馬鈴薯秸稈降解菌的篩選鑒定及其降解能力測(cè)定

修志君 宋亞迪 張冬梅 楊春芳 張學(xué)峰 張笑宇*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；2 烏蘭察布市新時(shí)代文明實(shí)踐指導(dǎo)中心，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

自從我國提出禁燒秸稈、推進(jìn)秸稈綜合利用的政策，秸稈利用率大幅提升，玉米、小麥、水稻秸稈利用率較高。馬鈴薯秸稈通常采用破碎還田，但只是破碎成較小的秸稈，而馬鈴薯主要種植區(qū)氣候冷涼、干旱少雨，秸稈降解較慢，且內(nèi)蒙古西部烏蘭察布市大部分地區(qū)沒有深翻地的耕作習(xí)慣，或是在一年播種多茬的地區(qū)，秸稈降解也較慢。

我國馬鈴薯種植面積居世界首位（張爍，2021），2017 年至今播種面積占全球的29.88%以上（徐寧 等，2021）。內(nèi)蒙古是我國馬鈴薯的主要種植區(qū)，隨著馬鈴薯種植面積的增加秸稈處理問題突顯。馬鈴薯秸稈量大，且大部分病原菌在土壤或土壤中的病殘?bào)w上越冬，如馬鈴薯黑痣?。≧hizoctoniaspp.）、馬鈴薯枯萎病（Fusariumspp.）和馬鈴薯黃萎?。╒erticilliumspp.）等，如果秸稈降解不徹底會(huì)影響下茬作物生長(zhǎng)又提供了侵染病菌來源，加重了病害的發(fā)生（董金皋，2015）。加速秸稈降解，一些病原菌會(huì)隨著秸稈降解而死亡，能大大減少病害的初侵染來源，減輕病害發(fā)生（曹啟光 等，2006；趙永強(qiáng) 等，2017；姜珊 等，2021）。另外，秸稈降解能提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤理化性質(zhì)，增加土壤肥力和土壤中微生物種群及數(shù)量（張琴 等，2012；Chen et al.，2017）。

農(nóng)作物秸稈作為肥料還田是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用的重要途徑。由于秸稈富含纖維類物質(zhì)，其中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等高分子聚合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、性質(zhì)穩(wěn)定，自然條件下降解緩慢。微生物能促進(jìn)秸稈快速降解，是秸稈資源化利用的有效方法。國內(nèi)外有關(guān)秸稈降解菌的篩選及利用研究很多，其中秸稈常溫降解菌的報(bào)道較多，目前發(fā)現(xiàn)真菌—煙曲霉菌Z-3（Aspergillus fumigatus）（陳露露，2019）、細(xì)菌—金黃桿菌屬（Chryseobacteriumsp.）（戴相群，2016）、放線菌—鏈霉菌GS-4-21（Streptomyces）（劉曉飛 等，2020）等均具有降解秸稈的能力。關(guān)于水稻、玉米和小麥秸稈的降解菌株研究報(bào)道較多（Xu &Yang，2010；李曉秀 等，2017；史彬 等，2018），但未見馬鈴薯秸稈降解菌的報(bào)道，因此篩選、鑒定馬鈴薯秸稈降解菌對(duì)冷涼地區(qū)和一年多茬種植地區(qū)馬鈴薯秸稈的快速降解、防病和土壤改良具有重要意義。

本試驗(yàn)從馬鈴薯田間采集土樣篩選馬鈴薯秸稈降解菌，并測(cè)定其秸稈降解能力；通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，以期為促進(jìn)秸稈快速降解原位還田和我國秸稈生物質(zhì)資源充分利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌源土壤和無病害、無霉變馬鈴薯秸稈均于2020 年秋季取自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市武川縣馬鈴薯田。馬鈴薯秸稈在流動(dòng)自來水下洗凈后，于80 ℃烘箱烘干，剪成3～4 cm 長(zhǎng)段備用。

酶活測(cè)定試劑盒，購自蘇州格雷斯生物技術(shù)有限公司。TIAN GEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），購自天根生化科技（北京）有限公司。

LB 固體培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基、高氏1 號(hào)培養(yǎng)基、碳源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氮源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基、丙二酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基、甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基、淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基、脂肪水解試驗(yàn)培養(yǎng)基、NA 培養(yǎng)基，參照孫彥敏（2019）的方法進(jìn)行配制。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g，NH4NO31 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO42.5 g，酵母提取粉0.5 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨3 g，（NH4）2SO43 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL。馬鈴薯秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基：2 g 馬鈴薯秸稈，50 mL 營養(yǎng)液。營養(yǎng)液：（NH4）2SO41.4 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5 mg，MnSO4·H2O 2.5 mg，ZnSO42 mg，CoCl23 mg，尿素0.3 mg，蒸餾水1 000 mL。

以上培養(yǎng)基及營養(yǎng)液均在121 ℃下滅菌20 min。

1.2 秸稈降解菌的初篩

1.2.1 菌株的分離純化 稱取10 g 土壤樣品加入裝有90 mL 無菌水的三角瓶中，振蕩30 min，靜置20 min，取1 mL 上清液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至1 ×10-8～1×10-1共8 個(gè)濃度；然后各取0.1 mL，分別在LB 固體培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基及高氏1 號(hào)培養(yǎng)基上涂布分離并倒置于室溫條件下培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出單菌落，挑取不同形態(tài)菌株進(jìn)行純化，獲得純菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株初篩試驗(yàn) 采用點(diǎn)接種法分別將純化后的菌株接種至羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，于室溫條件下培養(yǎng)72 h，然后加入1 mg·mL-1剛果紅溶液染色30 min，棄去染液，加入1 mol·L-1NaCl 溶液脫色20 min，觀察并測(cè)量菌落直徑（d）及其周圍透明圈直徑（D），計(jì)算D/d 值。

1.3 馬鈴薯秸稈降解率的測(cè)定

將初篩得到的具有纖維素降解能力的菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中，制備濃度為1×107CFU·mL-1的菌懸液，按體積10%的比例接種至馬鈴薯秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不接菌為空白對(duì)照，設(shè)3 次重復(fù)，28 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別在第0、5、15、25、35 天取樣，將不同處理的秸稈殘?jiān)脽o菌水反復(fù)清洗3 次，置于80 ℃烘箱烘干至恒重后稱量質(zhì)量，計(jì)算秸稈相對(duì)降解率。

式中，M1為對(duì)照秸稈質(zhì)量，M2為降解后秸稈質(zhì)量。

1.4 半纖維素及纖維素酶活性測(cè)定

制備濃度為1×107CFU·mL-1的菌懸液，按體積比9%的接種量分別將菌懸液接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)8 d，每隔24 h 取2 mL 待測(cè)液，超聲破碎15 s，間隔10 s，重復(fù)30 次，然后4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，使用酶活測(cè)定試劑盒進(jìn)行菌株的半纖維素酶、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 采用稀釋法將菌株涂布于LB固體培養(yǎng)基上，待其長(zhǎng)出單個(gè)菌落，觀察菌落形態(tài)、顏色、透明度、邊緣整齊程度、表面隆起與凹陷狀況。

1.5.2 生理生化特性測(cè)定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）和《植病研究法》（董漢松，2012）的方法對(duì)菌株的革蘭氏染色、碳氮源和丙二酸鹽的利用、甲基紅試驗(yàn)、淀粉水解、脂肪水解、氧化酶試驗(yàn)和過氧化氫酶試驗(yàn)等生理生化特性進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 分子生物學(xué)鑒定 ①通用引物PCR 鑒定。DNA 的提取按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）說明書進(jìn)行，PCR 引物分別為27F 和1492R、7F 和1540R，引物信息詳見表1。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶0.25 μL，ddH2O 17 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度（表1）30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)34 次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序。將所得序列與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，選取相似度較高的菌株序列進(jìn)行分析。

表1 引物名稱及序列信息

② 特異性引物PCR 鑒定。所用引物為rpoBF和rpoBR、trpBF 和trpBR（Ainur et al.，2021），引物信息詳見表1，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上文。

③多位點(diǎn)序列分析。將4 個(gè)基因的PCR 產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序。將得到的4 個(gè)基因序列進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，選取相似度較高的菌株序列進(jìn)行分析，利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.5.4 生物學(xué)特性測(cè)定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）的方法對(duì)菌株生長(zhǎng)適宜溫度和pH 進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈降解菌的分離純化與初篩

經(jīng)分離純化共獲得10 株菌株，經(jīng)過初篩，得到1 株菌株，命名為WXB10。菌株WXB10 在剛果紅染色試驗(yàn)平板上出現(xiàn)透明圈，透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d）為5.53，具有一定的纖維素降解能力（圖1）。

圖1 菌株WXB10 的剛果紅染色試驗(yàn)結(jié)果

2.2 菌株WXB10 對(duì)馬鈴薯秸稈的降解作用

由圖2 可知，菌株在液態(tài)發(fā)酵過程中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，馬鈴薯秸稈質(zhì)量顯著下降。發(fā)酵5 d 后秸稈降解速率加快，發(fā)酵35 d 時(shí)秸稈剩余量為0.85 g，秸稈降解率達(dá)到57.73%。

圖2 菌株WXB10 對(duì)馬鈴薯秸稈的降解效果

2.3 菌株WXB10 半纖維素及纖維素酶活性測(cè)定

由圖3 可以看出，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株WXB10 的半纖維素酶、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性均呈先增長(zhǎng)后降低的變化趨勢(shì)。發(fā)酵5 d 時(shí)，半纖維素酶活性最高，為32.17 U·mL-1，之后開始下降并趨于穩(wěn)定。發(fā)酵3 d 時(shí)，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性達(dá)到最高，為238.75 U·mL-1。外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性均在發(fā)酵4 d 時(shí)達(dá)到最大值，分別為478.48 U·mL-1和4.82 U·mL-1。

圖3 菌株WXB10 的半纖維素及纖維素酶活性變化

2.4 菌株WXB10 的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察與生理生化特性測(cè)定 菌株WXB10 的形態(tài)特征見圖4，在LB 固體培養(yǎng)基上，單菌落乳白色，表面干燥粗糙，有褶皺，不透明，邊緣不規(guī)則。

圖4 菌株WXB10 的形態(tài)特征

生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），菌株WXB10為革蘭氏陽性菌，可以利用葡萄糖、甘露醇、果糖作為其唯一碳源，硝酸銨、硫酸銨、組氨酸作為其唯一氮源，能水解淀粉和脂肪，利用丙二酸鹽，產(chǎn)生過氧化氫酶，不產(chǎn)生氧化酶，甲基紅指示劑呈黃色，為陰性。表明，該菌株代謝糖產(chǎn)酸少，或產(chǎn)的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。

表2 菌株WXB10 生理生化特性測(cè)定結(jié)果

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定 利用試劑盒提取菌株WXB10 的基因組DNA，先采用通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在1 500 bp 和1 465 bp 處有明顯條帶（圖5）。將PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果利用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Blast 程序比對(duì)，結(jié)果表明菌株WXB10 與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）（MG461457）的同源性達(dá)到99.72%，與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）（KF993663）的同源性為97.37%，與暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）（KY129717）的同源性達(dá)到99.80%。

使用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，分別在949 bp 和1 041 bp處出現(xiàn)條帶（圖5）。將4 個(gè)PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果拼接，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Blast 程序比對(duì)，菌株WXB10 與貝萊斯芽孢桿菌的同源性達(dá)到99.93%，與地衣芽孢桿菌的同源性為98.92%；利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株WXB10 與貝萊斯芽孢桿菌聚在一類，登錄號(hào)分別為MG461457、MF471767 和MT114571（圖6）。綜合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，馬鈴薯秸稈降解菌WXB10 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖5 菌株WXB10 的16S rDNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

圖6 菌株WXB10 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

2.4.3 生物學(xué)特性 由圖7 可見，菌株WXB10 生長(zhǎng)的適宜溫度為25～35 ℃，最適pH 值為7。

圖7 不同溫度及pH 值對(duì)菌株WXB10 生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

農(nóng)作物秸稈被認(rèn)為是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源之一（Phurt et al.，2020），但我國2019年用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資源化、減量化和循環(huán)化的秸稈僅占總量的30%（單德鑫 等，2019）。馬鈴薯秸稈攜帶大量病原菌越冬，導(dǎo)致病害加重，因此秸稈的快速降解在病害控制和土壤改良等方面具有重要意義。篩選馬鈴薯秸稈高效降解菌，研發(fā)秸稈微生物降解技術(shù)，是一種將養(yǎng)分歸還土壤的簡(jiǎn)便、節(jié)本增效的舉措，秸稈在土壤微生物的作用下被分解轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)，提高土壤有機(jī)碳含量，具有降解效率高、能耗低、安全無污染且合理利用秸稈資源等特點(diǎn)。

本試驗(yàn)從馬鈴薯田間土壤中分離秸稈降解菌，利用剛果紅染色法初篩獲得菌株WXB10，具有纖維素降解能力，其透明圈直徑與菌落直徑的比值為5.53。秸稈液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株WXB10 在發(fā)酵5 d 后秸稈降解速率明顯加快，可能與3～5 d 半纖維素酶、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性均達(dá)到最大值有關(guān)；發(fā)酵25 d 以后降解速率下降，可能是營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累，酶活性下降，產(chǎn)物抑制等原因?qū)е碌?；發(fā)酵35 d 時(shí)馬鈴薯秸稈降解率達(dá)到57.73%，秸稈剩余量為0.85 g。表明，菌株WXB10 具有很好的應(yīng)用前景。

與本試驗(yàn)結(jié)果相似，孫玲等（2019）從腐爛秸稈及其附近土壤中分離得到黃桿菌屬CMC-I（Flavobacterium banpakuense）和馬賽菌CMC-red（Massilia arvi），室溫條件下液態(tài)發(fā)酵10 d 后玉米秸稈的降解率分別為21.06%和24.14%。陳露露（2019）從常年覆蓋秸稈的土壤中分離得到具有高效降解玉米秸稈的煙曲霉菌Z-3（Aspergillus fumigatus），對(duì)玉米秸稈靜態(tài)發(fā)酵30 d 后秸稈失重率達(dá)26.76%。劉曉飛等（2020）分離得到1 株能夠降解纖維素的鏈霉菌菌株GS-4-21（Streptomyces），28 ℃發(fā)酵5 d 后玉米秸稈降解率達(dá)到23.54%。以上研究結(jié)果表明，不同作物秸稈的纖維素含量不同，菌株的降解能力有所差異。

本試驗(yàn)中，菌株WXB10 的半纖維素酶、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性最高分別為32.17、238.75、478.48 U·mL-1和4.82 U·mL-1。劉曉飛等（2020）從寒地黑土中分離得到的鏈霉菌菌株GS-4-21 的外切-β-1，4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性最高分別為12.07、32.94 U·mL-1和30.87 U·mL-1。顧文杰等（2012）從水稻田的土壤及牛場(chǎng)牛糞中篩選出2 株酶活力較高的菌株，其內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性最高分別為14.00 U·mL-1和18.80 U·mL-1，β-葡萄糖苷酶活性最高分別為6.23 U·mL-1和6.53 U·mL-1。張爽（2018）從土壤中篩選出19 株玉米秸稈降解菌，其中菌株ZS-7 的β-葡萄糖苷酶活性最高為38.704 U·mL-1；菌株ZS-8 的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性最高為31.111 U·mL-1。魏如騰（2016）構(gòu)建高效玉米秸稈降解菌系時(shí)發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性最高為149.38、118.95 U·mL-1和133.97 U·mL-1。本試驗(yàn)篩選出的菌株WXB10 內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶和外切-β-1，4-葡聚糖酶活性均高于以上研究，可能是由于本試驗(yàn)采用以馬鈴薯秸稈為唯一碳源進(jìn)行復(fù)篩，淘汰低降解能力的菌株，得到降解效果穩(wěn)定具有較高秸稈降解能力的菌株，具有一定的實(shí)際意義；但β-葡萄糖苷酶活性均低于以上研究，可能是由于β-葡萄糖苷酶的最適pH 偏酸性，而本試驗(yàn)篩選得到的菌株WXB10 的最適pH 偏中性。

目前研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對(duì)秸稈有一定的降解效果，如巨大芽胞桿菌（B.cereus）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和枯草芽孢桿菌（B.subtillis）（龔昆，2020）。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測(cè)定和分子生物學(xué)鑒定，菌株WXB10 被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis），該菌株在溫度為10～40℃、pH 值為4～9 范圍內(nèi)均能正常生長(zhǎng)。有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌在其他領(lǐng)域應(yīng)用也較為廣泛，例如對(duì)黃瓜霜霉?。≒seudoperonospora cubensis）具有較好的保護(hù)作用和一定的治療作用，且持效期較長(zhǎng)（肖倩 等，2021）。李苗苗等（2020）通過對(duì)峙試驗(yàn)證明貝萊斯芽孢桿菌GY1 對(duì)棉花立枯病（Rhizoctonia solani）和番茄晚疫?。≒hytophthora infestanse）等多種真菌病原菌都有抑制作用。Liu等（2019）通過對(duì)貝萊斯芽孢桿菌HC6 代謝產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的3種脂肽對(duì)曲霉屬（Aspergillussp.）、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）和李斯特菌屬（Listeriasp.）等多類植物病原菌有抑制作用。本試驗(yàn)初步研究了菌株WXB10 對(duì)馬鈴薯秸稈的降解作用，在應(yīng)用條件、生防效果及菌劑制備等方面還需進(jìn)一步研究。