PCR檢測技術在動物毛絨分析鑒別中的應用進展

韓 軍，耿 榕，孫 旸，王 超，孫 敬

（北京市產品質量監(jiān)督檢驗研究院/國家紡織及皮革產品質量檢驗檢測中心，北京 100025）

動物毛絨纖維是畜牧業(yè)的重要產品，被公認為高檔的紡織工業(yè)原材料，具有保暖性好、彈性好、吸濕性好、手感柔和等優(yōu)點[1]。毛絨制品的品質極高且具有良好的服用性能和保暖性能，深受廣大人民的喜愛[2]。但是個別生產企業(yè)為了追逐利益、降低成本，將低值、低質的纖維混入動物毛絨中，進而出現(xiàn)含量虛假的動物毛絨制品，破壞了消費市場，損害了人民群眾的利益，因此，準確鑒別毛絨極其重要[3]。傳統(tǒng)的毛絨鑒別方法有顯微鏡法、溶液法和光譜分析法等，但誤判率較高[4]。紡織面料的毛絨有羊毛、羊絨、兔毛、狐貍毛等，由于分屬不同動物，物種間存在基因差別，檢測脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）可以作為鑒定毛絨的有效途徑。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測技術具有特異性好、多態(tài)性強、易于觀察等特點，近年來，已廣泛用于毛絨的鑒別研究。本研究介紹了DNA檢測技術和毛絨基因組DNA提取方式，并對PCR檢測技術在毛絨分析鑒別中的應用進行了簡要綜述。

1 DNA檢測技術

DNA是生物體正常運轉和發(fā)育必不可少的生物大分子，其含有大量生物體所必需的遺傳信息。世界上有羊、熊貓等各類動物，還有微小的病毒、細菌、真菌，這個豐富的世界無一不與DNA有關[5-6]。DNA分子結構呈雙螺旋狀，兩條多脫氧核苷酸鏈圍繞一個中心軸盤繞。脫氧核糖-磷酸鏈在螺旋結構的外面，堿基朝向里面。兩條多脫氧核苷酸鏈反向互補，通過堿基間的氫鍵形成的堿基對相連，形成穩(wěn)定的結構。DNA中的核苷酸的堿基排列順序構成遺傳信息。

DNA不僅存在于生物的細胞核內，還存在于葉綠體和線粒體內，含量較少，需要將其擴增后才能進行相關檢測。PCR最大的特點是能使微量的DNA大幅增加，即在生物體外復制特定的DNA，是一種用于擴增放大特定DNA片段的分子生物學技術[7]。因此，無論是古生物化石還是現(xiàn)在動物或人類的血液、毛發(fā)，只要能分離出微量的DNA，就能用PCR進行放大。PCR是利用DNA在體外95 ℃高溫變性，變成單鏈，在60 ℃左右時引物與單鏈基于堿基互補配對的原則結合，再將溫度調至72 ℃左右，使DNA聚合酶沿著5'→3'的方向合成互補鏈。

DNA檢測技術包括PCR法、分子雜交技術、基于DNA結合蛋白方法、環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）等，其中，廣泛用于毛絨分析鑒別的是PCR法。實時定量PCR法是被眾多分子生物學實驗室廣泛采用的一種方法，其基于PCR擴增，引物和特異性熒光探針同時加入，在增加擴增產物的同時，熒光信號一同增強，通過對PCR體系產生的熒光信號進行實時監(jiān)控并進行定量分析[8]。定量PCR可實時檢測產物含量，且PCR后的處理工序簡便，實驗操作周期短、操作難度較低，檢測結果準確、特異性強。

DNA片段用特異設計的PCR引物擴增目標材料時，若檢測其多態(tài)性，則需要對相應PCR擴增片段進行酶切處理。限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）技術是采用PCR技術擴增目標DNA片段，然后用限制性內切酶將目標檢測DNA進行酶切，限制性內切酶識別特異性DNA序列后進行切割，使用電泳對酶切產物進行分析后，由限制酶圖譜分析次段序列的特異性切位點，通過比對酶切片段的多樣性，實現(xiàn)對不同來源基因序列的差異性分析[9]。簡而言之，就是先將目標DNA片段進行PCR擴增，然后進行限制性內切酶酶切反應，進行電泳分析后再觀察，通過比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。

2 毛絨基因組DNA的提取方法

毛絨基因組DNA抽提的關鍵在于破壞毛絨外層的角質層，進而釋放出毛干中極少量的DNA。常用的毛干DNA提取方法有以下4種：Chelex-100法、PCR法、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）-裂解液法和試劑盒法等。

2.1 Chelex-100法

Chelex-100是一種化學螯合樹脂，主要成分為苯乙烯和二乙烯苯共聚體，含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，可與多價離子進行螯合反應，對高價金屬離子的親和力和螯合作用更強。在堿性、低離子強度和煮沸的條件下，該物質可以使細胞膜破裂，并使蛋白質變性，通過離心操作，可以去除Chelex顆粒，將DNA與Chelex-100結合的物質分離。Chelex-100能有效去除非核酸有機物，可用于提取血痕、全血、精斑、精液、毛發(fā)等樣品中的DNA。呂雪峰等[2]和邵碧英等[3]各自的研究團隊利用Chelex-100法成功提取了羊絨和羊毛中的DNA。劉艷艷等[10]將Chelex-100法與其他提取方法進行比較，并成功提取了狐貍、駱駝、山羊、綿羊等8種動物毛絨的基因組DNA。

2.2 PCR法

PCR法是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術，可以將生物體外的特殊DNA片段進行復制，使微量的DNA大幅增加。使用PCR緩沖液、MgCl2溶液和蛋白酶K為裂解提取液，不僅可以從羊絨毛干中快速提取DNA，還能有效進行PCR擴增[11]。

2.3 DTT-裂解液法

DTT是一種小分子有機還原劑，其用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去保護劑。在DNA溶液中加入DTT，反應一段時間后除去，可以抑制DNA的二聚化。在高濃度DTT條件下，動物纖維經活性蛋白酶K預處理后，被裂解緩沖液裂解而釋放出線粒體DNA，然后用順磁性樹脂將DNA吸附，接著用洗滌緩沖液將樹脂上殘留的雜質洗掉，最后用洗脫緩沖液將樹脂上結合的線粒體DNA洗脫下來，完成羊毛羊絨中DNA的提取[12]。

2.4 試劑盒法

DNA是遺傳信息的載體，是重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，為了進行測序、雜交、基因表達等實驗，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是重要前提，因此，基因組DNA的提取是分子生物學技術中最重要、最基本的操作之一。目前，很多公司能提供用于毛絨基因組DNA提取的試劑盒。邵碧英等[3]使用組織和毛發(fā)DNA提取試劑盒，同時配有蛋白酶K和DTT，成功提取了羊絨和羊毛織品中的DNA。費靜等[13-14]使用Promega DNA IQTM毛發(fā)DNA抽提試劑盒成功提取了兔毛、狐貍毛和羊絨中的DNA。王玫[15]使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0試劑盒對兔毛中的DNA進行了提取。向海等[16]使用進口商業(yè)試劑盒（QIAamp?DNA Investigator）對牦牛、山羊、綿羊等動物毛干纖維中的DNA進行了提取。

3 毛絨的分析鑒別

毛絨的生長受到了遺傳信息的控制，而DNA是遺傳信息的載體，應用DNA檢測技術對毛絨進行分析鑒別正是基于此原理。據研究報道，毛絨的DNA遺傳物質主要存在于線粒體內，所以在鑒別過程中要合理選取遺傳物質。為避免外源生物的干擾，研究人員要非常注重基因組DNA的獲取過程，并不斷提高方法的特異性。PCR檢測技術的精確度很高，但成本高、速度慢，對人員和設備技術要求高。因此，該類方法目前只運用于實驗室中，尚未在行業(yè)內普及[17-19]。

李好磊等[9]采用PCR-RFLP技術，利用提取的羊絨和羊毛線粒體基因組DNA，根據Cytochrome b基因已知的DNA序列設計引物，使用內切酶Ssp Ⅰ進行酶切并得到不同長度片段，借助酶切圖譜鑒別羊毛和羊絨樣品。劉艷艷等[10]針對狐 貍、兔、綿羊、駱駝、山羊等8種動物毛絨，建立了多重實時熒光PCR檢測體系，方法具有特異性強、重復性好和靈敏度高等優(yōu)勢。費靜等[13-14]和Tang等[20]使用實時熒光定量PCR技術，建立羊毛、兔毛、狐貍毛、羊絨、牦牛絨等動物纖維的定量分析方法。王玫等[15]借助熒光定量PCR技術，建立了兔毛定性檢測方法。向海等[16]使用PCR法建立了牦牛、山羊、綿羊等動物毛干纖維中的DNA引物擴增、測序和特異引物擴增檢測的系列方法，可用于毛絨的分析鑒別，具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)勢。陳國培等[21]開發(fā)了適用于羊絨羊毛制品的DNA提取方法，建立了熒光PCR檢測方法，該方法特異性較好、檢出限較低、靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)方法。除上述實驗室研究外，國家市場監(jiān)督管理總局和中國國家標準化管理委員會陸續(xù)發(fā)布了毛絨DNA檢測方法的國家標準，分別是GB/T 36433—2018《紡織品 山羊絨和綿羊毛的混合物DNA定量分析 熒光PCR法》和GB/T 40903—2021《紡織品 DNA分析法鑒別某些特種動物纖維 山羊絨、綿羊毛、牦牛絨及其混合物》，也極大地推動了PCR檢測技術在紡織品檢驗檢測行業(yè)的應用。

4 結語

PCR檢測技術具有設備先進、特異性強、靈敏度高等特點，但也具有成本較高、操作復雜、檢驗周期長、對人員技術水平要求高等劣勢。因此，相關檢測技術尚不能被廣泛運用于紡織品檢測實驗室。但是，開發(fā)和使用DNA檢測方法能實現(xiàn)對傳統(tǒng)毛絨檢驗方法的有效補充，可以作為重要的輔助和確證手段，有助于提高檢測機構的鑒別能力、檢驗水平和準確率。隨著科技水平的不斷提升和DNA檢測方法研究的不斷深入，毛絨檢驗檢測行業(yè)也許很快迎來新時代。