VDAC蛋白在病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡中作用的研究進展

劉軍亭，王 濤，陳妍卉，于 潛，劉久源，于丁一，董 浩,2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118；3.東北師范大學(xué)附屬中學(xué)，吉林 長春 130118）

目前動物疾病死亡率高、傳染性強，給中國畜禽業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失，對于疫病的防控迫在眉睫。多數(shù)動物疫病因病毒感染所致，特別是小鵝瘟、豬瘟、禽流感等疾病，病毒的致病性與眾多因素有關(guān)，其中病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡是致病機制之一。病毒在侵入動物細胞時所引起的宿主細胞凋亡，為病毒自身的復(fù)制和擴散創(chuàng)造了有利條件[1]。目前對病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的機制還不很了解，但近些年有多項研究報道，線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道（Voltage-dependent anion channel，VDAC）蛋白在細胞代謝和細胞凋亡中可能具有調(diào)控作用。據(jù)報道一些病毒侵入宿主細胞后，VDAC 蛋白可通過寡聚體通道釋放凋亡相關(guān)蛋白，從而促進細胞凋亡。此外VDAC 蛋白也可通過與抗凋亡蛋白的相互作用負向調(diào)控細胞凋亡。因此VDAC 在某些病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡中可能起到關(guān)鍵作用。本文將對VDAC 蛋白的分類、結(jié)構(gòu)特點、在細胞代謝中的作用以及在病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡中可能存在的一些作用進行綜述，為深入研究病毒的復(fù)制機制提供一定參考。

1 VDAC 蛋白

VDAC 蛋白位于線粒體外膜，作為膜通道的第一道防線，與線粒體內(nèi)膜中的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運體（ANT）、基質(zhì)中的親環(huán)素D（CypD）及膜間隙可溶性蛋白等共同組成線粒體滲透性轉(zhuǎn)變孔復(fù)合物[2]。VDAC蛋白由約285個氨基酸組成，大小約為30 ku。最初研究發(fā)現(xiàn)VDAC 蛋白的結(jié)構(gòu)為β-折疊；有3 種亞型：VDAC1、VDAC2 和VDAC3，其中VDAC3 蛋白的部分序列與VDAC1和VDAC2相同，因此其行使的功能可能部分相同，但不同種生物可能存在不同數(shù)量的亞型[3]。VDAC 蛋白是由核基因編碼后，通過胞質(zhì)分子伴侶轉(zhuǎn)運至線粒體，并被線粒體外膜的轉(zhuǎn)位酶復(fù)合物識別，經(jīng)分選整合后插入到線粒體外膜中，發(fā)揮著“門”的功能[4]。但近年有研究報道VDAC 蛋白不僅在線粒體外膜表達，還存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細胞核膜上，其功能尚未闡明[5]。

細胞在代謝過程中，ATP 和ADP 的轉(zhuǎn)換需要先經(jīng)過線粒體膜轉(zhuǎn)運復(fù)合體，然后與線粒體內(nèi)的VDAC蛋白作用，跨過線粒體膜通道進入細胞質(zhì)中，最后釋放細胞代謝所需的能量[6]。VDAC 蛋白在轉(zhuǎn)運離子和代謝物等的跨膜運輸中也起著關(guān)鍵作用，例如Ca2+、膽固醇、脂肪酸和活性氧（ROS）等物質(zhì)。VDAC 蛋白對Ca2+有調(diào)控作用，可調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)和氧化磷酸化[7]。VDAC1 蛋白與轉(zhuǎn)運蛋白（TSPO）和類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）共同形成轉(zhuǎn)運膽固醇的多蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)體。并且VDAC 蛋白可通過與己糖激酶結(jié)合后，將胞漿和膜間隙之間的ATP/ADP、NAD+/NADH 和乙酰輔酶A 等物質(zhì)回收，以調(diào)節(jié)糖酵解和三羧酸循環(huán)等過程[8]。此外VDAC1寡聚體可形成親水性蛋白轉(zhuǎn)運通道，能夠介導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)因子AIF 從線粒體外膜轉(zhuǎn)運至胞漿和細胞核中，導(dǎo)致細胞凋亡[9]。另有研究表明VDAC1 寡聚體允許線粒體DNA 的釋放，造成線粒體功能障礙并促進炎癥小體的激活[10]。因此VDAC 蛋白能否在線粒體外膜轉(zhuǎn)運過程中正常運行直接影響著細胞的代謝和死亡。作為細胞穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的VDAC 蛋白，與細胞代謝和細胞死亡之間的平衡有著復(fù)雜的聯(lián)系[11]。

2 病毒感染與細胞凋亡

2.1 細胞凋亡細胞凋亡是指細胞程序性死亡，其參與了從胚胎發(fā)育到衰老的生物學(xué)過程。促凋亡活性蛋白與宿主細胞內(nèi)的特異性相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用，形成蛋白復(fù)合物，破壞宿主細胞內(nèi)的動態(tài)平衡，觸發(fā)一系列的級聯(lián)信號，從而激活不同的信號通路誘導(dǎo)宿主細胞發(fā)生凋亡。目前，細胞凋亡可分為內(nèi)源性凋亡通路與外源性凋亡通路兩種[12]。

線粒體膜通透性增強是細胞內(nèi)源性凋亡開始的重要標志，該凋亡形式依賴于線粒體釋放的因子，因此也稱為線粒體凋亡[13]。線粒體接收到來自胞內(nèi)產(chǎn)生的各種凋亡信號，例如氧化應(yīng)激、DNA 損傷、溶酶體壓力、ROS 以及Ca2+過載等，使線粒體膜通透性增強，膜間隙可溶性蛋白釋放到胞漿中，進而激活一系列的Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生線粒體凋亡[14]。其中膜間隙可溶性蛋白包括細胞色素c（Cyt c）、絲氨酸蛋白酶（HtrA2/Omi）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、Smac/Diablo 及核酸內(nèi)切酶（EndoG）。研究表明隨著不同膜間隙蛋白的釋放，它們誘導(dǎo)所產(chǎn)生的凋亡通路也不同[15]。外源性凋亡通路又稱為由死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡，死亡受體歸屬于腫瘤壞死因子受體基因超家族（TNFR），是一類具有跨膜性質(zhì)的蛋白[16]。胞外的死亡配體與相應(yīng)的受體結(jié)合是外源性凋亡開始的標志，此時各種凋亡信號傳遞到胞內(nèi)，經(jīng)過不同路徑引起細胞凋亡[17]。

2.2 病毒感染與細胞凋亡的關(guān)系在長期進化中，宿主具有及時識別病毒感染并抑制病毒復(fù)制的反應(yīng)，即在病毒侵入宿主早期，宿主可“殺死”自身已受病毒感染的細胞進而控制病毒在細胞中的復(fù)制，同時還能促進相鄰細胞呈現(xiàn)抗病毒模式。病毒在侵入宿主后，宿主通過凋亡等反應(yīng)抵御病毒。然而病毒為了能夠在宿主體內(nèi)成功的感染和復(fù)制，也不斷地變化策略應(yīng)對宿主細胞的凋亡反應(yīng)[18]。一方面，宿主細胞通過自身凋亡殺死已被病毒感染的細胞，從而中止病毒擴散；另一方面，病毒利用宿主細胞的凋亡機制達到促進自身復(fù)制和釋放子代顆粒的目的，進而增強病毒的致病性。病毒在感染早期會迫使宿主編碼類似B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）家族的抗凋亡蛋白或抑制促凋亡蛋白活性的病毒蛋白以阻斷細胞凋亡的發(fā)生，從而有利于自身的復(fù)制。當獲得足夠多的子代病毒后，開始促進細胞凋亡加速病毒的傳播和宿主的損傷?？傊?，病毒或者通過增強線粒體膜通透性影響或控制凋亡的關(guān)鍵蛋白，進而間接的促進線粒體凋亡的發(fā)生；或者直接作用于外源性凋亡途徑的核心蛋白以促進由死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡[19]。

3 VDAC 蛋白在病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用

VDAC 蛋白與細胞的關(guān)系非常密切，在病毒誘導(dǎo)的凋亡過程中主要包括兩種作用：一種為VDAC 蛋白與促凋亡或抗凋亡因子結(jié)合直接參與病毒誘導(dǎo)的凋亡；另一種為VDAC蛋白作用于病毒間接參與凋亡。

3.1 VDAC 蛋白直接參與細胞凋亡研究表明某些病毒蛋白可靶向線粒體并干擾其功能，造成線粒體功能障礙，進而導(dǎo)致病毒性疾病。如，丙型肝炎病毒（HCV）蛋白與線粒體的關(guān)聯(lián)在HCV 誘發(fā)的慢性肝病和肝癌的發(fā)病機理中起重要作用[20]。HCV 蛋白進入線粒體后，導(dǎo)致線粒體內(nèi)Ca2+吸收增加、ROS 產(chǎn)生和線粒體通透性轉(zhuǎn)變，內(nèi)源性凋亡和肝臟微環(huán)境的變化導(dǎo)致疾病的發(fā)生。VDAC 作為線粒體內(nèi)關(guān)乎細胞生死的蛋白，在線粒體凋亡中起關(guān)鍵作用，因此疾病的發(fā)生與VDAC 蛋白的調(diào)控息息相關(guān)[21]。如圖1所示，線粒體凋亡蛋白的釋放是通過線粒體膜上的一個通道，該通道主要由Bax 或Bax 的異型低聚物、Bak 低聚物、及VDAC 蛋白或VDAC 蛋白低聚物組成[22]，改變線粒體膜的通透性有助于凋亡蛋白的釋放，進而促使細胞發(fā)生線粒體凋亡。同時在凋亡早期，Bcl-2 家族的促凋亡因子Bak 與VDAC 蛋白結(jié)合后，引起VDAC 蛋白閉合進而抑制ATP 的釋放，ADP、無機磷不能從胞漿進入線粒體，從而抑制了線粒體的功能，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，釋放Cyt c 和凋亡因子等，進而導(dǎo)致細胞凋亡[23]。

VDAC 蛋白可通過與凋亡因子的相互作用調(diào)控病毒感染細胞的凋亡，且VDAC 蛋白的3 種亞型與不同蛋白的互作在病毒誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮不同的作用。Li 等研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣在感染皰疹病毒后，內(nèi)源性VDAC2 蛋白可能通過抑制Bak 的活性，進而抑制細胞凋亡[24]。該研究為軟體動物的線粒體凋亡提供了新的見解，也為皰疹病毒感染的防制提供了新的思路。Chen 等研究表明，VDAC 蛋白在蝦白斑綜合征病毒（WSSV）感染的不同階段發(fā)揮著不一樣的作用，即在早期誘導(dǎo)線粒體功能障礙造成能量異常和代謝前體，但在后期增強線粒體膜通透性和線粒體凋亡[25]。楊夏云研究表明，喹烯酮（QCT）代謝過程中產(chǎn)生的ROS 促進VDAC1/2 蛋白和Bak1 多聚體的形成，同時抑制Wnt/β-catenin 信號通路引起細胞發(fā)生線粒體凋亡[26]。喹烯酮（QCT）是一類廣泛應(yīng)用于畜牧與水產(chǎn)養(yǎng)殖中的新型藥物，但其具有遺傳毒性。QCT 代謝過程中產(chǎn)生的ROS 是造成其毒性的原因。抑制VDAC1/2 蛋白和Bak1 多聚體可以有效減緩ROS 的產(chǎn)生，進而可能消減其遺傳毒性，該研究為獸藥的研發(fā)帶來了新的方向。多項研究均表明VDAC 蛋白可以通過與其互作因子的結(jié)合來調(diào)控細胞凋亡的發(fā)生（表1），因此調(diào)控VDAC 蛋白的表達可能會對治療由凋亡引起的動物疾病有效。

表1 VDAC蛋白及與其互作因子的作用Table 1 The role of VDAC and its interacting factors

3.2 VDAC 蛋白間接參與細胞凋亡大量研究表明，VDAC 蛋白不僅可直接與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，還可調(diào)控病毒，從而間接作用于病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡[35]。有研究表明過表達VDAC 可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的接觸點，促進線粒體對Ca2+信號的響應(yīng)，而Ca2+內(nèi)流可激活線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡[36]。如Zhang 等研究表明，鴨腸炎病毒可通過對Ca2+的調(diào)控抑制鴨胚成纖維細胞（DEF）的活力，同時促進DEF細胞的凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而沉默VDAC 蛋白可抑制Ca2+內(nèi)流和調(diào)控細胞凋亡[37]。此外VDAC 蛋白還參與了其他類型的動物疾病，例如由細菌引起的疾病和動物糖尿病等（表2）。因此，調(diào)控VDAC 蛋白的表達對動物疾病的治療有很大益處，VDAC 可能會成為治療動物疾病的新靶點或疫苗研發(fā)的新方向。

表2 VDAC蛋白及其互作因子在不同病毒或疾病中的作用Table 2 The role of VDAC and its interacting factors in different viruses or diseases

早期Lv 等的研究提到牙鲆魚在感染鲆彈狀病毒（SMRV）后，體內(nèi)的VDAC 蛋白可抑制SMRV 的復(fù)制，具有抗病毒免疫反應(yīng)，并可能對細胞凋亡具有調(diào)控作用[43]。Lin 等研究表明，在傳染性法氏囊病病毒（IBDV）感染過程中，雞源蛋白激酶C 受體1（RACK1）、VDAC2 蛋白和IBDV VP5 發(fā)生相互作用，并在病毒感染后于細胞內(nèi)形成復(fù)合物，抑制病毒的增殖，在IBDV 感染過程中發(fā)揮了抗凋亡作用，說明VDAC2 蛋白在誘導(dǎo)凋亡的過程中起著不可或缺的作用，但其作用機制尚未闡明[44]。此后韓春燕研究發(fā)現(xiàn)，宿主蛋白VDAC1可以促進IBDV RNP 復(fù)合體聚合酶的活性和穩(wěn)定性，對IBDV 的復(fù)制具有調(diào)控作用，并且下調(diào)VDAC1 蛋白的表達可以顯著抑制IBDV 誘導(dǎo)的細胞凋亡[45]。Jitobaom 等研究表明，登革熱病毒（DENV）感染哺乳動物細胞后，VDAC1 蛋白可以與DENV E 蛋白相互作用的蛋白GRP78 進行結(jié)合，進而促進DENV的復(fù)制，但VDAC1與GRP78蛋白的相互作用是否促進了DENV 誘導(dǎo)的細胞凋亡還尚未闡明[38]。目前，本實驗室對VDAC 的研究尚淺，但已發(fā)現(xiàn)鵝胚成纖維細胞（GEF）中的VDAC1 蛋白可與鵝細小病毒（GPV）非結(jié)構(gòu)蛋白NS1相互作用，且VDAC1蛋白參與了NS1 蛋白通過線粒體途徑誘導(dǎo)的細胞凋亡；但調(diào)控VDAC1 蛋白并不影響GPV 的復(fù)制。VDAC1 蛋白直接與病毒的關(guān)鍵蛋白結(jié)合發(fā)揮促凋亡的作用，VDAC1不影響GPV 的復(fù)制，推測這可能與病毒的復(fù)制機制有關(guān)。至今，尚無特別好的措施防制GPV的感染，調(diào)控VDAC1蛋白的表達進而影響細胞凋亡可能是較好的措施，這也將是本實驗室未來的主要研究方向。

多項研究均表明VDAC 蛋白參與了病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡，因此可以從VDAC 蛋白與病毒之間的關(guān)系入手，探究VDAC 蛋白在病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用，可能為研究者提供新的研究方向。

4 展 望

VDAC 蛋白作為線粒體外膜最豐富的蛋白，在病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡中起重要的調(diào)控作用。VDAC 蛋白既可以與Bcl-2 家族中的Bax 和Bak 等促凋亡因子協(xié)同作用調(diào)控Cyt c 的釋放，進而調(diào)節(jié)細胞線粒體凋亡的發(fā)生；也可與抗凋亡因子相互作用起到抗凋亡的作用。多數(shù)病毒在感染宿主細胞時，早期通過抑制細胞凋亡為病毒的復(fù)制創(chuàng)造條件，此時利用VDAC 蛋白與促凋亡因子的相互作用加快宿主誘導(dǎo)的細胞凋亡，可能對抵御病毒的復(fù)制有效；后期病毒通過促凋亡機制殺死更多的宿主細胞并使細胞破碎后釋放病毒，促進子代病毒顆粒的傳播，此時利用VDAC與抗凋亡因子的結(jié)合抑制病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡，可能會抑制病毒的擴散和對宿主的損傷。VDAC 蛋白及其互作蛋白在不同動物細胞中具有凋亡功能，使VDAC 蛋白成為治療動物疾病的理想候選者。此外調(diào)控VDAC 蛋白的表達或使其形成低聚物的治療方法已在多種動物模型中驗證有效。通過調(diào)控VDAC蛋白的表達進而影響細胞凋亡，有望成為多種線粒體疾病新的治療靶點，獸藥的研發(fā)也會因此向前邁出一大步，使其更安全、可靠和有效。