KASP 分子標記輔助選育甜椒核雄性不育兩用系

范妍芹 嚴立斌 孟雅寧 張紅肖

（河北省農林科學院經(jīng)濟作物研究所，河北石家莊 050051）

甜椒（Capsicum annuumvar.grossum）是辣椒的一個變種，是我國栽培面積較大的主要蔬菜種類之一，其雜種優(yōu)勢顯著。利用甜椒雄性不育系培育雜交種，可大大降低雜交制種難度和成本，是目前甜椒雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一，也是倍受國內外蔬菜育種學家重視的方法（Peterson，1958；Shifriss，1979；范妍芹和郭景印，1993；唐冬英 等，2001；張寶璽 等，2001）。

核雄性不育（GMS）兩用系遺傳簡單，不育性穩(wěn)定，一系兩用既是不育系又是保持系，同時育成，從而簡化育種程序和繁殖保存程序，且恢復源廣泛，一般自交系都是恢復系，克服了甜椒“三系”恢復源缺乏、選育雜交種難度大的問題，易選育出優(yōu)良恢復系，可較快地培育出雜種優(yōu)勢顯著的雜交種（范妍芹和郭景印，1993；唐冬英 等，2001；張寶璽 等，2001；范妍芹 等，2002；鄒學校和何青，2004；周永堅 等，2007；于海龍 等，2021）。河北省農林科學院經(jīng)濟作物研究所利用自己發(fā)現(xiàn)的甜椒雄性不育源育成甜椒核雄性不育兩用系AB91，目前利用AB91 已育成通過國家級、省級審（鑒）定的冀研系列甜椒、辣椒雜交種16 個，大面積應用于生產，解決了甜椒一代雜種生產中人工去雄的難題（范妍芹 等，1999，2004a，2009；范妍芹和嚴立斌，2013；嚴立斌 等，2016）。

甜椒核雄性不育兩用系的轉育，一般選擇不育株與優(yōu)良自交系雜交，F(xiàn)2的育性開始分離，其群體不育株（msms）占25%，可育株（有兩種基因型MSMS 和MSms）占75%。只有選擇雜合基因型MSms 的可育株與不育株雜交，可產生后代育性發(fā)生分離且不育株與可育株分離比例符合1∶1 的群體，才有可能選育出新的甜椒核雄性不育兩用系。因F2從表型性狀無法鑒別可育株中的MSms、MSMS 兩種基因型，無法選擇出雜合基因型MSms可育株與不育株msms 雜交轉育，只能采用表現(xiàn)可育的單株測交，需要配制大量的測交組合，下一年種植鑒定，開花期鑒定后淘汰表現(xiàn)全可育的測交組合，留下育性分離比符合1∶1 的測交組合，即雜合基因型可育株與不育株雜交組合再進行姊妹交，選育新的甜椒核雄性不育兩用系（范妍芹等，2004b）。這樣就需要配制大量的測交組合，第2 年再種植鑒定、淘汰，因此在F2和F3階段大大增加了測交組合配制和鑒定數(shù)量，耗費大量人力、物力和財力。且甜椒核雄性不育兩用系的不育株和可育株各占50%，在雜交制種前的初花期，根據(jù)花器官標記性狀，需鑒別、拔除50%的可育株。因此，兩用系母本的播種和定植數(shù)量增加1 倍，也增加了拔除可育株的工作量（范妍芹等，2004b）。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，分子標記輔助選擇成為育種的重要手段，近年發(fā)展起來的競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）新型基因分型技術，通過引物末端堿基的特異匹配對SNP 以及InDel 位點進行精準的雙等位基因分型。因其批量化、自動化、標準化的特點，特別適用于大量群體的高通量檢測，成為國際上主流的分子標記檢測方法之一（Semagn et al.，2014）。目前KASP 標記已在小麥（Wu et al.，2018；單子龍等，2020）、水稻（Steele et al.，2018；韋宇等，2019）、大豆（Shi et al.，2015）、大白菜（楊雙娟等，2018）、黃瓜（Wen et al.，2015）等作物中應用，在構建遺傳圖譜、基因定位、種質資源分析等方面發(fā)揮了重要作用。但在甜椒核雄性不育方面應用報道極少。

前人通過全基因組重測序技術，對辣椒核雄性不育基因ms1（Jeong et al.，2018）、msc-1（Cheng et al.，2019）、msc-2（Cheng et al.，2020；Meng et al.，2021）進行了精細定位，初步確定了導致核不育的候選基因。本試驗根據(jù)本所甜椒課題組已獲得并公布的甜椒AB91 核雄性不育其中一個候選基因Capana05g000747（Meng et al.，2021）的突變位點設計KASP 分子標記，運用于甜椒核雄性不育兩用系雜交育種早期對育性的分子標記輔助選擇，以期減少大量的繁瑣工作，節(jié)省人力、物力、財力，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜椒核雄性不育兩用系AB91，自交系HTJ412、HLD163 均由本所甜椒課題組提供。兩用系AB91 的雄性不育性由1 對隱性核基因msms（不育基因為msc-2）控制且穩(wěn)定遺傳，其群體可育株與不育株各占50%，不育株率穩(wěn)定在50%左右。HTJ412 果實燈籠形，成熟果黃色，味甜質脆；HLD163 果實燈籠形，成熟果紅色，味甜質脆。

1.2 試驗方法

1.2.1 核雄性不育兩用系轉育群體構建 試驗在本所試驗基地進行，2018 年以甜椒核雄性不育兩用系AB91 群體內的不育株為不育源，其雄性不育性由1 對隱性核基因msms 控制，作母本；以具有顯性可育基因MSMS 的自交系HTJ412、HLD163 為轉育對象，作父本，雜交后獲得AB91×HTJ412和AB91×HLD163 2 個雜交組合；2019 年1 月在日光溫室內穴盤育苗，3 月在塑料大棚內分別種植2 個雜交組合，F(xiàn)1表現(xiàn)全可育，可育株基因型為MSms，分別自交留種，得到F2群體；2019 年7 月將2 個F2群體分別播種在育苗穴盤中，幼苗長至4～5 葉期，分別編號取嫩葉，采用成都福際生物技術有限公司的DNA 提取試劑盒提取DNA，使用Nanodrop 測定樣品DNA 濃度，確保DNA 質量濃度在20 ng·μL-1以上，放入-40 ℃冰箱保存。

1.2.2 核雄性不育兩用系轉育F2育性基因分型方法 引物設計。根據(jù)本所甜椒課題組已獲得并公布的AB91 核雄性不育候選基因Capana05g000747（參考基因組見http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/download.jsp）的突變位點設計KASP 引物，該基因序列全長1 350 bp，突變位點位于937 bp 處。正向引物1：5′-GAAGGTCGGAGTCAAC GGATTTTTTTTCTGCTCATGTCTGTCAGT-3′，正向引物2：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TTTTCTGCTCATGTCTGTCAGG-3′，反向引物：5′-GCCTTACTTCACTAACAGAGCGG-3′，均由華大基因科技有限公司合成。

PCR反應體系（10 μL）：2×TaqParms PCR Mix 5 μL，DNA 提取液1 μL，正向引物1（10 μmol·L-1）0.15 μL，正向引物2（10 μmol·L-1）0.15 μL，反向引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，加ddH2O補至10 μL。陰性對照以等量ddH2O 代替DNA 提取液。設置3 次生物學重復和3 次技術重復。

PCR 反應程序：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，65℃ 1 min，10 個循環(huán)，每循環(huán)下降0.8 ℃；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，28 個循環(huán)；57 ℃ 1 min。

KASP 反應使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 進行，并采用終點法進行熒光信號掃描，以ROX 熒光作為內參熒光，使用7500 Software v2.0.6 軟件計算各樣品的ΔRn 值用于數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 隱性核不育基因雄性不育性的轉育方法 利用根據(jù)AB91 不育候選基因Capana05g000747設計的KASP 分子標記，對AB91×HTJ412 和AB91 ×HLD163 的F2群體植株進行基因型檢測，在苗期淘汰純合基因型可育株（MSMS），保留不育株（msms）和雜合基因型可育株（MSms），并將其分別定植在網(wǎng)紗棚內，開花期對植株的育性進行田間性狀鑒定，淘汰與KASP 基因型檢測結果不一致的植株，分別選擇與KASP 基因型檢測結果一致的不育株與可育株成對測交，從不育株上收獲測交組合種子，分別編號留種。2020 年春季在網(wǎng)紗棚內分別種植不同測交組合（F3），開花期進行育性鑒定調查，若全部測交組合的可育株與不育株分離比例符合1∶1，則在F3及后代中只要選擇群體內的不育株與可育株姊妹交，就能保持后代育性分離比例符合1∶1，選育出新的雄性不育兩用系。

1.2.4 F2KASP 基因分型結果準確性的鑒定方法 根據(jù)KASP 分子標記對轉育的AB91×HTJ412和AB91×HLD163 2 個雄性不育系F2植株基因分型結果，將保留的進行不育系轉育的不育株（msms）和雜合基因型可育株（MSms）種植在網(wǎng)紗棚內供開花期進行田間育性鑒定，并將雜合基因型可育株分別自交單株留種，供F3進行育性鑒定。將根據(jù)KASP 基因分型檢測結果淘汰的純合基因型可育株（MSMS）種植在另一網(wǎng)紗棚內，開花期進行田間育性鑒定，并分別單株自交留種，供F3進行育性鑒定。將所有可育株自交種分別單株種植，根據(jù)其F3株系群體內育性分離結果，推斷出F2可育株的基因型。F3株系群體內育性發(fā)生分離的可育株其F2為雜合型可育株（MSms），F(xiàn)3株系群體內表現(xiàn)全可育的可育株其F2為純合基因型可育株（MSMS）。通過田間育性鑒定調查結果與KASP基因分型結果對比，計算KASP 基因分型準確率。

1.2.5 核雄性不育兩用系育性基因分型檢測方法 2021 年秋季將育成的甜椒核雄性不育兩用系分別播種在育苗穴盤中，幼苗4～5 葉期分別單株編號取嫩葉，采用成都福際生物技術有限公司的DNA 提取試劑盒提取DNA，使用Nanodrop 測定樣品DNA 濃度，確保DNA 質量濃度在20 ng·μL-1以上，放入-40 ℃冰箱保存。

按照1.2.2 的方法進行基因分型檢測。

2 結果與分析

2.1 核雄性不育兩用系轉育F2 育性基因分型結果

利用根據(jù)AB91 不育候選基因Capana05g000747設計的KASP 分子標記，對AB91×HTJ412 和AB91×HLD163 的F2群體植株進行基因型檢測。結果顯示：該分子標記與甜椒核雄性不育的育性呈現(xiàn)共分離，群體植株的育性基因型可以清楚地分為3 類（圖1）。靠近縱坐標位置的信號點藍色三角表示僅檢測到FAM 熒光信號，為不育株（msms）；靠近橫坐標位置的信號點紅色三角表示僅檢測到HEX 信號，為純合基因型可育植株（MSMS）；中間位置信號點綠色正方形表示同時檢測到FAM 和HEX 信號，為雜合基因型可育植株（MSms），可以有效地區(qū)分甜椒核雄性不育兩用系轉育F2植株的育性基因型。AB91×HTJ412 F2群體內的92 株單株中，有雜合基因型可育株43 株，純合基因型可育株25 株，不育株24 株（圖1-A）；AB91 ×HLD163 F2群體內的104 株單株中，有雜合基因型可育株47 株，純合基因型可育株27 株，不育株30 株（圖1-B）。

圖1 核雄性不育兩用系轉育F2 KASP 基因分型結果

2.2 AB91 隱性核不育基因雄性不育性的轉育

根據(jù)KASP 分子標記對轉育的2 個雄性不育系F2植株基因型檢測結果，在苗期淘汰純合基因型可育株（MSMS），保留不育株（msms）和雜合基因型可育株（MSms）。開花期對保留的不育株和可育株的育性進行田間性狀鑒定，只有1 株雜合基因型可育株表現(xiàn)不育，與KASP 基因型檢測結果不一致，淘汰。分別選擇符合育種目標性狀的不育株與可育株成對測交，從不育株上收獲測交組合種子，2020 年春季種植后發(fā)現(xiàn)全部測交組合的育性均表現(xiàn)分離，可育株與不育株分離比例符合1∶1，沒有出現(xiàn)全可育的測交組合，表明選留的可育株均為雜合基因型（MSms），KASP 分子標記檢測結果準確。F3不需要淘汰全可育測交組合，在F3及后代中只要選擇群體內的不育株與可育株姊妹交，就能保持后代育性1∶1 的分離比例，不需要對雄性不育性進行選育，主要根據(jù)農藝性狀優(yōu)劣選擇淘汰測交組合。轉育的AB91× HTJ412 和AB91×HLD163 2 個雄性不育系，主要育種目標是選育黃色和紅色彩色甜椒雄性不育系。因此，本試驗重點對果實的顏色等主要農藝性狀進行篩選，選擇符合育種目標性狀的不育株與可育株成對姊妹交3 代（2020 年春、秋季，2021 年春季），選育出了雄性不育性穩(wěn)定，不育株率穩(wěn)定在50%左右，符合育種目標性狀的黃色甜椒核雄性不育兩用系AB91-HTJ412（果實燈籠形，成熟果黃色，味甜質脆）和紅色甜椒核雄性不育兩用系AB91-HLD163（果實燈籠形，成熟果紅色，味甜質脆），可作為選育彩色椒的雄性不育系。

2.3 F2 KASP 基因分型結果的準確性鑒定

F2KASP 基因分型結果及田間育性調查結果見表1。AB91×HTJ412 雄性不育系轉育的F2中，KASP 基因分型結果中不育株24 株、雜合基因型可育株43 株與田間育性調查結果一致，只有純合基因型可育株25 株中，有1 株田間育性發(fā)生分離，與KASP 基因分型結果不一致，KASP 基因分型準確率為98.91%；AB91×HLD163 雄性不育系轉育的F2中，KASP 基因分型結果中不育株30株、純合基因型可育株27 株與田間育性調查結果一致，只有雜合基因型可育株47 株中，有1 株田間育性表現(xiàn)為不育，與KASP 基因分型結果不一致，KASP 基因分型準確率為99.04%。這2 個群體KASP 基因分型準確率平均值為98.98%，表明KASP 基因分型有較高的準確性、可靠性。

表1 核雄性不育兩用系轉育F2 KASP 基因分型與田間育性調查結果

2.4 核雄性不育兩用系基因分型結果

對育成的黃色和紅色甜椒核雄性不育兩用系AB91-HTJ412 和AB91-HLD163 的群體進行育性基因型檢測，結果顯示：該分子標記與甜椒核雄性不育的育性呈現(xiàn)共分離，AB91-HTJ412、AB91-HLD163 兩用系的育性基因型可以清楚地分為兩類（圖2）。靠近縱坐標位置的信號點藍色三角表示僅檢測到FAM 熒光信號，為不育株（msms），靠近橫坐標位置的信號點綠色正方形表示同時檢測到FAM 和HEX 信號，為雜合基因型可育植株（MSms），可以有效地區(qū)分甜椒核雄性不育兩用系植株的育性基因型。AB91-HTJ412 兩用系群體的83 株單株中，有41 株不育株，42 株雜合基因型可育株（圖2-A）；AB91-HLD163 兩用系群體的78株單株中，有40 株不育株，38 株雜合基因型可育株（圖2-B）。

圖2 核雄性不育兩用系KASP 基因分型結果

根據(jù)KASP 分子標記基因分型結果，在苗期淘汰可育株（MSms），將AB91-HTJ412 保留的41 株不育株和AB91-HLD163 保留的40 株不育株分別定植在網(wǎng)紗棚內，開花期對植株的育性進行田間鑒定，均表現(xiàn)不育，與KASP 基因分型結果一致，定植的不育株可直接用于雜交組合選配及雜交制種。

3 討論與結論

辣椒雄性不育相關基因基礎研究相對于水稻、番茄等作物相對滯后，辣椒基因組信息公布較晚且遺傳群體多態(tài)性低也限制了標記的開發(fā)進程，導致實用標記不足，分子標記輔助育種技術在辣椒雄性不育領域的應用也相對較少（程翔 等，2020）。在辣椒核雄性不育分子標記研究方面，國內外都有一些報道，主要開發(fā)出了與辣椒核不育相關的AFLP標 記（Lee et al.，2012）、SCAR 標 記（Menisha et al.，2021）、CAPS 標 記（Jo et al.，2016）、SSR標 記（Aulakh et al.，2016）、InDel 標 記（Cheng et al.，2019），在當前開發(fā)的標記中SSR 和InDel標記較多（程翔 等，2020），這些標記的開發(fā)為分子標記輔助育種奠定了基礎。但在甜椒核雄性不育分子標記研究方面報道較少，Bartoszewski 等（2012）通過RAPD-BSA 技術，鑒定了7 個與ms8位點相關的標記，將ms8定位在4 號染色體上，并開發(fā)了與ms8基因連鎖的2 個標記SCAR-P2 和RAPD Z05-760，遺傳距離分別為34.5 cM 和4.6 cM，鑒定出的標記可用于分子輔助育種，但目前仍缺乏與ms8位點緊密相關的標記。嚴慧玲等（2011）以甜椒核雄性不育兩用系AB91 為材料，篩選了225 對SRAP 引物組合及1 393 對EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ引物組合，確定了標記E37M39（200 bp，與育性基因的遺傳距離為6 cM）和E44M93（500 bp，與育性基因的遺傳距離為12 cM）。孟雅寧等（2019）運用BSA 法與全基因組重測序技術，以甜椒核雄性不育兩用系AB91 為材料，開發(fā)了2個SSR 標記H12、H24，與不育基因msms的連鎖距離分別為0.29、0.00 cM。

為了進一步提高核雄性不育兩用系育種效率，減少大量的繁瑣工作，降低育種成本，利用本所甜椒課題組已獲得并公布的甜椒AB91 核雄性不育候選基因Capana05g000747（Meng et al.，2021）的突變位點設計KASP 分子標記，該分子標記與甜椒核雄性不育的育性呈現(xiàn)共分離，可準確鑒別不育株基因型、可育株的純合基因型和雜合基因型，其基因分型準確率平均為98.98%。該KASP 分子標記已成功地應用于甜椒核雄性不育系的轉育，在苗期對F2植株的育性基因型進行早期檢測鑒定，可有效淘汰基因型為MSMS 的可育株，篩選出基因型為MSms 的可育株，直接用于不育系的轉育，可減少人力、物力、財力投入。該標記也可應用于兩用系的雜交組合選配及雜交制種，在苗期對兩用系群體的育性基因型進行早期鑒別，可有效淘汰50%可育株（MSms），選留的50%不育株（msms）直接用于雜交組合選配及雜交制種，可減少50%定植數(shù)量，省去花期鑒定、拔除50%可育株的工作。

KASP 分子標記具有便于批量化、自動化、標準化的檢測特點，適用于大量群體的高通量檢測，將其成功運用于甜椒核雄性不育兩用系雜交育種早期對育性進行分子標記輔助選擇，可減少大量的繁瑣工作，節(jié)省人力物力財力，降低育種成本，簡化轉育程序，提高育種效率，加快育種進程。