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    辣椒素改善實(shí)驗(yàn)小鼠急性肺損傷氧化應(yīng)激的研究

    2022-12-28 09:41:26李利玲廖慧敏胡金鑫劉鳳曉
    世界中醫(yī)藥 2022年23期
    關(guān)鍵詞:辣椒素內(nèi)毒素肺泡

    李利玲 劉 歡 廖慧敏 胡金鑫 劉鳳曉 趙 棋 高 強(qiáng)

    (1 湖南中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)沙,410208;2 中南大學(xué),長(zhǎng)沙,410083)

    內(nèi)毒素所致肺損傷發(fā)生比較迅速,挽救的時(shí)間窗口比較短暫,同時(shí)肺損傷也是內(nèi)毒素小鼠死亡的主要原因之一。各種因素導(dǎo)致的急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)共同病理改變?yōu)閺V泛嚴(yán)重的肺泡損傷和間質(zhì)性肺水腫,肺泡腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),灌洗液中的炎癥介質(zhì)明顯增多,肺泡上皮細(xì)胞凋亡或死亡[1-2]。內(nèi)皮細(xì)胞學(xué)說(shuō)則認(rèn)為內(nèi)皮或上皮細(xì)胞的凋亡,直接造成了肺泡上皮或內(nèi)皮屏障功能障礙,血管通透性增加,肺水腫加劇[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用腹腔注射內(nèi)毒素方法制造白化的家鼠亞系(Bagg Albino,Laboratory-bred Strain of the House Mouse,BALB/c)小鼠ALI模型,用辣椒素干預(yù)后硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid,TBA)化學(xué)比色法檢測(cè)小鼠丙二醛(Malondiachehyche,MDA)水平;一氧化氮還原酶法測(cè)定氮氧化物(Nitrogen Oxide,NOX)水平;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測(cè)各組小鼠肺組織腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)水平,以及在光鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變,以期為辣椒素干預(yù)內(nèi)毒素所致ALI小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)改善提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物 120只無(wú)特定病原體(Specefic Pathogen Free,SPF)級(jí)BALB/c小鼠,4~6周齡,雄性,體質(zhì)量18~22 g,購(gòu)自武漢蜂鳴生物科技有限公司,動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)許可證號(hào)SCXK(湘)2018-0003,動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(湘)2018-0004。倫理審批號(hào):HN.No20180930b1000120,于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng),給食顆粒飼料,自由飲水,動(dòng)物房溫度(25±1)℃,相對(duì)濕度40%~70%,自然晝夜光照。

    1.1.2 藥物 辣椒素(上海源葉生物科技有限公司,貨號(hào):B2069)和脂多糖(福州奧研實(shí)驗(yàn)器材有限責(zé)任公司,貨號(hào):HX100003929)。

    1.1.2 試劑與儀器 一氧化氮(Nitric Oxide,NO)測(cè)定試劑盒(硝酸還原酶法,南京建成生物工程研究所,貨號(hào)A012)和MDA測(cè)定試劑盒(TBA法,南京建成生物工程研究所,貨號(hào):YBA003-1),TNF-α ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司,貨號(hào):EMC102a)、IL-1β ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司,貨號(hào):EMC001b),4%多聚甲醛組織固定液(長(zhǎng)沙國(guó)昌生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):AR1069)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司,日本,型號(hào):CX23),全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(SLEE公司,德國(guó),CUT6062型號(hào))等,全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司,美國(guó),型號(hào):Multiskan Sky),攤片機(jī)(SKU公司,美國(guó),型號(hào):KD-PⅢ),電熱恒溫培養(yǎng)箱(崢嶸儀器公司,型號(hào):DHP260)等。

    1.2 方法

    1.2.1 分組與模型制備 將小鼠120只采用隨機(jī)數(shù)字法分為4組:正常對(duì)照組,辣椒素對(duì)照組,內(nèi)毒素急性肺損傷組,辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組,每組30只。

    1.2.2 給藥方法 正常對(duì)照組:小鼠腹腔注射生理鹽水,分別于干預(yù)后22 h、4 h、6 h時(shí)麻醉處死;辣椒素對(duì)照組:先給小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg,30 min后腹腔注射生理鹽水,分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h時(shí)麻醉處死;急性肺損傷組:給小鼠腹腔注射內(nèi)毒素10.0 mg/kg,構(gòu)建ALI模型,分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h分批麻醉處死;辣椒素干預(yù)組:先小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg,30 min后腹腔注射內(nèi)毒素10.0 mg/kg,分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h分批麻醉處死。以上各組處死后取肺組織,固定于4%多聚甲醛中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

    1.2.3.1 比色法檢測(cè)MDA含量 按照實(shí)驗(yàn)分組,取10%肺組織勻漿,用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法測(cè)定其蛋白含量,采用比色法,檢測(cè)肺組織MDA水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基能通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物MDA引起細(xì)胞損傷。因而測(cè)試MDA的量常??砷g接地反映出細(xì)胞損傷的程度。過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合,形成紅色產(chǎn)物,在532 nm處有最大吸收峰。實(shí)驗(yàn)取樣品100 μL,按比例加入試劑一、試劑二、試劑三,旋渦混勻器混勻,95 ℃水浴40 min,3 500~4 000 r/min,離心半徑10 cm,離心10 min,取上清100 μL,532 nm處,測(cè)各管光密度(Optical Density,OD)值。見(jiàn)表1。

    1.2.3.2 NO還原酶法檢測(cè)NOX水平 按照實(shí)驗(yàn)分組,摘眼球取血,離心取血清,用NO還原酶法測(cè)定NOX水平,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。取血清原液100 μL,按步驟加入樣本一100 μL,樣本二200 μL,混合試劑,37 ℃水浴60 min,再加入R3、R4,抽提室溫靜置40 min,3 500~4 000 r/min,離心半徑10 cm,離心10 min,取上清160 μL,加入顯色劑,靜置10 min,550 nm測(cè)各管OD值。見(jiàn)表2。

    1.2.3.3 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平 按照實(shí)驗(yàn)分組,取10%肺組織勻漿,用BCA法測(cè)定其蛋白含量,采用QuantiCyto? ELISA試劑盒雙抗夾心法檢測(cè)肺組織TNF-α和IL-1β水平,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作??剐∈骉NF-α和IL-1β單抗包被于酶標(biāo)板上,標(biāo)本中的TNF-α和IL-1β與單抗結(jié)合,洗滌,加入生物素化的抗小鼠TNF-α和IL-1β抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素,洗滌,加入顯色底物,洗滌,加終止液,若陽(yáng)性則顯黃色,陰性無(wú)色,在450 nm處測(cè)OD(光密度)值。見(jiàn)表3~4。

    1.2.4 病理學(xué)觀察 按照實(shí)驗(yàn)分組,將肺組織于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,進(jìn)行切片和HE染色,在放大400倍光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

    2 結(jié)果

    2.1 辣椒素干預(yù)前后小鼠肺組織MDA、NOX、TNF-α、IL-1β比較 與正常對(duì)照組比較,內(nèi)毒素組小鼠肺組織MDA水平明顯升高(P<0.05),辣椒素對(duì)照組則變化不明顯(P>0.05),與內(nèi)毒素組比較,辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組小鼠肺組織MDA水平在2 h、4 h、6 h明顯降低(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較,內(nèi)毒素組小鼠肺組織NOX水平明顯升高(P<0.05),辣椒素對(duì)照組則無(wú)明顯變化(P>0.05),與內(nèi)毒素組比較,辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組肺組織NOX水平在4 h、6 h明顯降低(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較,內(nèi)毒素組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05),辣椒素對(duì)照組則變化不明顯(P>0.05),與內(nèi)毒素組比較,辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組小鼠肺組織在4 h、6 h TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各組小鼠肺組織MDA、NOX、TNF-α、IL-1β水平變化及辣椒素干預(yù)結(jié)果

    2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 光鏡下,正常對(duì)照組、辣椒素組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡腔內(nèi)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)出血或有少量出血,肺間質(zhì)無(wú)明顯滲出;急性肺損傷組2 h損傷不明顯,但4 h、6 h可見(jiàn)肺泡腔大小不等,部分肺泡壁斷裂呈氣腫狀,部分增寬,肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張,部分肺泡內(nèi)可見(jiàn)出血,肺間質(zhì)水腫,可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);與急性肺損傷組比較,辣椒素干預(yù)組肺泡壁增厚、毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺間質(zhì)水腫程度均明顯減輕。見(jiàn)圖1。

    圖1 不同組別不同處理時(shí)間小鼠肺組織病理學(xué)變化(HE染色,×400)

    3 討論

    ALI是呼吸系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的導(dǎo)致死亡的原因之一,同時(shí)ALI也是肺炎和急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)等其他疾病發(fā)展的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[4-5]。由于其病情發(fā)展迅速同時(shí)病死率較高,其發(fā)病機(jī)制仍處于探討之中,同時(shí)缺乏明確的治療手段,因此目前在呼吸疾病中越來(lái)越受到重視。

    此前已有研究表明氧自由基損傷是ALI的一個(gè)重要因素,其細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的降解產(chǎn)物主要就是MDA,其大小可以間接反映細(xì)胞氧化損傷的程度[6]。降低ALI細(xì)胞和大鼠模型中MDA和NO的水平,抑制SOD活性,可明顯減輕內(nèi)毒素所致的肺組織病理改變[7],本研究中小劑量辣椒素作用于ALI模型小鼠后可降低血清MDA水平,可以在一定程度上減輕ALI造成的氧化應(yīng)激損傷。

    Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)辣椒素對(duì)小鼠體內(nèi)的2種NO合酶均有促進(jìn)作用。而Demirbilek等[9]采用不同劑量辣椒素干預(yù)膿毒癥大鼠,發(fā)現(xiàn)小劑量辣椒素可以抑制大鼠血清NOX水平,但具體機(jī)制不明。唐婧等[10-11]研究不同處理因素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后相關(guān)炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響,明確辣椒素的抗炎效應(yīng)表明辣椒素具有抗炎的作用,并發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)受體辣椒素電位1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1)是辣椒素在治療ALI/急性呼吸窘迫綜合征作用中的新靶點(diǎn)。南超等[12]初步研究過(guò)辣椒素對(duì)小鼠ALI氧化應(yīng)激的影響,測(cè)定了辣椒素作用下肺組織SOD、MDA以及血紅素氧合酶等的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)辣椒素有改善小鼠ALI氧化應(yīng)激的作用,但沒(méi)有進(jìn)一步測(cè)定NOX、TNF-α、IL-1β等與氧化應(yīng)激相關(guān)關(guān)鍵因子的表達(dá)變化,因此本研究的完成對(duì)于進(jìn)一步探索辣椒素改善小鼠ALI氧化應(yīng)激的作用就顯得特別有意義。

    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)NOX水平變化趨勢(shì)為急性肺損傷組>辣椒素加急性肺損傷組>辣椒素組>正常對(duì)照組。血漿NOX水平的升高可能與多器官衰竭的發(fā)生有關(guān),小劑量的辣椒素降低了ALI小鼠血漿中的NOX水平,其可能的機(jī)制是小劑量的辣椒素干預(yù)可能使小鼠產(chǎn)生較小數(shù)量的細(xì)胞因子,例如TNF-α、IL-1β等,從而減少NOX產(chǎn)生。

    目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為,內(nèi)毒素注射入人體后會(huì)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS),刺激機(jī)體釋放炎癥介質(zhì),從而引發(fā)瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng),使肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,間隙增大,大分子物質(zhì)透過(guò)血管進(jìn)入肺間質(zhì)及肺泡內(nèi),從而引起肺部一系列的病理生理改變[13-14]。內(nèi)毒素引起ALI動(dòng)物肺泡腔和間質(zhì)中性粒細(xì)胞募集、肺泡壁變薄和蛋白水腫液聚集在肺泡腔[15-16];上皮細(xì)胞在動(dòng)物注入內(nèi)毒素后迅速凋亡并先于其他組織損傷發(fā)生[17]。

    在實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)腹腔注射辣椒素觀察其對(duì)內(nèi)毒素所致ALI小鼠的改善作用,結(jié)果顯示,辣椒素能夠降低實(shí)驗(yàn)小鼠中血清的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的水平,同時(shí)提高抗炎癥介質(zhì)水平,說(shuō)明了辣椒素可以調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)及抗炎癥介質(zhì)的平衡,從而減輕炎癥反應(yīng),發(fā)揮對(duì)肺組織的保護(hù)作用。

    本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,辣椒素能調(diào)控炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β等的釋放,減輕內(nèi)毒素所致肺損傷的炎癥程度,降低ALI小鼠肺組織MDA和NOX水平,從而阻斷肺損傷繼續(xù)進(jìn)展為ALI/ARDS,因而小劑量辣椒素對(duì)ALI有一定的保護(hù)作用。目前已有研究人員從磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB)以及核因子κB等信號(hào)通路對(duì)黃酮類(lèi)等對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠ALI的保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了研究[18-20]。下一步我們擬繼續(xù)對(duì)辣椒素改善實(shí)驗(yàn)小鼠ALI氧化應(yīng)激的機(jī)制進(jìn)一步研究。

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