A型產(chǎn)氣莢膜梭菌致病機(jī)理的研究進(jìn)展

龔紫鳳，冶貴生

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，Cp）首次于19世紀(jì)末從死于主動(dòng)脈瘤的尸體中分離到，并由Nuttal和Welch 將其命名為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，1931年國(guó)際聯(lián)盟衛(wèi)生組織常設(shè)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)稱其為產(chǎn)氣莢膜菌，隨后采用產(chǎn)氣莢膜梭菌的名稱[1-3]沿用至今。Cp作為一種人畜共患的細(xì)菌性條件致病性病原，屬于革蘭陽(yáng)性厭氧芽孢致病菌，是細(xì)菌性食源性疾病暴發(fā)的重要原因之一，已成為美國(guó)食源性疾病的第二大細(xì)菌性病因。該菌廣泛分布于污水、土壤、空氣及人和動(dòng)物的胃腸道，其分泌的細(xì)胞外蛋白質(zhì)毒素，可引起人和動(dòng)物許多不同的組織毒性及腸毒性疾病?；谠摼饕a(chǎn)生的4 種主要致死性毒素（α、β、ε、ι）可將其分為A～G 7種血清型[4-6]，其中A型菌為危害較嚴(yán)重的毒素型菌。

A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringenstype A，CpA）是引起禽類壞死性腸炎和人源食物中毒的常見(jiàn)病原，可導(dǎo)致人體或動(dòng)物體組織氣腫，還能引起家兔、犬、犢牛、羔羊、豬等動(dòng)物腸毒血癥及胃腸道傳染性疾病，胃腸內(nèi)的毒素被吸收進(jìn)入機(jī)體并循環(huán)，從而損害其他內(nèi)部器官[7-10]，嚴(yán)重危害人與動(dòng)物公共衛(wèi)生安全及現(xiàn)代禽畜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文以有關(guān)CpA病理方面的資料為基礎(chǔ)，對(duì)CpA致病機(jī)理進(jìn)行歸納，以期為更好地做好Cp感染的防控政策提供參考思路。

1 CpA 的致病性

CpA 是常見(jiàn)的腸道菌群，但一定條件下其分泌的外毒素可致病，可導(dǎo)致多種腸道傳染性腹瀉疾病。吳立婷等對(duì)牛、羊、雞3種不同來(lái)源Cp分離株進(jìn)行毒力鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)52 株分離株均為CpA[11]，司南等對(duì)遷徙候鳥樣品進(jìn)行Cp分離鑒定及特性分析，發(fā)現(xiàn)CpA分離率高達(dá)90%，表明畜禽Cp 感染多以CpA 為主[12]。CpA 能引起初生仔豬腸毒血癥，該病多以春冬季發(fā)病較為明顯，且多發(fā)于出生后2 d～3 d 內(nèi)的仔豬，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡[13]，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。王婧祺等研究發(fā)現(xiàn)腹瀉源與健康源CpA 存在交叉分布，且呈現(xiàn)一定地理分布特征，表明某種程度上CpA對(duì)仔豬腹瀉的影響可能與地區(qū)環(huán)境有關(guān)[14]。此外CpA 也是導(dǎo)致?！扳腊Y”的主要毒素型菌株，該菌產(chǎn)生的腸毒素也能致牛腹瀉，引起牛腸源性毒血癥，且較易發(fā)于犢牛[15]。近年來(lái)山東省多個(gè)鴨場(chǎng)和兔場(chǎng)均檢測(cè)出CpA，但具體感染機(jī)制不明，需進(jìn)一步研究[16-17]。因此，也提醒畜禽養(yǎng)殖業(yè)需重視CpA 感染導(dǎo)致的危害。另外王斌等通過(guò)對(duì)朱鹮感染Cp進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)3株分離的菌株均為CpA，證明了CpA 能夠感染野生動(dòng)物[18]。此外，CpA 的致病性與自身分泌的溶血素、毒素有直接關(guān)系，吳允正等通過(guò)研究多種動(dòng)物源CpA 的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)羊源CpA 溶血最快，豬源CpA 溶血最慢[19]，表明不同動(dòng)物源的CpA 毒力不同?；谏鲜鲅芯?，表明CpA 不僅在畜禽中呈現(xiàn)流行感染的狀況，還可能感染野生動(dòng)物。

2 CpA 的致病機(jī)理

病原微生物指能夠侵入宿主，并導(dǎo)致其出現(xiàn)不同程度病理變化的微生物，其中細(xì)菌為危害性較大的病原微生物之一。細(xì)菌的致病物質(zhì)主要包括菌體表面結(jié)構(gòu)、毒素及侵襲性酶，病原菌感染往往會(huì)破壞宿主腸道黏膜，最終導(dǎo)致其食物中毒、腸炎、腹瀉等疾病，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康發(fā)展。CpA 作為Cp 中危害較為嚴(yán)重的致病菌，深入了解其毒性及作用機(jī)制對(duì)研發(fā)該菌的疫苗和制定相應(yīng)的防控政策具有重要的指導(dǎo)意義。

2.1 CpA 的毒力因子CpA 產(chǎn)生的外毒素可致人和動(dòng)物的組織中毒和腸道感染。該菌主要產(chǎn)生α 毒素和腸毒素，此外，近年來(lái)隨著有關(guān)CpA 致病性相關(guān)報(bào)道日漸增多，發(fā)現(xiàn)CpA 能夠產(chǎn)生其他致死性的毒素，如β2、NetB[20-21]。

2.1.1 α 毒素 α 毒素（Alpha toxin，CPA）分子量約為43 ku，是一種重要的致死性毒素，可產(chǎn)生于所有類型的Cp，但在CpA 中表達(dá)水平最高。不同毒素型Cp 產(chǎn)生的α 毒素基因具有部分同源性，且其編碼基因均位于染色體[20]。α 毒素又名磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）是CpA 主要的毒力因子，且為引發(fā)各類組織或腸道感染疾病最重要也是最關(guān)鍵的致病因子。α 毒素屬于多功能性金屬酶，其分子結(jié)構(gòu)包括β-折疊組成的膜結(jié)合C 結(jié)構(gòu)域和α-螺旋組成的催化N 結(jié)構(gòu)域，C 端和N 端具有不同生物活性，C 端膜結(jié)構(gòu)域具有免疫原性[22]，在α 毒素發(fā)揮毒性功能中起到至關(guān)重要的作用。Takagishi 等研究發(fā)現(xiàn)α 毒素能特異性結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂類糖GM1a，隨后促進(jìn)GM1a 的聚集和酪氨酸激酶A（TrkA）的激活，觸發(fā)lL-8 的釋放，lL-8 通過(guò)招募和激活中性粒細(xì)胞引起細(xì)胞急性炎癥[23]，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該毒素同時(shí)含PLC 和鞘磷脂酶活性，對(duì)鞘磷脂與磷脂酰膽堿具有水解作用，借助這2 種酶活性可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，引起細(xì)胞裂解，從而表現(xiàn)出毒素的細(xì)胞毒性、致死性、溶血活性等[24-25]，這也表明α 毒素在CpA 致病過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。

2.1.2 腸毒素（Clostridium perfringens enterotoxin，CPE） CPE 分子量約為35 ku，其基因位于染色體或大的接合質(zhì)粒上，是一種與人和動(dòng)物有著密切聯(lián)系的新型細(xì)菌毒素，在Cp 介導(dǎo)的人類食物中毒中起重要作用。CPE 包含一個(gè)C 端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)N 端細(xì)胞毒性結(jié)構(gòu)域組成，前者能夠與宿主細(xì)胞上的claudin 受體結(jié)合，后者對(duì)通過(guò)介導(dǎo)寡聚和膜插入形成孔的過(guò)程至關(guān)重要[26-27]。CPE 孔的形成能夠提高細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度，從而通過(guò)Caspase-3 介導(dǎo)的凋亡或腫瘤來(lái)觸發(fā)鈣調(diào)素和鈣蛋白酶依賴的宿主細(xì)胞死亡[28-29]。此外，CPE 小復(fù)合物聚集后形成一個(gè)大的CPE 復(fù)合物（CH-1），同時(shí)在敏感宿主細(xì)胞中也能夠形成第二個(gè)復(fù)合物（CH-2），CH-2 的形成能夠誘導(dǎo)封閉蛋白（Occludin）的內(nèi)化，且CH-2 可介導(dǎo)連接蛋白（Claudin）進(jìn)入CPE 處理后的細(xì)胞胞質(zhì)[30-31]，這可能會(huì)破壞細(xì)胞的緊密連接，改變細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而導(dǎo)致宿主腹瀉。雖然產(chǎn)CPE 的Cp 較少，但呈CPE+Cp 能夠引起人腹瀉、食物中毒等胃腸道疾病[32-33]。以上研究表明CPE是導(dǎo)致CpA細(xì)菌性食物中毒、嘔吐及腹瀉的重要原因，且CPE在胃腸道感染中發(fā)揮重要作用。2.1.3 β2 毒素 β2 毒素（Beta2 toxin，CPB2）分子量約為28 ku，對(duì)細(xì)胞具有毒性和致死性，大多數(shù)Cp類型都能產(chǎn)生β2 毒素，β2 毒素與β1 無(wú)明顯氨基酸同源性[21]，且β2 毒素的作用方式和受體相關(guān)報(bào)道較少，其致病機(jī)制尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)不同類型、來(lái)源Cp β2 毒素的基因位置有所不同，CPE 與人源CpA β2 毒素基因位于同一質(zhì)粒中[34]。最新研究表明，豬源CpA 中β2 毒素基因的表達(dá)相比其他動(dòng)物來(lái)源的CpA 高[35]。有資料表明產(chǎn)生β2 毒素的CpA 與仔豬腸出血癥息息相關(guān)，韓春生等研究發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬中β2 毒素的檢出率為77.1%[36]，Bueschel 等通過(guò)研究Cp β2 毒素的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)從患腸炎或腹瀉癥狀的新生仔豬糞便中能夠檢測(cè)到β2 毒素，且陽(yáng)性率高達(dá)91.8%，并且大多數(shù)分離株為CpA 株[37]，這可能為進(jìn)一步深入研究CpA 的流行病學(xué)調(diào)查壞死性腸炎及樣病毒重要的指導(dǎo)意義。

2.1.4 壞死性腸炎B 樣毒素（Necrotic enteritis B-like toxin，NetB） NetB是一種33 ku 的單鏈蛋白，首次分離于CpA 感染的壞死性腸炎病雞中，在禽類壞死性腸炎中起到關(guān)鍵的致病作用[38]。NetB 與β 毒素的氨基酸序列相似度達(dá)38%，屬于β 成孔毒素家族一員，其構(gòu)象與α 溶血素差異較大，形成的空隙也較大，該毒素可破壞細(xì)胞質(zhì)膜形成空洞，造成細(xì)胞裂解死亡[39]。與大多數(shù)毒素一樣，NetB 以單體形式存在，插入細(xì)胞膜之前在宿主細(xì)胞表面寡聚，純化的天然NetB 和重組NetB 均對(duì)雞肝癌細(xì)胞系LMH 具有細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)細(xì)胞裂解[38]。

2.2 CpA 與宿主細(xì)胞的相互作用CpA 可通過(guò)其分泌的毒素侵入宿主細(xì)胞，引起宿主細(xì)胞損傷、壞死，從而對(duì)宿主發(fā)揮致病作用。用20 μg/mL β2 毒素處理豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）細(xì)胞，24 h 后對(duì)細(xì)胞的黏附力下降，且變圓，并隨β2 毒素濃度的增加細(xì)胞的損傷愈發(fā)明顯[40]。此外，β2 毒素能間接或直接攻擊機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)系統(tǒng)[41]，影響宿主的生理活動(dòng)。周姣等通過(guò)測(cè)定CpA菌株和CpA β2+毒素?cái)y帶率，利用CpA（β2+/β2-）分離株培養(yǎng)上清液以腹腔接種小鼠方式進(jìn)行小鼠毒性試驗(yàn)，結(jié)果顯示小鼠呈現(xiàn)不同程度臨床癥狀甚至死亡，同時(shí)表明CpA 毒性與菌株是否攜帶β2 毒素，是否來(lái)自腹瀉或健康仔豬均無(wú)直接關(guān)系，其毒性可能與宿主腸道環(huán)境相關(guān)[42]。曾秀等以CpA β2毒素為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出宿主中與β2 毒素發(fā)生相互作用的蛋白，結(jié)果顯示β2 毒素與半乳糖凝集素-1（LGALS1）具有特異性的相互作用，且該毒素與LGALS1 蛋白C 端的相互作用比其與LGALS1 完整蛋白的作用更強(qiáng)[43]，這種互作調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，β2 毒素對(duì)宿主正常生命活動(dòng)有一定的損害，其作用強(qiáng)度可能與蛋白自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。

細(xì)胞毒性和溶血性是CpA α 毒素與宿主細(xì)胞膜相互作用后膜磷脂水解的結(jié)果[44]，為此，體外研究可依據(jù)α 毒素溶解紅細(xì)胞的情況來(lái)檢測(cè)該毒素水解細(xì)胞膜磷脂的能力。體內(nèi)研究表明，α 毒素對(duì)膜磷脂的水解能力可因其濃度不同而有差異。低濃度α毒素能夠水解部分鞘磷脂和卵磷脂，產(chǎn)生第二信使，觸發(fā)多種信號(hào)通路，導(dǎo)致部分細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的分泌不受調(diào)控；較高濃度α 毒素可降解大量磷脂分子，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜崩裂及多數(shù)細(xì)胞裂解[45]。α 毒素也能與GTP 結(jié)合蛋白相互作用激活鞘磷脂代謝系統(tǒng)或經(jīng)激活甘油磷脂代謝系統(tǒng)，進(jìn)而發(fā)揮其溶血和壞死活性，導(dǎo)致細(xì)胞組織感染[46]。此外，α 毒素還可激活MEK/ERK 信號(hào)通路產(chǎn)生活性氧，且隨著活性氧的積累可造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[47]。也有研究表明，α毒素激活MEK/ERK 途徑，從而通過(guò)刺激ERK1/2 和p38 MAPK 途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和IL-8 的產(chǎn)生[48]，危害機(jī)體的正常生命活動(dòng)。

先前研究表明，CPE 通過(guò)改變宿主細(xì)胞膜通透性，破壞細(xì)胞膠體滲透壓的平衡，使細(xì)胞裂解死亡[49]。另有報(bào)道顯示，CPE 可通過(guò)胰酶作用切除毒素自身的24 個(gè)氨基酸殘基，致使其毒性增強(qiáng)，其C 端結(jié)合細(xì)胞膜受體，N 端發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[50]。攜帶CPE 的Cp 常見(jiàn)于犬感染，推測(cè)CPE 有可能通過(guò)動(dòng)物傳播至人。相關(guān)研究表明，NetB 誘發(fā)細(xì)胞死亡的原因是在宿主易感細(xì)胞膜中形成了失控的離子通道，從而出現(xiàn)細(xì)胞滲透性溶解[51]，這對(duì)宿主的感染和發(fā)病機(jī)制起重要作用。

2.3 CpA 感染與機(jī)體免疫應(yīng)答病原菌的致病力及感染很大可能取決于宿主免疫系統(tǒng)與病原菌的相互作用。李建偉將分離到的2 株CpA 分別命其名為CP1和Cp2，通過(guò)Cp1 感染W(wǎng)T 和GPR120-/-小鼠構(gòu)建氣性壞疽模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于WT 小鼠，GPR120-/-小鼠肌肉組織表達(dá)的IL-Iβ 水平顯著下降，趨炎因子KC水平顯著提高[52]，推測(cè)CpA 可通過(guò)降低細(xì)胞因子的表達(dá)，影響宿主免疫系統(tǒng)，進(jìn)而加重病情或引發(fā)疫病。Takehara 等研究表明CpA 通過(guò)α 毒素以酶活性依賴的方式抑制成熟中性粒細(xì)胞的分化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞積聚在鄰近血管[53]，從而逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)。張?jiān)裳芯堪l(fā)現(xiàn)CpA 與球蟲混合感染肉雞后，肉雞空腸隱窩T 淋巴陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著下降[54]，其免疫功能受損。另有研究表明，α 毒素可引起宿主細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)和相關(guān)基因表達(dá)的改變，干擾線粒體代謝和呼吸過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激及整體代謝中斷[55]。而線粒體對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、激活和存活發(fā)揮了關(guān)鍵作用，這也提示CpA 有可能通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞線粒體功能障礙逃避宿主的免疫應(yīng)答。

3 小結(jié)與展望

大量研究表明CpA 仍是Cp 流行的致病菌，且CpA 還可能與其他病毒存在共感染，其產(chǎn)生的外毒素在宿主感染過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，可引起細(xì)胞損傷和死亡[56]，為此應(yīng)重視對(duì)該菌的監(jiān)測(cè)、檢測(cè)及預(yù)防。有資料顯示YesM/YesN 信號(hào)系統(tǒng)與CpA 毒力基因的表達(dá)呈正相關(guān)，提示該信號(hào)系統(tǒng)一定程度上可增強(qiáng)CpA 的致病性[57]，這將為CpA 感染的防治提供重要研究方向。但目前關(guān)于CpA 的致病機(jī)理尚未明確。因此，加強(qiáng)CpA 致病機(jī)制的研究，為研發(fā)該菌疫苗研發(fā)和流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。另外，近年來(lái)由于濫用抗菌藥物，Cp 的耐藥性呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)[58]，耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)警示人們需合理用藥，避免耐藥性增長(zhǎng)過(guò)快，進(jìn)而更好地預(yù)防該菌引起的食物安全及動(dòng)物衛(wèi)生問(wèn)題。