核磁共振技術(shù)在藥物分析鑒定中的應(yīng)用

白 玉，姚會娜，王春燕

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南新鄭 451100）

核磁共振技術(shù)是處于靜磁場中的原子核在另一交變磁場作用下發(fā)生的物理現(xiàn)象，為現(xiàn)代新型技術(shù)。在藥物分析鑒定中，利用該技術(shù)以對其分子結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行整合。相較于其他儀器設(shè)備，該方法具有難以比擬的獨(dú)特優(yōu)勢，因而在藥物真?zhèn)舞b定中，以其定量和定性優(yōu)勢，在確定新藥結(jié)構(gòu)、化合物中間體及其藥物動力學(xué)分析行為上凸顯了明顯的優(yōu)勢。現(xiàn)就核磁共振技術(shù)在藥物分析鑒定中的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述。

1 藥物分析鑒定中核磁共振的應(yīng)用優(yōu)勢

核磁共振法在藥物分析鑒定中，以其對藥物化學(xué)和藥學(xué)的研究優(yōu)勢，成為鑒定分子結(jié)構(gòu)最強(qiáng)有力的工具。加之不對稱合成、手性藥物在開發(fā)研究領(lǐng)域的取得的效果，同時也對藥物測定中的對映體純度、構(gòu)型等提出了更高的要求。

核磁共振技術(shù)在研究領(lǐng)域，以其快速性、可靠性、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，在手性化合物純度和絕對構(gòu)型測定中獲得了突出的效果，同時也在識別機(jī)理、構(gòu)象等層面獲得了突破性的進(jìn)展。在技術(shù)層面，形成了類似于手性衍生化試劑法（Chiral derivatizing agents method）、順磁手性位移試劑法、手性溶劑化試劑等的技術(shù)方法，且獨(dú)具技術(shù)上的優(yōu)勢。

2 該技術(shù)在不同藥物中的分析鑒定成效

2.1 環(huán)氧化酶-2（COX-2）選擇性抑制劑塞來昔布結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

核磁共振譜（NMR）對塞來昔布的元素組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定表明，塞來昔布的化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-[5-（4-甲基苯基）-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺，用以實(shí)現(xiàn)有效解析塞來昔布的光譜特性并推斷其結(jié)構(gòu)，為該類藥物的鑒定及質(zhì)量控制提供條件[1]。塞來昔布基因毒雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振檢測，數(shù)據(jù)如下：1hnmr（dmso-d6400mhz）：7.96（d，2h），7.69（d，2h），7.59（s，2h），7.18（s，1h），7.15（s，4h），2.26（s，3h），其中各峰位移±0.2。具有式ⅰ所示結(jié)構(gòu)的塞來昔布基因毒性雜質(zhì)，化學(xué)名稱為4-（2-氧-5-對甲苯基-3-三氟甲基-吡唑-1-基）-苯磺酰胺，可作為塞來昔布基因毒雜質(zhì)檢測的對照品，用于塞來昔布及其相關(guān)制劑的質(zhì)量研究和檢測控制，制備塞來昔布基因毒性雜質(zhì)。

動物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，通過臨床3.0 T MRI檢測大鼠腦、肝臟，檢測后處死大鼠，取腦、肝臟組織石蠟切片，通過熒光顯微鏡觀察組織內(nèi)熒光，普魯士藍(lán)染色觀察組織內(nèi)鐵粒子位置；結(jié)果表明通過RTPCR和Western blot證實(shí)COX-2在hBMSCs中成功敲除，與對照組比較，MIRB濃度為10μg/mL時標(biāo)記率可達(dá)到90%，當(dāng)濃度上升到20μg/mL時標(biāo)記率可達(dá)到98%。

2.2 抗副溶血弧菌海洋真菌HL-3菌株的鑒定

通過篩選培養(yǎng)基種類和鹽度確定其培養(yǎng)條件。從海螺、小黃魚、對蝦等11種樣品中分離出海洋微生物菌株76株，其中真菌26株；篩選得到一株具有抗副溶血弧菌活性的真菌菌株HL-3，鑒定為黃曲霉。黃曲霉HL-3菌株在改良沙氏培養(yǎng)基條件下，產(chǎn)物化學(xué)多樣性和抗菌活性較好。通過半制備高效液相色譜制備化合物，以核磁共振波譜數(shù)據(jù)來達(dá)到鑒定化合物結(jié)構(gòu)的效果。黃曲霉HL-3菌株在真菌5號培養(yǎng)基中產(chǎn)物單一且抗菌活性較好，純化出來的化合物結(jié)構(gòu)被鑒定為曲酸。曲酸最小抑菌濃度（對副溶血弧菌）為4.0mg/mL[2]。

2.3 氯唑沙宗的質(zhì)量控制

采用制備色譜分離提純獲得高純度的雜質(zhì)E，運(yùn)用HPLC-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC和HMBC等技術(shù)手段對5個雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證；采用Waters XBridge C18柱、流動相、梯度洗脫流速參數(shù)分別為（250mm×4.6mm，5μm）、10mmol/L，醋酸銨溶液-乙腈、1.0mL/min，檢測波長、柱溫分別為220nm、30℃；通過光譜數(shù)據(jù)分析，鑒定出氯唑沙宗原料藥中5個雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，分別為苯并噁唑-2-酮（雜質(zhì)A）、7-氨基-5-氯-苯并噁唑-2-酮（雜質(zhì)B）、2-氨基-5-氯苯酚（雜質(zhì)C）、5-溴-苯并噁唑-2-酮（雜質(zhì)D）、7，7'-氯唑沙宗二聚體（雜質(zhì)E）[3]。在0.24mol/L KH2PO4-Na2HPO4（pH 6.81±0.1）支持電解質(zhì)中，氯唑沙宗于0.80V（vs.SCE）電位處產(chǎn)生一還原波。加入過二硫酸鉀后，該還原波峰電流增加約10倍，峰電位基本不變，產(chǎn)生一極譜催化波。其二階導(dǎo)數(shù)峰電流與氯唑沙宗的濃度在2.0×10-7～8.0×10-5mol/L呈良好線性關(guān)系（r=0.9981，n=8），檢出限為1.0×10-7mol/L。

2.4 九里香中多甲氧基黃酮分離

多甲氧基黃酮類（Polymethoxylated flavonoids，PMFs）化合物廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物中，并且現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多方面藥理活性。而在PMFs化合物結(jié)構(gòu)鑒定的過程中，核磁共振氫譜最為常用且具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特征。利用高效液相色譜技術(shù)對分離產(chǎn)物的純度進(jìn)行分析，利用核磁共振和質(zhì)譜技術(shù)確定分離獲得的5種多甲氧基黃酮的分子結(jié)構(gòu)[4]。

2.5 制霉素中未知成分（RT6）結(jié)構(gòu)

制備的黏度熒光探針溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制成1mmol/L儲備液。從儲備液中取出12μl加入到3mL的離心管當(dāng)中，用PBS和甘油配成不同比例的黏度值，測量其熒光性質(zhì)。熒光光譜與磁共振譜圖顯示，隨著黏度的增加熒光逐漸增強(qiáng)。制霉素原料中存在的未知成分為白諾氏菌素；建立的UHPLC方法可用于制霉素原料藥中白諾氏菌素的測定與控制；經(jīng)NMR和HRMS鑒定，制霉素中未知成分為白諾氏菌素。在建立的色譜條件下，該成分與其他成分分離良好，體外溶出測定實(shí)驗(yàn)中，8 種國產(chǎn)仿制萘普生片在多種溶出介質(zhì)中的溶出曲線與參比制劑溶出曲線均不相似（f2因子均＜50）；體內(nèi)預(yù)測結(jié)果，除參比制劑外，各仿制制劑與實(shí)測數(shù)值差異均較大。從低到高水平下平均回收率分別為103.6%、99.4%和100.1%，RSD分別為0.33%、1.6%和0.90%，3批供成品中白諾氏菌素的含量檢測結(jié)果分別為3.97%、3.41%、3.72%[5]。

3 研究綜述

3.1 藥物或藥物先導(dǎo)化合物中的應(yīng)用

已知含有吡咯并喹啉母核的氨酰胺類家族化合物具有優(yōu)良的抗癌活性，從海綿來源鏈霉菌S52-B中分離鑒定了 3個氨酰胺類化合物，其中一個是新結(jié)構(gòu)化合物，不僅豐富了此類化合物家族的結(jié)構(gòu)類型，也為研究其生物合成途徑中的未知機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，還有利于結(jié)合培養(yǎng)條件和基因組信息從這株海綿來源鏈霉菌中挖掘新結(jié)構(gòu)的活性天然產(chǎn)物。高效液相色譜分離純化后，應(yīng)用高分辨質(zhì)譜和核磁共振光譜進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)解析；確定培養(yǎng)基A～D為海洋鏈霉菌S52-B的優(yōu)勢培養(yǎng)基，基于紫外吸收光譜與質(zhì)譜分析，從培養(yǎng)基A的大量發(fā)酵物中分離鑒定3個具有吡咯并[4，3，2-de]喹啉核心結(jié)構(gòu)的含氯化合物，屬于氨酰胺類天然產(chǎn)物，其中Ammosalic acid為新結(jié)構(gòu)化合物[6]。

3.2 天麻藥材中乳酸脫氫酶抑制劑的分離篩選

以聯(lián)用技術(shù)快速鑒定、篩選、分離天麻藥材中活性化合物。該方法對于篩選乳酸脫氫酶酶抑制劑具有快速和靈敏等優(yōu)勢；核磁共振波譜技術(shù)對其結(jié)構(gòu)鑒定的結(jié)果表明，從天麻藥材中篩選并分離出純度＞90%天麻素、對羥基苯甲醇和巴利森苷A的3個活性成分[7]。

3.3 黑曲霉轉(zhuǎn)化穿山龍皂苷制備

穿山龍皂苷在黑曲霉的共培養(yǎng)下，各原皂苷成分逐日降低，2～3d后產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，該產(chǎn)物經(jīng)分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定為薯蕷皂苷元-α-L鼠李糖（1→4）-β-D葡萄糖苷，系薯蕷皂苷失去末端鼠李糖后得到的短糖鏈甾體皂苷，即prosapogenin B，其轉(zhuǎn)化率為59%。結(jié)果表明， 微生物對穿山龍皂苷的生物轉(zhuǎn)化具有菌種專屬性。黑曲霉Asperillus niger對穿山龍皂苷的生物轉(zhuǎn)化具有結(jié)構(gòu)專一性，轉(zhuǎn)化率極高[8]。

3.4 紅樹林來源的放線菌次級代謝產(chǎn)物資源

從紅樹林土壤中篩選出一株可產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的抗生鏈霉菌ZFSM1-146，并鑒定出3個抗菌活性成分均為放線菌素類化合物，為后續(xù)進(jìn)行放線菌素的產(chǎn)量優(yōu)化和通過分子遺傳手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造提供了寶貴的菌種資源；采用稀釋涂布平板法分離純化紅樹林土壤中的放線菌，通過瓊脂塊法初篩和濾紙片法復(fù)篩獲得具有抗菌活性的放線菌；16S rRNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建確定目標(biāo)放線菌種類；通過高效液相色譜法對目標(biāo)放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，柱層析-高效液相色譜分離技術(shù)結(jié)合的活性追蹤法純化抗菌活性物質(zhì)；經(jīng)高分辨電噴霧電離質(zhì)譜和核磁共振波譜技術(shù)鑒定抗菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)；從紅樹林土壤中篩選到一株抗菌活性較強(qiáng)的放線菌ZFSM1-146，16S rRNA基因序列及其基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析初步確定其為抗生鏈霉菌（Streptomyces antibioticus）；菌株ZFSM1-146可產(chǎn)生抗菌活性化合物1-3，化合物1-3經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為放線菌素XOβ、X2和D。經(jīng)培養(yǎng)基初步優(yōu)化，抗菌活性最強(qiáng)的放線菌素X2的產(chǎn)量約達(dá)到原來的2倍[9]。

4 總結(jié)和展望

在現(xiàn)代科技迅捷發(fā)展的今天，藥物分子生物學(xué)篩選中，核磁共振技術(shù)的應(yīng)用，在環(huán)氧化酶-2（COX-2）選擇性抑制劑塞來昔布結(jié)構(gòu)驗(yàn)證、抗副溶血弧菌海洋真菌HL-3菌株的鑒定、氯唑沙宗的質(zhì)量控制、九里香中多甲氧基黃酮分離、制霉素中未知成分（RT6）結(jié)構(gòu)中得到了充分的證實(shí)，并在藥物或藥物先導(dǎo)化合物中的應(yīng)用、天麻藥材中乳酸脫氫酶抑制劑的分離篩選、黑曲霉轉(zhuǎn)化穿山龍皂苷制備、紅樹林來源的放線菌次級代謝產(chǎn)物資源中具有明顯的優(yōu)勢。綜上所述，核磁共振技術(shù)在藥物鑒定中發(fā)揮著重要的作用，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，可為用藥的安全提供技術(shù)支撐。

5 結(jié)束語

在藥物分析鑒定中，核磁共振技術(shù)以對其超強(qiáng)的結(jié)構(gòu)解析能力，進(jìn)而在藥物結(jié)構(gòu)、中間體化合物及藥物動力學(xué)領(lǐng)域成就突出，并在生物醫(yī)藥領(lǐng)域、食品科學(xué)領(lǐng)域及其環(huán)境醫(yī)學(xué)、海洋等領(lǐng)域中成效突出，并在上述研究中被驗(yàn)證為科學(xué)有效的方法。