植物生長調(diào)節(jié)劑赤霉素高產(chǎn)菌株的誘變選育

林 璐，彭 輝，聶志奎

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.江西新瑞豐生化股份有限公司，江西 新干 331300)

赤霉素(GAs)是一種四環(huán)二萜類化合物，至今已發(fā)現(xiàn)136種，其中活性最強(qiáng)的是GA3[1]。赤霉素作為植物五大激素之一，是一種天然植物生長調(diào)節(jié)劑，可使種子提前結(jié)束休眠、誘導(dǎo)種子發(fā)芽、促進(jìn)莖干生長、誘導(dǎo)開花等，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和釀造業(yè)，經(jīng)濟(jì)效益顯著，市場前景廣闊[2]。工業(yè)上主要通過藤倉赤霉菌深層液體發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素，但野生藤倉赤霉菌只能少量積累赤霉素，導(dǎo)致赤霉素生產(chǎn)成本較高、產(chǎn)量較低。因此，有必要對藤倉赤霉菌進(jìn)行誘變選育以提高赤霉素產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本[3]。傳統(tǒng)誘變隨機(jī)性大，篩選工作量較大。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變是近年來發(fā)展起來的一種新的微生物誘變技術(shù)，不僅操作簡單、成本低，而且對遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制多樣，可以提高獲得正向突變菌株的概率，對代謝途徑復(fù)雜的次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的誘變具有獨(dú)特優(yōu)勢[4-5]。

研究報道，赤霉素與麥角固醇共用前體物質(zhì)香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)[6]。麥角固醇是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分，一旦合成受阻勢必導(dǎo)致菌體死亡。酮康唑是一種咪唑類廣譜抗真菌藥物，通過高度選擇性干擾真菌的細(xì)胞色素P450的活性來抑制麥角固醇的生物合成。因此，以酮康唑為篩選壓力篩選出的抗高濃度酮康唑突變菌株勢必具有較強(qiáng)的麥角固醇合成能力，相應(yīng)地，也勢必具有較強(qiáng)的赤霉素合成潛力。

因此，作者以酮康唑為篩選壓力，對一株低產(chǎn)赤霉素的藤倉赤霉菌進(jìn)行ARTP誘變；然后以GA3產(chǎn)量為指標(biāo)，通過初篩、復(fù)篩獲得赤霉素高產(chǎn)菌株，并對該菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究，以獲得遺傳穩(wěn)定的赤霉素高產(chǎn)菌株，為其工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗

1.1 菌種與培養(yǎng)基

藤倉赤霉菌(Fusariumfujikuroi)CICC 2444，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

PDA斜面培養(yǎng)基(g·L-1)：馬鈴薯塊200，葡萄糖20，瓊脂15；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖60，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖80，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

微量元素溶液(mg·L-1)：H3BO3300，MnCl2·4H2O 100，ZnSO4·7H2O 100，F(xiàn)eCl3·6H2O 200，CuCl2·2H2O 500。配制方法：稱取各成分溶于少量水中，然后滴加鹽酸至溶液澄清，再定容至所需的體積。

1.2 培養(yǎng)方法

PDA斜面培養(yǎng)：在超凈臺中吸取甘油管中的藤倉赤霉菌液200 μL接種到PDA斜面培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)2～3 d，直至菌絲長滿整個斜面。

種子培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的菌種斜面，用無菌水洗下菌絲體，接種于種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)36 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：取種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)10 d。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：取種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于NBS 7.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r·min-1、1 vvm條件下培養(yǎng)10 d。

1.3 菌懸液的制備

取種子培養(yǎng)液5 mL，離心，去上清；用生理鹽水洗滌2次后將菌體移入裝有50 mL無菌水、底部鋪滿玻璃珠的錐形瓶中，于28 ℃、200 r·min-1振蕩20 min；取樣，梯度稀釋，涂布于平板，28 ℃培養(yǎng)2 d后測定菌落數(shù)，確定菌懸液濃度在105～106個·mL-1之間。

1.4 酮康唑致死濃度的確定

將一定量酮康唑溶于65%乙醇中，配制成濃度為3 mg·L-1的酮康唑乙醇溶液。取適量酮康唑乙醇溶液加入配制好的平板中，使其濃度分別為5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、50 mg·L-1，以未加酮康唑乙醇溶液的平板為對照組；取100 μL菌懸液涂布于平板，于28 ℃培養(yǎng)2 d后測定菌落數(shù)，按式(1)計算致死率：

(1)

1.5 ARTP誘變

ARTP誘變儀(思清源生物有限公司)的操作參數(shù)：功率100 W，氦氣流速10 L·min-1，氣壓0.1 MPa。操作前，對操作室進(jìn)行紫外滅菌30 min；然后取10 μL菌懸液均勻涂于載片上，置于ARTP誘變儀中分別誘變30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s，以未誘變?yōu)閷φ战M，每組實(shí)驗做3個平行；再移入裝有1 mL無菌水的EP管中，于振蕩器上振蕩1 min，形成新的菌懸液；最后將新菌懸液涂布于平板，于28 ℃培養(yǎng)2 d后測定菌落數(shù)，按式(2)計算致死率：

(2)

1.6 赤霉素高產(chǎn)菌株的篩選

初篩：將經(jīng)過ARTP誘變的菌懸液涂布于含有致死濃度的酮康唑平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d后測定菌落數(shù)，并將菌落保存。

復(fù)篩：將初篩得到的菌落接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗，測定GA3產(chǎn)量，保存產(chǎn)量較高的菌株。

遺傳穩(wěn)定性考察：將復(fù)篩得到的菌株在PDA斜面上進(jìn)行傳代實(shí)驗，測定每代菌株的GA3產(chǎn)量，并與傳代前進(jìn)行比較，以考察赤霉素高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.7 分析方法

菌株生物量：采用干重法測定。取一定量的菌液，真空抽濾，去離子水洗滌2次，得到的菌絲體經(jīng)60 ℃恒溫烘干至恒重。

葡萄糖含量：取一定量的發(fā)酵液，離心，取上清液100 μL定容至10 mL，用SBA-40C生物傳感器檢測。

GA3產(chǎn)量：采用高效液相色譜法測定。取一定量發(fā)酵液，12 000 r·min-1離心5 min，上清液用0.22 μm水系膜過濾后，裝入液相進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行液相分析。色譜條件：Dionex U3000型高效液相色譜儀，Venusil MP C18色譜柱(填料粒徑5 μm，Agela Technologies)，流動相為甲醇-水-磷酸(體積比68∶32∶0.05)，流速0.8 mL·min-1，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 酮康唑致死濃度的確定

取100 μL菌懸液涂布于不同濃度酮康唑平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d后計算致死率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酮康唑濃度對菌株致死率的影響Fig.1 Effect of ketoconazole concentration on lethality rate of strain

由圖1可知，隨著平板中酮康唑濃度的增加，菌株致死率快速升高，在酮康唑濃度增至30 mg·L-1時，菌株致死率達(dá)到100%；之后，繼續(xù)增加酮康唑濃度，致死率變化不大。因此，確定酮康唑致死濃度為30 mg·L-1。

2.2 ARTP誘變時間的確定

研究[7]發(fā)現(xiàn)，致死率越低，正向突變菌株越多，但高產(chǎn)菌株較少；而致死率越高，雖然負(fù)向突變菌株越多，但可能存在高產(chǎn)菌株。所以，致死率在70%～80%時的誘變效果是最理想的。為確定最佳ARTP誘變時間，取10 μL菌懸液，分別誘變不同時間，28 ℃培養(yǎng)2 d后計算致死率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 誘變時間對菌株致死率的影響Fig.2 Effect of mutagenesis time on lethality rate of strain

由圖2可知，隨著誘變時間的延長，菌株致死率不斷升高，當(dāng)誘變時間為90 s時，致死率接近100%；而當(dāng)誘變時間為70 s時，致死率為75.1%。所以，選擇70 s為最佳的ARTP誘變時間。

2.3 突變菌株的篩選

將菌懸液經(jīng)ARTP誘變70 s后，涂布于含有30 mg·L-1酮康唑的平板上，經(jīng)過初篩，挑選生長良好的菌株接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，測定生物量和GA3產(chǎn)量，結(jié)果見表1。

表1 突變菌株的發(fā)酵性能

由表1可知，經(jīng)過初篩、復(fù)篩，獲得12株GA3產(chǎn)量明顯高于出發(fā)菌株的突變菌株。與出發(fā)菌株相比，突變菌株的葡萄糖含量與生物量均相差不大，可知ARTP誘變并不影響菌體的正常生長；而目標(biāo)代謝產(chǎn)物GA3產(chǎn)量卻相差較大，其中突變菌株1-6-4與3-6-1的GA3產(chǎn)量分別達(dá)到186.86 mg·L-1和194.64 mg·L-1，較出發(fā)菌株分別提高了57%和64%。故，選擇突變菌株1-6-4與3-6-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

2.4 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

作為理想的工業(yè)化菌株，遺傳穩(wěn)定是關(guān)鍵特性之一。將突變菌株1-6-4與3-6-1分別進(jìn)行10次斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，測定每代菌株的GA3產(chǎn)量，并與傳代前進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，傳代9次后，突變菌株1-6-4與3-6-1的GA3產(chǎn)量均趨于穩(wěn)定，但菌株3-6-1的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于菌株1-6-4，GA3產(chǎn)量穩(wěn)定在180.00 mg·L-1左右，較傳代前(194.64 mg·L-1)僅降低約7.52%。

圖3 突變菌株1-6-4與3-6-1的遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of mutant strains 1-6-4 and 3-6-1

2.5 赤霉素高產(chǎn)菌株發(fā)酵罐放大驗證

利用7.5 L發(fā)酵罐對赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1的發(fā)酵性能進(jìn)行放大驗證。分時取樣測定葡萄糖含量、pH值、生物量及GA3產(chǎn)量，并與出發(fā)菌株的發(fā)酵性能進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。

圖4 赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1與出發(fā)菌株的7.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵性能比較Fig.4 Comparison of fermentation performance of high-yield Gibberellin-producing strain 3-6-1 and original strain cultured in 7.5 L fermentor

由圖4可知：(1)隨著發(fā)酵時間的延長，赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1和出發(fā)菌株的發(fā)酵液中葡萄糖含量均呈下降趨勢，且高產(chǎn)菌株3-6-1發(fā)酵液中的葡萄糖含量略高于出發(fā)菌株，表明高產(chǎn)菌株3-6-1的葡萄糖消耗量略低于出發(fā)菌株；發(fā)酵0～24 h耗糖速率明顯低于出發(fā)菌株，24 h后耗糖速率基本相同，說明高產(chǎn)菌株3-6-1的延滯期相對較長，對環(huán)境適應(yīng)能力較差。(2)赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1和出發(fā)菌株的發(fā)酵液pH值均隨著發(fā)酵時間的延長逐漸下降直至平穩(wěn)；發(fā)酵0～24 h，高產(chǎn)菌株3-6-1的發(fā)酵液pH值低于出發(fā)菌株，24 h后，就明顯高于出發(fā)菌株。這可能是由于，出發(fā)菌株在代謝過程中產(chǎn)生了更多的酸性物質(zhì)。(3)菌株生物量的變化規(guī)律與葡萄糖含量的相反，即隨著發(fā)酵時間的延長，高產(chǎn)菌株3-6-1的生物量略低于出發(fā)菌株。(4)隨著發(fā)酵時間的延長，赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1和出發(fā)菌株的GA3產(chǎn)量變化趨勢基本相同，即發(fā)酵48 h后，GA3產(chǎn)量均開始快速增加，但高產(chǎn)菌株3-6-1的GA3合成速率明顯高于出發(fā)菌株，發(fā)酵終產(chǎn)量達(dá)到235.98 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了87.2%。這可能是由于，pH值是影響GA3產(chǎn)量的重要因素，高產(chǎn)菌株3-6-1的發(fā)酵液pH值更適宜合成GA3。

3 結(jié)論

以藤倉赤霉菌CICC 2444為出發(fā)菌株，采用ARTP誘變，獲得了系列突變菌株，并基于赤霉素代謝途徑的分析，根據(jù)赤霉素和細(xì)胞壁關(guān)鍵成分麥角固醇共享前體物質(zhì)GGPP這一特征，選擇抑制麥角固醇生物合成的酮康唑為篩選壓力，篩選耐受高濃度酮康唑的突變菌株，建立了一種基于ARTP誘變結(jié)合酮康唑為篩選壓力的GA3高產(chǎn)菌株的選育方法。經(jīng)過抗性初篩和搖瓶復(fù)篩，獲得一株赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1，GA3產(chǎn)量達(dá)194.64 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了64%。經(jīng)傳代實(shí)驗驗證，該菌株遺傳穩(wěn)定性良好；經(jīng)7.5 L發(fā)酵罐分批放大培養(yǎng)，該菌株的發(fā)酵終產(chǎn)量為235.98 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了87.2%，具備成為工業(yè)菌株的潛力。所建立的赤霉素高產(chǎn)菌株誘變篩選方法既減少了篩選工作量，也提高了篩選到高產(chǎn)菌株的概率，為高產(chǎn)菌株的選育提供了借鑒。