈法繼續(xù)對抑菌帶寬度大于5 mm 的38 株拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，獲得抑菌圈直徑大于18 mm 的菌株22 株，大于20 mm 的菌株6 株（表1、圖1）。

表1 拮抗菌株對黃瓜枯萎病菌的抑制作用

圖1 拮抗菌株對黃瓜枯萎病菌的平板拮抗作用

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 分子生物學(xué)鑒定 將拮抗菌株L1-3、L2-3、L2-4、L3-3、L4-2、W4-2 的16S rDNA序列在Ezbiocloud 網(wǎng)站上進(jìn)行比對，顯示與模式菌株Burkholderia gladioliNBRC 13700T相似性最高，相似系數(shù)分別為99.50%、99.01%、99.80%、99.42%、99.43%、99.29%。下載相關(guān)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），本試驗(yàn)獲得的6 株拮抗菌株均與Burkholderia gladioliNBRC 13700T聚在同一分支內(nèi)，可初步鑒定這6 株拮抗菌株均為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）。

圖2 6 株拮抗菌株的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性測定 通過分子生物學(xué)鑒定，拮抗菌株L1-3、L2-3、L2-4、L3-3、L4-2、W4-2 均為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌，選擇其中拮抗效果較好的菌株L1-3 進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性測定。結(jié)果表明，L1-3 的菌落淺黃色，圓形，表面光滑、濕潤、稍凸起，邊緣整齊；菌體短桿狀，兩端鈍圓，單個或成對排列；26～37 ℃條件下均能生長，為革蘭氏陰性好氧菌。

2.3 拮抗菌株L1-3 的抑菌譜測定

由表2、圖3 可知，菌株L1-3 對8 種主要蔬菜作物病原菌都有一定的拮抗作用，抑菌圈直徑均大于21 mm，抑菌率為23.74%～38.23%；其中，菌株L1-3 對辣椒疫霉菌和辣椒灰葡萄孢菌的拮抗作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑分別達(dá)35.33 mm 和31.02 mm，抑菌率分別為38.23%和34.08%。表明菌株L1-3 具有廣譜的拮抗作用，可將其應(yīng)用于多種植物病害的生物防治。

表2 拮抗菌株L1-3 對8 種主要蔬菜作物病原菌的抑制作用

圖3 拮抗菌株L1-3 對8 種主要蔬菜作物病原菌的平板拮抗作用

2.4 拮抗菌株L1-3 對黃瓜枯萎病的防治效果

從圖4 可以看出，接種黃瓜枯萎病菌后施用L1-3 菌劑的黃瓜幼苗葉片肥大，葉色變深，根系較對照（CK1）增多，與空白對照（CK2）接近。由表3、4 可知，施用L1-3 菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)64.71%，黃瓜幼苗的根系活力、葉綠素含量、POD 和SOD 活性均顯著高于對照（CK1），且根系活力、可溶性蛋白質(zhì)含量、POD 和SOD 活性、Pro 含量均與空白對照（CK2）差異不顯著。

圖4 拮抗菌株L1-3 對黃瓜枯萎病的防治效果

表3 拮抗菌株L1-3 對黃瓜枯萎病的防治效果

表4 拮抗菌株L1-3 對黃瓜幼苗的促生效果

3 討論與結(jié)論

伯克霍爾德氏菌是近年來在植物根際土壤中發(fā)現(xiàn)的一類有益微生物（Paungfoo et al.，2016；Mullins et al.，2019），能夠在至少30 種植物的根系中大量定殖，具有多種促生功能（Kim et al.，2012；宮安東 等，2019）。伯克霍爾德氏菌在根際環(huán)境中能夠產(chǎn)生多種抗菌次生代謝產(chǎn)物，可誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)抗病性，抑制病原菌的生長，促進(jìn)植物生 長（Wang et al.，2011；Depoorter et al.，2016；許萌杏 等，2021）。此外，伯克霍爾德氏菌還具有降解多種有害物質(zhì)的特性（Simonetti et al.，2018）。

近年來從根際土壤中分離出的一批伯克霍爾德氏菌屬細(xì)菌對植物病原菌具有廣譜的拮抗作用。唐瀅等（2020）研究表明，伯克霍爾德氏菌Z1 對香梨腐爛病原菌迂回殼囊孢菌、西瓜腐皮鐮刀菌、辣椒炭疽病菌、油菜核盤菌及水稻立枯絲核菌有較強(qiáng)的拮抗作用。許萌杏等（2021）研究表明，洋蔥伯克霍爾德氏菌JX-1 對尖孢鐮孢菌苦瓜?；汀⒋厣L蠕孢菌、高粱莖點(diǎn)霉和立枯絲核菌等病原真菌具有不同程度的抑制作用。孫正祥等（2021）、吳麗娟等（2022）研究表明，伯克霍爾德氏菌YZU-S230 和JP2-270 對水稻紋枯病菌、稻瘟病菌、馬鈴薯晚疫病菌、草莓灰霉病菌、番茄斑枯病菌、小麥赤霉病菌和多種作物枯萎病菌有廣譜的拮抗作用。本試驗(yàn)從黃瓜連作土壤中分離出的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌L1-3 對尖孢鐮孢菌甜瓜?；?、尖孢鐮孢菌西瓜?；?、尖孢鐮孢菌十字花科專化型、辣椒腐霉菌、辣椒灰葡萄孢菌、辣椒立枯絲核菌、辣椒疫霉菌、茄鏈格孢均具有較強(qiáng)的拮抗作用，表明菌株L1-3 具有廣譜的拮抗作用，可將其應(yīng)用于這些蔬菜病害的生物防治。

前人研究表明，伯克霍爾德氏菌可通過生物固氮作用促進(jìn)甘蔗生長（Paungfoo et al.，2014）。接種雙向伯克霍爾德氏菌或卡瑞苯西思伯克霍爾德氏菌，可以促進(jìn)籽粒莧的生長，使籽粒莧吸收氮素的能力提高，地上部和根部的氮含量增加（Parra-Cota et al.，2014）。伯克霍爾德氏菌在營養(yǎng)不良的氧化土中，能夠顯著促進(jìn)菜豆生長（de Oliveira-Longatti et al.，2015）。熱帶伯克霍爾德氏菌MTo-293 能夠在番茄根部定殖且蔓延到植物各個器官，促進(jìn)番茄生長（Bernabeu et al.，2015）。接種伯克霍爾德氏菌，可以提高水稻對磷素的吸收，促進(jìn)水稻生長（Stephen et al.，2015；Khan et al.，2017）。吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007 能夠產(chǎn)生嗜鐵素，進(jìn)而促進(jìn)黃瓜幼苗生長（閔莉靜 等，2019）。在根部及葉片中定殖花園伯克霍爾德氏菌，可以提高甘蔗幼苗的單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、株高、葉綠素含量；在根部接種伯克霍爾德氏菌MYSP113，甘蔗根部的過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性顯著提高（Malviya et al.，2019，2020）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照（CK1）相比，唐菖蒲伯克霍爾德氏菌L1-3 可以顯著提高黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。

施俊鳳等（2018）研究表明，采前噴施洋蔥伯克霍爾德氏菌菌懸液，可抑制草莓果實(shí)表面的病原菌，降低果實(shí)腐爛率。Sandania 等（2019）研究了伯克霍爾德氏菌對辣椒炭疽病的生防作用，結(jié)果表明伯克霍爾德氏菌對辣椒炭疽病菌的芽孢萌發(fā)抑制率達(dá)100%，菌絲腫脹增厚、畸形；辣椒種子接種炭疽病菌后進(jìn)行伯克霍爾德氏菌劑處理，幼苗存活率顯著高于對照。本試驗(yàn)中，唐菖蒲伯克霍爾德氏菌L1-3 對黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)64.71%。

綜上所述，本試驗(yàn)首次篩選獲得的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）L1-3 除對黃瓜枯萎病菌有較強(qiáng)的拮抗作用外，還對多種蔬菜病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用。推測菌株L1-3 可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，或產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的抑菌作用，關(guān)于菌株L1-3 及其抑菌物質(zhì)的功能需進(jìn)一步研究。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株L1-3 對黃瓜枯萎病的防效達(dá)64.71%，并且黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性顯著高于對照（CK1），表明菌株L1-3 在植物病害生物防治中具有一定的開發(fā)潛力，下一步將對菌株L1-3 的抑菌機(jī)理、發(fā)酵工藝和生防產(chǎn)品的研發(fā)進(jìn)行深入研究。