基于復(fù)合酶制劑抑菌的糖蜜無酸發(fā)酵酒精技術(shù)的研究

尚紅巖，楊鳳婷，張洛銚，殷德運(yùn)，鄭子鑫，陳秀麗，鄭毅鋒，付金億，黃澤彬，鐘靖琪，曹嘉亮

(1廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510300；2廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所，廣東廣州 510316)

0 前言

糖蜜是制糖副產(chǎn)物，富含蔗糖和還原糖，是發(fā)酵酒精最經(jīng)濟(jì)的原料之一[1]。但糖蜜原料中還含有灰分、膠體和雜菌等，會抑制酵母繁殖和發(fā)酵，容易造成發(fā)酵感染雜菌，使發(fā)酵酒精濃度降低，揮發(fā)酸升高，影響發(fā)酵產(chǎn)酒率，發(fā)酵前必須盡可能排除這些雜質(zhì)[2]。傳統(tǒng)糖蜜發(fā)酵酒精通過添加硫酸調(diào)節(jié)pH值來抑制雜菌，容易造成設(shè)備腐蝕、結(jié)垢和環(huán)境污染等問題[3]。以果膠酶、蛋白酶和溶菌酶等復(fù)合酶制劑用于糖蜜酒精發(fā)酵，一方面溶菌酶可以殺滅細(xì)菌，但對酵母沒有殺滅作用，因此，可以替代硫酸實現(xiàn)無酸發(fā)酵。另一方面在蛋白酶、果膠酶等多種酶制劑協(xié)同作用下，將糖蜜中膠體、蛋白質(zhì)等水解為酵母可以利用的糖和氨基酸等，有利于提高產(chǎn)酒率。另外，氨基酸等還可以增加酵母營養(yǎng)，提高酵母細(xì)胞密度，以酵母生長優(yōu)勢抑制雜菌，同時可以降低發(fā)酵液黏度，減少泡沫及避免蒸餾塔結(jié)垢，有利于節(jié)能減排[4-8]。

本文通過對糖蜜原料的無酸澄清后添加復(fù)合酶制劑到糖蜜中，進(jìn)行酵母培養(yǎng)和連續(xù)發(fā)酵酒精，經(jīng)過連續(xù)發(fā)酵，測定其中的還原糖、揮發(fā)酸、酒分含量。糖蜜酒精發(fā)酵中分別添加果膠酶、木瓜蛋白酶和溶菌酶進(jìn)行單因素試驗，研究3種酶的最適添加濃度；接著通過正交實驗優(yōu)化復(fù)合酶制劑添加量，研究最佳添加濃度組合。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

糖蜜，廣西糖業(yè)集團(tuán)有限公司；果膠酶100000 U/g，河南林博生物科技有限公司；溶菌酶2000 U/g、葡萄糖氧化酶30000 U/g，廣州瑟燁生物科技有限公司；木瓜蛋白酶30000 U/g、纖維素酶30000 U/g，河南萬邦實業(yè)有限公司；釀酒活性干酵母，廣西丹寶利酵母有限公司；過磷酸鈣、硫酸銨、碘液、酚酞等均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；濃硫酸，重慶長鵬化工有限公司；氫氧化鈉，天津華東試劑廠。

1.2 主要儀器

UV-520紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；PHS-3精密酸度計，上海大普儀器有限公司；FA224電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；98-1-C數(shù)顯控溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；YX-280型手提壓力蒸汽滅菌鍋，廣州越特科學(xué)儀器有限公司；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科科學(xué)儀器有限公司；酒精濃度計，河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠；移液槍，濟(jì)南歐萊博技術(shù)有限公司。

1.3 糖蜜發(fā)酵酒精工藝流程

糖蜜發(fā)酵酒精工藝流程如圖1所示。

圖1 糖蜜發(fā)酵酒精工藝流程

1.4 試驗方法和步驟

1.4.1 糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基制備

糖蜜加水稀釋到50°Bx，加過磷酸鈣0.3%，硫酸銨 0.6%，加熱不斷攪拌至 80～85℃，自然沉降30 min，離心分離排除沉降物。再加水稀釋到25°Bx，加入0.2%尿素，制成發(fā)酵培養(yǎng)基，降溫到31℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 酵母液制備

稱取發(fā)酵培養(yǎng)基0.5%活性干酵母，加入20 mL 30℃無菌水活化10 min，制成酵母液。

1.4.3 糖蜜發(fā)酵酒精酶制劑添加濃度單因素實驗

分別量取發(fā)酵培養(yǎng)基250 mL于錐形瓶中，接種活化好的酵母液，分別加入果膠酶(10、15、20、25 U/g)，木瓜蛋白酶(12、16、20、24 U/g)，溶菌酶(12、16、20、24 U/g)，進(jìn)行單因素實驗，分別置于生化培養(yǎng)箱中，31℃/140 r搖床培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束檢測并記錄發(fā)酵前后發(fā)酵液糖錘度、酒精濃度、揮發(fā)酸和殘?zhí)呛俊?/p>

1.4.4 正交實驗優(yōu)化酶制劑添加量

在單因素實驗基礎(chǔ)上對果膠酶、木瓜蛋白酶、溶菌酶做3因素3水平正交實驗，如表1所示，以發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵成熟醪酒精濃度、揮發(fā)酸和殘?zhí)菫楹饬繀?shù)，優(yōu)化復(fù)合酶制劑的最佳添加濃度。

表1 糖蜜發(fā)酵復(fù)合酶正交實驗表

1.5 檢測方法

1.5.1 糖錘度的測定

糖錘度的測定參考《甘蔗糖蜜酒精生產(chǎn)檢驗方法》中的糖錘度計法[9]。

1.5.2 酒精度的測定

酒精度的測定采用蒸餾-酒度計法。具體操作步驟為：量筒量取100 mL發(fā)酵液，放入蒸餾燒瓶內(nèi)，用100 mL蒸餾水沖洗量筒，也放入蒸餾燒瓶內(nèi)，蒸餾并收集餾出液100 mL，用酒度計測定餾出液酒精濃度。

1.5.3 揮發(fā)酸的測定

采用堿液滴定法測定發(fā)酵蒸餾酒液的揮發(fā)酸。具體操作步驟為：取步驟 1.5.2節(jié)的酒精餾出液 50 mL，加入 0.1%酚酞指示劑 2～3滴，用 0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色在30 s不消失為止，記錄消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。

1.5.4 殘還原糖的測定

采用 3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定殘還原糖的含量[10]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗重復(fù) 3次，實驗結(jié)果取平均值，用Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和繪圖，SPSS 19.0進(jìn)行正交實驗數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同果膠酶添加量對發(fā)酵的影響

高濃度糖蜜中膠體等粘性物質(zhì)較多，果膠是以半乳糖醛酸為主的復(fù)合多糖類物質(zhì)，高濃發(fā)酵時醪液的粘度很大，給酒精的濃醪發(fā)酵帶來困難。本文分別選擇果膠酶不同添加量，以發(fā)酵成熟醪錘度、酒精濃度、殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸作為衡量指標(biāo)，研究果膠酶最適添加量。結(jié)果如表2和圖2～5所示。

表2 不同果膠酶添加量對發(fā)酵的影響

從表2和圖2～5可以看出，隨著果膠酶添加量的增加，發(fā)酵后錘度不斷降低，發(fā)酵含酒分升高，殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸不斷降低。當(dāng)果膠酶添加量為15 U/g時，發(fā)酵效果相對最好，發(fā)酵后錘度最低，發(fā)酵酒分最高，殘?zhí)欠肿畹?。這是由于糖蜜中的果膠在果膠酶的作用下，切斷果膠分子的α-1,4糖苷鍵，分解成半乳糖醛酸和還原糖等小分子糖[11]，可顯著降低醪液粘度，增加可發(fā)酵糖的含量，提高發(fā)酵酒精濃度。果膠酶添加量15 U/g為最適添加量。

圖2 果膠酶添加量對發(fā)酵錘度的影響

圖3 果膠酶添加量對發(fā)酵酒度的影響

圖4 果膠酶添加量對發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/p>

圖5 果膠酶添加量對發(fā)酵揮發(fā)酸的影響

2.2 不同木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵的影響

糖蜜中含有一定量的蛋白質(zhì)(包括微生物菌體細(xì)胞)，蛋白酶可將蛋白質(zhì)水解為氨基酸，酵母可以利用氨基酸作為氮源合成細(xì)胞。分別選擇木瓜蛋白酶不同添加量，以發(fā)酵成熟醪錘度、酒精濃度、殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸作為測定指標(biāo)，研究木瓜蛋白酶最適添加量。結(jié)果如表3和圖6～9所示。

從表3和圖6～9可以看出，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，發(fā)酵后錘度不斷降低，發(fā)酵含酒分升高，殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸不斷降低，當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為16 U/g發(fā)酵效果相對最好，發(fā)酵后錘度最低，發(fā)酵酒分最高，殘?zhí)欠肿畹?，發(fā)酵最徹底。酵母利用蛋白酶分解的氨基酸作為氮源合成細(xì)胞，使酵母細(xì)胞密度提高，以生長優(yōu)勢抑制雜菌[12]，因此，提高了發(fā)酵酒分，降低了細(xì)菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)酸。木瓜蛋白酶添加量16 U/g為最適添加量。

表3 不同木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵的影響

圖6 木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵錘度的影響

圖7 木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵酒度的影響

圖8 木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/p>

圖9 木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵揮發(fā)酸的影響

2.3 不同溶菌酶添加量對發(fā)酵的影響

糖蜜中含有少量的微生物菌體細(xì)胞，發(fā)酵過程中也可能感染細(xì)菌，溶菌酶可將細(xì)菌細(xì)胞分解，本實驗分別選擇溶菌酶不同添加量，以發(fā)酵成熟醪錘度、酒精濃度、殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸作為測定指標(biāo)，研究溶菌酶最適添加量。結(jié)果如表4和圖10～13所示。

從表4和圖10～13可以看出來隨著溶菌酶添加量的增加，發(fā)酵后錘度不斷降低，發(fā)酵含酒分升高，殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸不斷降低，當(dāng)溶菌酶添加量為20 U/g時發(fā)酵后錘度最低，發(fā)酵酒分最高，殘?zhí)欠肿畹?，發(fā)酵效果相對最好，發(fā)酵最徹底，溶菌酶添加量20 U/g為溶菌酶最適添加量。原因是溶菌酶可將發(fā)酵液中細(xì)菌細(xì)胞分解，直接殺滅雜菌，細(xì)菌分解產(chǎn)物氨基酸作為氮源合成酵母細(xì)胞，有利于提高酵母細(xì)胞密度，進(jìn)一步抑制雜菌[12]。

表4 不同溶菌酶添加量對發(fā)酵的影響

圖10 溶菌酶添加量對發(fā)酵錘度的影響

圖11 溶菌酶添加量對發(fā)酵酒度的影響

圖12 溶菌酶添加量對殘?zhí)欠值挠绊?/p>

圖13 溶菌酶添加量對揮發(fā)酸的影響

2.4 糖蜜發(fā)酵酒精復(fù)合酶添加量優(yōu)化正交試驗分析

糖蜜發(fā)酵酒精優(yōu)化復(fù)合酶添加量3因素3水平正交試驗 L9(33)結(jié)果見表 5。由實驗結(jié)果可知，A2B2C3組合的發(fā)酵酒度最高為 9.72%。由極差R大小分析，確定各因素對發(fā)酵酒度的影響主次順序為：A＞C＞B，即果膠酶對發(fā)酵酒精度的影響最顯著，溶菌酶次之，木瓜蛋白酶影響最?。灰跃凭珴舛葹橹饕u價指標(biāo)各因素最優(yōu)組合為 A3B2C3。用最優(yōu)因素組合A3B2C3進(jìn)行了3次平行驗證試驗，實驗結(jié)果如表6所示，發(fā)酵酒度的平均值為9.96%，比實驗系號5提高了2.45%，因此選擇A3B2C3為糖蜜無酸發(fā)酵各種酶制劑最佳配比，即果膠酶添加量為20 U/g，木瓜蛋白酶添加量為16 U/g，溶菌酶添加量為24 U/g。

表5 糖蜜發(fā)酵酒精優(yōu)化復(fù)合酶添加量正交試驗L9(33)

表6 正交實驗最優(yōu)組合驗證發(fā)酵試驗

3 結(jié)論與討論

本研究首先對糖蜜進(jìn)行無酸澄清處理配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接種活化的干酵母，分別添加不同濃度的果膠酶、木瓜蛋白酶、溶菌酶進(jìn)行單因素試驗，果膠酶濃度在15 U/g，木瓜蛋白酶濃度在16 U/g，溶菌酶濃度在20 U/g時，發(fā)酵效果相對最好，即發(fā)酵后錘度最低，酒度最高，殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸也最低。進(jìn)一步通過 L9(33)正交試驗優(yōu)化復(fù)合酶添加量，以發(fā)酵酒度作為評價指標(biāo)，最優(yōu)組合為 A3B2C3，即果膠酶添加量20 U/g，木瓜蛋白酶添加量為16 U/g，溶菌酶添加量為24 U/g，對應(yīng)發(fā)酵酒度的為9.96%，比添加上述單種酶最高酒度分別提高了 3.75%、11.91%、2.68%。糖蜜發(fā)酵酒精中添加果膠酶、木瓜蛋白酶和溶菌酶等復(fù)合酶制劑代替硫酸抑制雜菌，能明顯提高發(fā)酵成熟醪液酒精濃度。隨著制糖提糖技術(shù)的提高，作為副產(chǎn)物糖蜜中的膠體、灰分和雜菌的含量不斷增高[8]，以果膠酶、蛋白酶和溶菌酶等酶制劑代替硫酸對糖蜜進(jìn)行澄清處理后發(fā)酵，將能取得更好的發(fā)酵效果，同時能降低酒精添加硫酸對生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境的危害，有利于糖蜜酒精生產(chǎn)企業(yè)減排增效。