柴胡龍骨牡蠣湯下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)氧合酶-2/前列腺素E2的表達(dá)

單 萍 張繼龍 笱玉蘭 羅利俊

(湖北省武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢，430022)

癲癇是一種全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]，它影響了世界所有地區(qū)的各個(gè)年齡階段的人類(lèi)健康。任何引起大腦生理結(jié)構(gòu)或功能紊亂的因素都能導(dǎo)致癲癇，且可發(fā)生于人的任何階段[2]。癲癇以自發(fā)性發(fā)作為特征[3]，其發(fā)作是一種涉及部分或整個(gè)身體的短暫不自覺(jué)顫抖，有時(shí)伴有意識(shí)喪失，且癲癇發(fā)作的強(qiáng)度和頻率都有差異[4]。研究發(fā)現(xiàn)，目前抗癲癇藥物已無(wú)法控制20%～30%具有藥物抵抗性的難治性癲癇發(fā)病[5]。因此，尋找具有較好療效且不良反應(yīng)少的抗癲癇藥尤為重要，而中醫(yī)學(xué)可成為抗癲癇藥物的替代品[4]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)控制細(xì)胞外空間體積以及離子和神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)突觸的活動(dòng)，當(dāng)其出現(xiàn)功能障礙時(shí)，可導(dǎo)致神經(jīng)功能發(fā)生重大改變，從而參與了癲癇的發(fā)病機(jī)制[6-7]。柴胡龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》，具有較好的抗癲癇作用，且與柴胡龍骨牡蠣湯的劑量正相關(guān)[8-9]。課題組前期研究結(jié)果顯示：柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)點(diǎn)燃癲癇小鼠的大腦神經(jīng)元具有保護(hù)作用[10]，但柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的具體作用機(jī)制并未闡明。因此，本研究將使用PTZ刺激小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，用不同劑量的柴胡龍骨牡蠣湯處理后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)情況，初步探討柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取60只孕20 d的清潔級(jí)小鼠，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)：HLK-20181118-02。飼養(yǎng)溫度為22～26 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h，自由飲水、飲食。

1.1.2 藥物 柴胡龍骨牡蠣湯(柴胡12 g，龍骨、黃芩、生姜、鉛丹、人參、桂枝、茯苓、牡蠣各4.5 g，半夏、大黃各6 g，大棗6枚)由我院中藥制劑中心釆用水煮醇提法制備，提取濃縮成含生藥為1 g/mL的柴胡加龍骨牡蠣湯，置于冰箱中備用。

1.1.3 材料與儀器 PTZ(美國(guó)Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：P6500-25G)；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)(美國(guó)Hyclone公司，美國(guó)，貨號(hào)：SH30022.01B)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，美國(guó)，貨號(hào)：10270-106)；0.25%胰蛋白酶、抗熒光衰減封片劑(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)、小鼠前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析試劑盒和小鼠環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(中國(guó)Bioswamp公司，貨號(hào)：PAB180002、PAB180018、MU30391、MU30589)；小鼠抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)單克隆抗體、兔抗COX-2多克隆抗體和兔抗PGE2受體(Prostaglandin E Receptor 2，PTGER2)(英國(guó)Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab10062、ab52237、ab167171)；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體(美國(guó)CST公司，美國(guó)，貨號(hào)：2118)；聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜和化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)Millipore公司，美國(guó)，貨號(hào)：IPVH00010、WBKLS0010)。超凈工作臺(tái)(蘇州金凈凈化設(shè)備公司，型號(hào)：SW-CJ-2D)；顯微鏡(日本Nikon公司，型號(hào)：TS100-F)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司，日本，型號(hào)：AX53)；酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司，芬蘭，型號(hào)：MK3)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司，型號(hào)：Tanon-5200)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞分離及培養(yǎng) 取孕20 d的清潔級(jí)小鼠，處死后取出胎鼠，乙醇消毒后取出海馬組織于含DMEM的離心管中。將組織剪成1 mm3的組織塊，0.25%胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM終止消化，175× g，離心5 min，棄上清，并用DMEM重懸細(xì)胞。使用200目孔徑的不銹鋼網(wǎng)除去未消化組織，收集細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM中，培養(yǎng)90 min后采用差速貼壁分離技術(shù)去除成纖維細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液，以后隔3 d換1次。待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 將單細(xì)胞懸液接種于放置有細(xì)胞爬片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過(guò)夜。取出培養(yǎng)皿，磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗后加入4%多聚甲醛固定30 min。加入0.5% Triton X-100室溫通透20 min，再加入5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)封閉1 h。加入一抗稀釋液(GFAP稀釋比1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS清洗后加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h后，PBS清洗。取一塊干凈的載玻片，滴一滴抗熒光衰減封片劑(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)。用鑷子取出蓋玻片，吸去多余的液體，細(xì)胞朝下，貼在載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 分組及處理 將鑒定成功的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞以5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、PTZ組、PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組和PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組。PTZ組采用10 mmol/L的PTZ刺激細(xì)胞2 h。PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組和PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組細(xì)胞在10 mmol/L PTZ刺激2 h后，分別采用10 mg/L和20 mg/L的柴胡龍骨牡蠣湯預(yù)處理細(xì)胞6 h，再用10 mmol/L PTZ刺激2 h。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)COX-2/PGE2水平 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清于450 nm處的光密度(Optical Density，OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到直線回歸方程式后計(jì)算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中COX-2和PGE2濃度，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PGE2表達(dá)水平 采用放射免疫沉淀試驗(yàn)(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)裂解試劑盒(材料部分未提及)提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后取20 μg上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗稀釋液(COX-2稀釋比：1∶1 000；PTGER2稀釋比：1∶5 000；GAPDH稀釋比：1∶1 000)，室溫孵育1 h。清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h后清洗。將膜置于暗室中，加入化學(xué)發(fā)光試劑，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定 分離培養(yǎng)的小鼠原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，大部分細(xì)胞胞突外伸，且長(zhǎng)短不一。見(jiàn)圖1A。免疫熒光染色顯示，細(xì)胞呈GFAP陽(yáng)性表達(dá)，鑒定細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。見(jiàn)圖1B。

圖1 海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)

2.2 柴胡龍骨牡蠣湯對(duì)COX-2和PGE2的影響 與對(duì)照組比較，PTZ組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的COX-2和PGE2濃度顯著升高(P<0.01)；與PTZ組比較，PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組、PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的COX-2和PGE2濃度均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.01)，且PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組更明顯(P<0.01)，有劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 各組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中COX-2和PGE2濃度比較

與對(duì)照組比較，PTZ組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞COX-2/PTGER2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。而經(jīng)過(guò)柴胡龍骨牡蠣湯干預(yù)后，顯著抑制了PTZ組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PTGER2的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，且有一定的劑量依賴(lài)性，PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組效果更明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞COX-2和PTGER2蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

由于長(zhǎng)期服用西藥抗癲癇，產(chǎn)生多種不良反應(yīng)，導(dǎo)致部分患者不能耐受，使得中藥治療癲癇受到了醫(yī)學(xué)界越來(lái)越多的關(guān)注[11]。大量研究顯示中醫(yī)藥在抗癲癇方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[12-15]。柴胡加龍骨牡蠣湯可協(xié)調(diào)陰陽(yáng)、祛痰調(diào)氣、定志攝神，令癇癥不作[9]。研究顯示，柴胡龍骨牡蠣湯具有多系統(tǒng)、多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，有較好的抗癲癇療效[16-17]。柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇作用機(jī)制的研究報(bào)道較少，因此，本研究對(duì)其抗癲癇機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

癲癇發(fā)作后會(huì)發(fā)生星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而激活后的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥介質(zhì)等，對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用，進(jìn)而在癲癇、帕金森病、缺血性腦損傷等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[18]。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化可作為癲癇的病理標(biāo)志，可能成為藥物治療癲癇的新靶點(diǎn)[19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PTZ可誘導(dǎo)小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，本研究在PTZ誘導(dǎo)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)了星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)COX-2/PGE2的表達(dá)。

COX-2是炎癥反應(yīng)激活指標(biāo)，在癲癇發(fā)作過(guò)程中，COX-2表達(dá)上調(diào)，其過(guò)度表達(dá)通常與急性條件下的神經(jīng)毒性和組織損傷有關(guān)[20-21]。COX-2激活后可促進(jìn)癲癇活動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷死亡，降低癲癇發(fā)作的閾值，進(jìn)而促進(jìn)癲癇的反復(fù)發(fā)作，而阻斷COX-2的信號(hào)級(jí)聯(lián)后可提高抗癲癇藥物的腦滲透能力并克服耐藥性[22-23]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示COX-2與難治性癲癇有密切的關(guān)系，干預(yù)COX-2炎癥反應(yīng)通路可能成為治療難治性癲癇的治療方向[24]。組織受損誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大量花生四烯酸釋放，而COX可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素[25]。PGE2作為COX-2炎癥反應(yīng)通路中一種重要的炎癥效應(yīng)物，在多種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括癲癇)中，通過(guò)其受體亞型EP2(前列腺素類(lèi)激素受體)介導(dǎo)大腦炎癥和組織損傷[21]。Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，COX-2/PGE2信號(hào)通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷是PTZ點(diǎn)燃癲癇小鼠認(rèn)知功能障礙的原因之一，認(rèn)為在癲癇患者的大腦中靶向COX-2/PGE2信號(hào)通路可能會(huì)產(chǎn)生減輕神經(jīng)元損傷和預(yù)防認(rèn)知功能障礙的效果。本研究結(jié)果顯示，PTZ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PGE2通路表達(dá)顯著升高，經(jīng)過(guò)不同劑量的柴胡龍骨牡蠣湯治療后，COX-2、PGE2表達(dá)下調(diào)，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量效果更明顯，提示柴胡龍骨牡蠣湯可有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PGE2信號(hào)通路的表達(dá)水平。

綜上所述，柴胡龍骨牡蠣湯可下調(diào)PTZ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞COX-2/PGE2信號(hào)通路的表達(dá)，該作用可能參與了柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的作用機(jī)制。