分子標(biāo)記技術(shù)在花椰菜品種鑒定上的應(yīng)用研究進(jìn)展

宋曉玉 甘德芳 楊 琳 宋順華 孟淑春*

〔1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽合肥 230036；2 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081〕

隨著我國(guó)蔬菜種子產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，越來(lái)越多的新品種涌入市場(chǎng)，同時(shí)也出現(xiàn)了種子摻假銷(xiāo)售、品種混雜以及同名異物、同物異名等現(xiàn)象。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，假種子在生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)量低、長(zhǎng)勢(shì)弱、產(chǎn)品品質(zhì)下降等問(wèn)題，使蔬菜產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低，種子市場(chǎng)紊亂，嚴(yán)重影響了蔬菜種子的生產(chǎn)、銷(xiāo)售和種業(yè)發(fā)展。因此，進(jìn)行品種鑒定，打擊假冒偽劣種子，是保障種子質(zhì)量，減少農(nóng)戶經(jīng)濟(jì)損失以及維護(hù)種子市場(chǎng)秩序的重要舉措。

花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.）屬于十字花科蕓薹屬，由歐洲野生甘藍(lán)演變而來(lái)（王冬梅，2011），起源于地中海沿岸，在我國(guó)各地均有種植，是重要的蔬菜作物之一。當(dāng)前，我國(guó)已成為花椰菜種植面積最大的國(guó)家（單曉政等，2019），其中栽培面積較大的有山東、河南、甘肅、福建、廣東、浙江、上海、天津等地（朱煥煥，2019）?；ㄒ送庑蚊烙^、風(fēng)味鮮美，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其富含的鉀元素可有效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生（丁云花 等，2016）?；ㄒ诉€含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、VC、多酚、類黃酮、萊菔硫烷等，丁燕等（2021）和陳敏氡等（2022）研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期食用花椰菜可以降低癌癥發(fā)生的機(jī)率?；ㄒ似贩N主要以一代雜種的形式存在，具有生活力高、適應(yīng)性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，但不可避免也會(huì)伴隨雜交種不純的現(xiàn)象產(chǎn)生。從種子生產(chǎn)過(guò)程來(lái)看，花椰菜雜交種的生產(chǎn)多是通過(guò)自交不親和系來(lái)繁育（趙振卿 等，2016），在繁育、采收以及加工過(guò)程可能混入其他基因型的種子而造成種子混雜，影響雜交種種子的純度（王夢(mèng)夢(mèng) 等，2022），進(jìn)而造成生產(chǎn)損失。不僅如此，由于種子市場(chǎng)存在套牌、假冒的情況，品種侵權(quán)問(wèn)題比較突出，對(duì)正規(guī)種子企業(yè)的切身利益產(chǎn)生負(fù)面影響，同時(shí)也給農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)無(wú)法估量的損失，因此開(kāi)展花椰菜品種鑒定迫在眉睫。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別方法雖然存在一定的局限性，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，易受外界環(huán)境因素影響，但是該方法相對(duì)簡(jiǎn)易、直觀，在品種鑒定中仍然被廣泛采用且發(fā)揮重要作用（林琿 等，2012）。生化標(biāo)記鑒定技術(shù)受環(huán)境因子影響小，已廣泛應(yīng)用于玉米、水稻、麥類等糧食作物，且對(duì)多種蔬菜作物亦成功進(jìn)行了品種鑒定，如辣椒、豌豆、番茄、大白菜、茄子等（周金蒙，2015），但利用生化標(biāo)記技術(shù)對(duì)花椰菜進(jìn)行品種鑒定的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。生化標(biāo)記雖能克服傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒別方法的缺點(diǎn)，但是多態(tài)性較低、穩(wěn)定性較差，且不適合親緣關(guān)系近的品種鑒定（孫秀霞 等，2017），因此無(wú)法滿足種質(zhì)資源鑒定和育種工作發(fā)展的需要。隨著DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的迅猛發(fā)展，根據(jù)物種之間遺傳物質(zhì)DNA 的差異進(jìn)行品種鑒定成為可能，并且取得顯著成效。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)逐步克服了傳統(tǒng)品種鑒定方法的不足，且不受環(huán)境因素和生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響，具有高效、快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，已在糧食作物、果樹(shù)、蔬菜、花卉等作物的品種鑒定中廣泛應(yīng)用。本文對(duì)常用的分子標(biāo)記技術(shù)主要包括RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、RAPD（random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、SSR（simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列）、ISSR（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性）、SNP（single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）等，以及新發(fā)展起來(lái)的InDel（insertion-deletion length polymorphism，插入缺失長(zhǎng)度多態(tài)性）和DNA 條形碼（DNA barcoding）在品種鑒定方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為花椰菜品種鑒定技術(shù)的選擇提供參考依據(jù)。

1 常用分子標(biāo)記技術(shù)比較

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)主要分為三大類，第一類是以Southern 雜交為核心技術(shù)的分子標(biāo)記，其中以RFLP 為代表；第二類是以PCR 擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記，常見(jiàn)的有RAPD、AFLP、ISSR、SSR 等；第三類主要是基于高通量測(cè)序和DNA 芯片技術(shù)的分子標(biāo)記，包括SNP 等。不同類型的分子標(biāo)記各有優(yōu)勢(shì)和不足（表1），RFLP、RAPD、AFLP 豐富度高，但是多態(tài)性表現(xiàn)為中等；SSR、SNP 多態(tài)性水平高；RFLP、AFLP、SSR、SNP 重復(fù)性好，其中RFLP、AFLP、SNP 對(duì)DNA 質(zhì)量要求高；RFLP、SSR、SNP 為共顯性標(biāo)記，且輔助選擇效率較好；RFLP、SNP 對(duì)技術(shù)要求高，故成本也高。

表1 常用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)比較

隨著DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的普及應(yīng)用，RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SNP 等技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到蔬菜、果樹(shù)、糧食作物、藥用植物以及園林植物的品種鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、基因定位等研究中。其中，SSR 和SNP 技術(shù)在農(nóng)作物品種鑒定中的應(yīng)用最為廣泛，RFLP、AFLP、ISSR 以及DNA 條形碼技術(shù)在藥用植物鑒定中較常見(jiàn)。在過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，RAPD 技術(shù)在十字花科作物研究中的應(yīng)用最多，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，ISSR、SSR、SNP 等技術(shù)已經(jīng)替代了RAPD 技術(shù)，廣泛應(yīng)用于十字花科蔬菜的品種鑒定、DNA 指紋圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系與遺傳多樣性分析、基因定位等領(lǐng)域。

2 國(guó)內(nèi)外花椰菜品種鑒定技術(shù)

2.1 RFLP 技術(shù)

RFLP 是以Southern 雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，將DNA 樣品的酶切片段與特異性探針雜交結(jié)合，根據(jù)DNA 探針的不同呈現(xiàn)出多態(tài)性從而達(dá)到品種鑒定的目的。RFLP 是最早開(kāi)發(fā)的一款分子標(biāo)記鑒定技術(shù)（Grover &Sharma，2016），已在玉米、小麥、辣椒、番茄等作物上成功應(yīng)用（朱小濤，2018）。但由于其操作技術(shù)難度大、成本高，對(duì)DNA 多態(tài)性檢出的靈敏度較低，且在試驗(yàn)過(guò)程中需要使用放射性同位素及核酸雜交技術(shù)，既不安全又不利于自動(dòng)化，導(dǎo)致應(yīng)用受到限制，在花椰菜品種鑒定方面應(yīng)用較少。

2.2 RAPD 技術(shù)

RAPD 是以PCR 擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)，基因組DNA 為模板，人工合成的單鏈引物為原料，使DNA 鏈擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。眾多學(xué)者利用RAPD 技術(shù)對(duì)甘藍(lán)、辣椒、番茄、花椰菜、南瓜等蔬菜作物進(jìn)行了品種鑒定研究，獲得了理想的試驗(yàn)結(jié)果（劉子記等，2013）。RAPD 技術(shù)操作簡(jiǎn)單、DNA 用量少、檢測(cè)速度快、成本低，已在花椰菜親緣關(guān)系研究、遺傳距離判斷以及品種鑒定等領(lǐng)域普遍應(yīng)用。Astarini 等（2004）利用RAPD 技術(shù)對(duì)25 個(gè)花椰菜栽培品種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，其中18 個(gè)樣本屬于不同品種，另外7 個(gè)樣本中的Donner 和SPS3074 屬于同一品種，認(rèn)為RAPD 技術(shù)可有效區(qū)分同物異名現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，Astarini 等（2006）利用4 個(gè)RAPD 引物成功區(qū)分了6 個(gè)花椰菜品種，再次證實(shí)了RAPD 技術(shù)可有效區(qū)分花椰菜種質(zhì)。遺傳多樣性研究對(duì)花椰菜種質(zhì)資源的收集、保存和利用具有重要意義。林琿（2007）和陳陽(yáng)（2010）先后對(duì)花椰菜品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，進(jìn)一步證明了RAPD 技術(shù)對(duì)于花椰菜遺傳多樣性研究的可行性。綜上所述，RAPD技術(shù)雖然適用于花椰菜種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析，但是由于其顯性遺傳的特性，不能識(shí)別雜合子，且存在共遷移問(wèn)題，只有不同長(zhǎng)度DNA 片段能夠被凝膠電泳區(qū)分，而無(wú)法分離那些分子量相同但堿基序列不同的DNA 片段（劉麗華，2010）。除此以外，RAPD 技術(shù)對(duì)于反應(yīng)條件極為敏感，試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性都較低，在選擇合適的花椰菜品種鑒定技術(shù)時(shí)，這些不利因素均需考慮在內(nèi)。

2.3 AFLP 技術(shù)

AFLP 是將RFLP 與PCR 技術(shù)相結(jié)合，兼具RFLP 和RAPD 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有較高的穩(wěn)定性，且通過(guò)少量高效的引物組合即可獲得覆蓋整個(gè)基因組的AFLP 標(biāo)記。AFLP 技術(shù)在進(jìn)行花椰菜品種鑒定時(shí)既保證了可靠性，又維持了靈敏性。Seyis 等（2003）利用3 對(duì)AFLP 引物組合對(duì)源自印度黃油菜與5 個(gè)花椰菜品種雜交產(chǎn)生的165 個(gè)RS 油菜品系進(jìn)行分析，共獲得467 條多態(tài)性條帶，表明RS系品種遺傳差異性較大，較容易被區(qū)分，該研究結(jié)果對(duì)花椰菜新品種選育和鑒定具有重大意義。古瑜等（2007）利用AFLP 和NBS profiling 技術(shù)鑒定花椰菜F2分離群體，成功構(gòu)建了第1 個(gè)花椰菜遺傳連鎖圖譜，表明AFLP 技術(shù)適用于花椰菜品種的遺傳多樣性分析。EI-Esawi 等（2016）利用AFLP 分子標(biāo)記對(duì)包括花椰菜在內(nèi)的25 份蕓薹屬材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，11 對(duì)引物共擴(kuò)增出471 個(gè)AFLP片段，其中423 個(gè)具有多態(tài)性，引物多態(tài)率高達(dá)90%，可以成功區(qū)分25 份參試材料。以上研究結(jié)果均表明，AFLP 技術(shù)不僅能對(duì)高代自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析鑒定，還能對(duì)不同品種雜交產(chǎn)生的品系和品種間的遺傳親緣關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，從而選擇親緣關(guān)系遠(yuǎn)、遺傳差異大的材料作為親本，通過(guò)雜種優(yōu)勢(shì)將優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到栽培種中，為新種質(zhì)創(chuàng)制提供選擇依據(jù)。作為一種高效的鑒定技術(shù)，AFLP 具有多態(tài)性較好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，已在花椰菜遺傳育種、遺傳多樣性分析中發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。但AFLP 技術(shù)對(duì)基因組DNA 純度、內(nèi)切酶的質(zhì)量和反應(yīng)條件要求高；用于遺傳作圖時(shí)，少數(shù)標(biāo)記與圖譜遺傳連鎖度存在偏差，使得該技術(shù)在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建方面的普及應(yīng)用受到限制。

2.4 SSR 技術(shù)

SSR 又名微衛(wèi)星DNA，通常存在于真核生物體中，是一類由1～6 個(gè)核苷酸組成的短串聯(lián)序列，由于SSR 中每個(gè)堿基的串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同以及重復(fù)單位數(shù)目的高度變異，故其具有豐富的多態(tài)性，有利于進(jìn)行快速品種鑒定（楊夢(mèng)婷等，2019）。在進(jìn)行花椰菜品種鑒定時(shí)，可以先根據(jù)SSR 側(cè)翼序列的高度保守性設(shè)計(jì)引物，再利用PCR 技術(shù)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，最后通過(guò)凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得含有目的條帶的電泳圖，并根據(jù)電泳圖上的條帶有無(wú)和數(shù)量多少來(lái)確定SSR 引物擴(kuò)增的結(jié)果（楊金雪，2014；趙雅楠等，2015）。SSR 標(biāo)記不僅能夠鑒定雜合體和純合體，而且結(jié)果可靠、方法簡(jiǎn)單、省時(shí)省力，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在花椰菜品種鑒定、分子標(biāo)記輔助育種、基因定位和遺傳多樣性分析等領(lǐng)域。Ram 等（2016）利用SSR 引物BoGMS1041 產(chǎn)生的特異性位點(diǎn)，成功將花椰菜品種Sel-26 和Suprimax Late 區(qū)分開(kāi)來(lái)。Pattanaik 等（2018）根據(jù)SSR 引物具有共顯性標(biāo)記的特點(diǎn)，篩選出共顯性SSR 標(biāo)記BrgMS565，成功鑒別出花椰菜雜交種中存在的親本株和異品種株。諸云霞等（2020）同樣利用SSR 標(biāo)記成功鑒定了109 個(gè)花椰菜品種。綜上所述，針對(duì)花椰菜品種鑒定，SSR 分子標(biāo)記是一項(xiàng)高效、穩(wěn)定的技術(shù)。Verma 等（2017）利用SSR 和RAPD 技術(shù)鑒定花椰菜種質(zhì)，成功區(qū)分開(kāi)早熟和中熟花椰菜品種，并且根據(jù)鑒定結(jié)果可以推測(cè)出最優(yōu)的花椰菜品種雜交組合，為花椰菜良種繁育提供了技術(shù)支持。SSR 技術(shù)不僅應(yīng)用于花椰菜品種鑒定和育種方面，在遺傳多樣性分析中亦有廣泛應(yīng)用。Rakshita 等（2021）以92 個(gè)花椰菜品種、2 個(gè)甘藍(lán)品種和2 個(gè)青花菜品種為試材，利用90 對(duì)多態(tài)性高的SSR 引物進(jìn)行遺傳多樣性分析，通過(guò)聚類分析對(duì)參試材料間的親緣關(guān)系進(jìn)行判斷，根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可以有效區(qū)分這96 份材料。劉春晴等（2018）和Zhu 等（2018）利用SSR技術(shù)對(duì)花椰菜材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，并進(jìn)行聚類分析，二者都證實(shí)了花椰菜遺傳多樣性與成熟度相關(guān)。由此可見(jiàn)，通過(guò)遺傳關(guān)系的分析，判斷不同花椰菜品種之間的遺傳距離，進(jìn)而評(píng)價(jià)品種之間的異質(zhì)性，是選擇優(yōu)勢(shì)品種的依據(jù)。

2.5 ISSR 技術(shù)

ISSR 是基于SSR 技術(shù)發(fā)展而來(lái)的一種新型標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)根據(jù)SSR 序列本身來(lái)設(shè)計(jì)引物，即在SSR 引物序列的一端插入2～4 個(gè)任意核苷酸，克服了SSR 標(biāo)記應(yīng)用時(shí)需要對(duì)研究材料進(jìn)行DNA 測(cè)序的不足。ISSR 標(biāo)記分布廣泛，進(jìn)化變異速度快，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，在花椰菜品種鑒定中已有少量應(yīng)用。馬二磊等（2010）利用1對(duì)ISSR引物NAUISR42區(qū)分開(kāi)了9個(gè)花椰菜品種，證實(shí)ISSR 標(biāo)記可用于花椰菜品種鑒定。在進(jìn)行花椰菜新品種選育研究中，陶興林（2017）成功篩選出與花椰菜溫敏雄性不育基因連鎖的ISSR 分子標(biāo)記，該研究成果加快了雜交花椰菜新品種選育的進(jìn)程。ISSR 技術(shù)不僅應(yīng)用于品種鑒定及新品種選育，在篩選抗病基因中同樣發(fā)揮重要作用。Saha 等（2014）利用RAPD、ISSR 和SSR 技術(shù)對(duì)花椰菜F2抗黑腐病群體和易感黑腐病群體進(jìn)行分析，成功篩選出抗性植株；此外，RAPD 技術(shù)與ISSR 技術(shù)結(jié)合可提高抗黑腐病花椰菜品種選擇的準(zhǔn)確性。Singh 等（2015）以高品質(zhì)易感霜霉病和低品質(zhì)抗霜霉病花椰菜的雜交品種為材料，利用6 個(gè)RAPD多態(tài)性標(biāo)記和7 個(gè)ISSR 多態(tài)性標(biāo)記成功定位花椰菜基因組中抗霜霉病基因Ppa3。雖然ISSR 技術(shù)已被證實(shí)可用于品種鑒定、抗病種質(zhì)篩選等研究中，但是由于其通常為顯性標(biāo)記，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分檢測(cè)位點(diǎn)的雜合與純合，因此未能在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。

2.6 SNP 技術(shù)

SNP 是指基因組中單個(gè)核苷酸的突變導(dǎo)致DNA 分子序列發(fā)生變化，從而具有多態(tài)性。SNP標(biāo)記是當(dāng)前用于檢測(cè)種內(nèi)個(gè)體間遺傳變異的分子單位最小的技術(shù)（李貝貝 等，2017），具有數(shù)量多、穩(wěn)定性好、分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)。SNP 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于基因分型、基因定位、高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域（Heet al.，2014；Yang et al.，2020）。趙振卿等（2019）找到一種與花椰菜花球毛花性狀連鎖的SNP 位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物并成功區(qū)分出不同花球性狀的花椰菜品種，該方法可在苗期對(duì)花椰菜材料進(jìn)行檢測(cè)，淘汰含有易毛花基因型的材料，大幅度減少花椰菜種植過(guò)程中的田間管理和表型鑒定的工作量。盛小光等（2020）開(kāi)發(fā)了一種用于鑒別浙農(nóng)松花80 天的SNP 引物，采用KASP 標(biāo)記技術(shù)，成功鑒定208 份花椰菜材料的純度，鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)檢測(cè)的結(jié)果完全一致，充分證明了該研究方法在花椰菜品種純度鑒定中的可靠性。Yousef 等（2018）開(kāi)發(fā)SNP 標(biāo)記用于191 份花椰菜材料的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明花椰菜品種的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與產(chǎn)地相關(guān)。

DNA 基因芯片技術(shù)是SNP 標(biāo)記的檢測(cè)方法之一?；蛐酒蟹植即罅康腄NA 探針，這些探針可與目標(biāo)DNA 產(chǎn)生特異性反應(yīng)，進(jìn)而篩選出眾多SNP 位點(diǎn)，具有快速性、高通量、自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)（王端瑩，2017）?；蛐酒夹g(shù)已經(jīng)在水稻、小麥、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄等作物中逐漸得到應(yīng)用（Bayer et al.，2017）。在蕓薹屬蔬菜作物中，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出油菜高密度Illumina Infinium（60 K）基因芯片，其中包含52 157 個(gè)SNP 位點(diǎn)，在油菜遺傳圖譜構(gòu)建、全基因組關(guān)聯(lián)分析和重要質(zhì)量性狀的QTL 定位等方面得到有效的應(yīng)用（周龍華和蔣立希，2016）。高通量檢測(cè)是基因芯片技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì)，即一次可以對(duì)多個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行規(guī)模性篩選，大大提高了檢測(cè)效率，并且有利于實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化，適用于快速、規(guī)模化篩查（蘇瑞 等，2019）。進(jìn)行SNP 檢測(cè)的方法有很多，其中最佳方法是基因芯片技術(shù)，但是需要進(jìn)行大量的生物信息學(xué)分析，然后設(shè)計(jì)引物、擴(kuò)增測(cè)序?；蛐酒O(shè)計(jì)成本高，技術(shù)難度大，測(cè)序復(fù)雜，故SNP 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用在花椰菜品種鑒定方面目前還處于初級(jí)階段，尚未得到普遍應(yīng)用。

2.7 InDel 技術(shù)

隨著新一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，針對(duì)已有參考序列的物種，對(duì)其進(jìn)行全基因組重測(cè)序，可發(fā)現(xiàn)大量插入缺失位點(diǎn)。InDel 是基于全基因組測(cè)序技術(shù)的第3 代分子標(biāo)記，指在近緣種或同種不同個(gè)體之間基因組的同一位點(diǎn)插入或者缺失不同大小的核酸片段（吳鑫燕 等，2021）。InDel 標(biāo)記在基因組中分布廣泛，開(kāi)發(fā)成本低，利用瓊脂糖凝膠電泳即可進(jìn)行試驗(yàn)操作。目前在水稻（Moonsap et al.，2019）、大豆（陳正杰 等，2021）、辣椒（Guo et al.，2019）、茄子（吉康娜 等，2019）等作物中均有研究，同時(shí)在大白菜（薛銀鴿 等，2014）、甘藍(lán)型油菜（倪西源 等，2020）、普通白菜（青梗菜）（王群 等，2021）、花椰菜（王夢(mèng)夢(mèng) 等，2022）等十字花科蔬菜作物中亦有應(yīng)用。王夢(mèng)夢(mèng)等（2022）基于花椰菜品種津品70 的兩個(gè)親本自交系的重測(cè)序，開(kāi)發(fā)InDel 標(biāo)記成功用于津品70 品種真實(shí)性鑒定以及純度鑒定；并構(gòu)建了16 個(gè)花椰菜雜交種的數(shù)字核酸指紋圖譜，為花椰菜種質(zhì)資源鑒定提供了重要的技術(shù)支持。吳鑫燕等（2021）依據(jù)BSA重測(cè)序?qū)ㄒ酥兴苫ㄐ誀钸M(jìn)行基因定位，開(kāi)發(fā)出2 個(gè)InDel 連鎖標(biāo)記，均能區(qū)分出F2分離群體中的極端松花類型和極端緊花類型，該研究為花椰菜雜交育種親本及組合的選配提供了參考依據(jù)。張小麗等（2022）利用InDel 標(biāo)記成功篩選出與白色花椰菜花球變紫性狀連鎖的InDel 標(biāo)記，該標(biāo)記在幼苗期即可進(jìn)行花球不變紫的花椰菜種質(zhì)資源篩選和鑒定。但是InDel 技術(shù)也存在自身的限制，由于一些非模式作物基因組測(cè)序尚未完成，導(dǎo)致開(kāi)發(fā)InDel標(biāo)記存在一些困難，使其應(yīng)用也受到一定影響（楊潔 等，2016）。

2.8 DNA 條形碼技術(shù)

DNA 條形碼是利用較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA 片段快速準(zhǔn)確的識(shí)別動(dòng)植物群體（Gogoi &Bhau，2018），且在種內(nèi)具有穩(wěn)定的保守性，在種間具有豐富的遺傳變異多樣性。已有大量研究表明該技術(shù)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、藥用植物、真菌等物種的鑒別（楊倩倩 等，2018）。DNA 條形碼技術(shù)發(fā)展至今已建立了較為完善的生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（barcode of life database system，BOLD），根據(jù)BOLD 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（http：//www.barcodinglife.org）報(bào)道，目前已經(jīng)收錄了包含動(dòng)物、植物、真菌在內(nèi)的9 971 821 條DNA條形碼。DNA條形碼作為一種新的鑒定技術(shù)，操作方便快捷，準(zhǔn)確性高，使用樣本量少，可用于大量品種的鑒別，在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定技術(shù)的不足，且不局限于物種形態(tài)特征和生長(zhǎng)發(fā)育階段，在沒(méi)有分類學(xué)的基礎(chǔ)下也可以進(jìn)行很好的識(shí)別（Song et al.，2016）。但需要重視的是，該技術(shù)對(duì)試驗(yàn)操作過(guò)程要求嚴(yán)格，DNA 質(zhì)量要求高，如若在DNA 提取和PCR 反應(yīng)試驗(yàn)過(guò)程中造成DNA 污染，則可能會(huì)使DNA 條形碼產(chǎn)生虛假識(shí)別（Yang et al.，2017）。

3 SSR 分子標(biāo)記在花椰菜品種鑒定中存在的問(wèn)題及解決辦法

綜合分析各分子標(biāo)記技術(shù)在花椰菜品種鑒定中的應(yīng)用研究，SSR 技術(shù)表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性，具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、輔助選擇效率高等優(yōu)勢(shì)，且為共顯性標(biāo)記，對(duì)于DNA 質(zhì)量和操作技術(shù)要求不高。但是，在利用SSR 技術(shù)進(jìn)行花椰菜品種鑒定的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題，建議采用相應(yīng)辦法解決。

利用SSR 技術(shù)鑒定花椰菜品種時(shí)需要篩選出多態(tài)性豐富的核心引物，該過(guò)程耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，并且需要通過(guò)大量材料對(duì)核心引物的可行性進(jìn)行佐證，因此縮短引物篩選時(shí)間并篩選出多態(tài)性豐富的核心引物是進(jìn)行花椰菜品種鑒定的關(guān)鍵所在。篩選引物時(shí)應(yīng)選擇表型性狀差異大的品種作為鑒定材料，并且設(shè)計(jì)合適的篩選條件。另外，在進(jìn)行花椰菜品種鑒定數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，根據(jù)指紋圖譜檢測(cè)種子基因型的位點(diǎn)差異存在片面性，鑒定結(jié)果只能說(shuō)明SSR標(biāo)記位點(diǎn)相同，不能排除未檢測(cè)到的位點(diǎn)存在差異，應(yīng)盡可能構(gòu)建完整的花椰菜品種指紋圖譜庫(kù)或者給定品種范圍進(jìn)行檢測(cè)鑒定。

盛小光等（2019）采用30 對(duì)SSR 引物對(duì)187份花椰菜、青花菜材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，擴(kuò)增出313 個(gè)等位位點(diǎn)，根據(jù)花球性狀可以將這187 份材料分成4 類，根據(jù)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon’s 指數(shù)等指標(biāo)分析得出花椰菜類群的遺傳差異較小。Zhao 等（2016）利用SSR 技術(shù)分析不同花椰菜品種間的遺傳多樣性，結(jié)果表明花椰菜品種的遺傳背景差異較小，遺傳多樣性狹窄，難以用分子標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分。因此對(duì)遺傳背景相似的花椰菜品種進(jìn)行精準(zhǔn)區(qū)分亟待解決，可選擇遺傳背景遠(yuǎn)且性狀有明顯差異的花椰菜品種用于SSR 引物的多態(tài)性篩選，同時(shí)可與其他分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合進(jìn)行花椰菜品種的區(qū)分。

4 小結(jié)

我國(guó)是花椰菜種植面積最大且種質(zhì)資源最為豐富的國(guó)家。隨著市場(chǎng)對(duì)于花椰菜的需求與日俱增，不法分子制售偽劣種子等違法行為愈加猖獗，在很大程度上限制了花椰菜種業(yè)的發(fā)展。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建花椰菜指紋圖譜，進(jìn)行花椰菜品種鑒定刻不容緩。本文對(duì)于當(dāng)前常用的幾種分子標(biāo)記技術(shù)在花椰菜上的應(yīng)用研究進(jìn)行了概述，綜合比較結(jié)果表明SSR 技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，具有一定的應(yīng)用前景與推廣價(jià)值。但隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)仍需要與更多的研究及新技術(shù)結(jié)合加以完善。為了提高花椰菜品種鑒定效率，利用高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)更多微衛(wèi)星標(biāo)記，構(gòu)建花椰菜DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)將花椰菜DNA 指紋數(shù)據(jù)錄入到互聯(lián)網(wǎng)中，并且實(shí)時(shí)補(bǔ)充新的指紋數(shù)據(jù)，完善花椰菜指紋圖譜，進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)共享，從而實(shí)現(xiàn)快速鑒定花椰菜品種的目的。不僅如此，健全關(guān)于花椰菜品種鑒定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫，還應(yīng)建立規(guī)范化種子生產(chǎn)指標(biāo)，從源頭治理種子偽劣問(wèn)題，加大種子執(zhí)法力度，確?；ㄒ水a(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。