多元統(tǒng)計方法初步分析陜西產(chǎn)艾葉中揮發(fā)性成分特征

王春柳 萬兆新 周 潔 安玉葉 龍凱花 劉 洋 張 紅 李 曄 蘇同生

(1 陜西省中醫(yī)藥研究院，西安，710003；2 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安，710003；3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽，712046)

艾草，又稱艾、艾葉、冰臺、艾蒿、醫(yī)草、灸草，是一種集藥品、食品、保健品和文化特征于一體的藥用植物[1-2]。最早關(guān)于艾的記載源于《詩經(jīng)》中“彼采艾兮，一日不見，如三歲兮”[3]。兩千多年來，艾草一直以各種身份出現(xiàn)在我國人民的生活中，不僅具有傳統(tǒng)醫(yī)用用途，在日用品、食品、保健品中也有大量應(yīng)用，市場潛力巨大。不斷增長的市場需求也對艾條和艾葉的產(chǎn)量及質(zhì)量控制提出了更高的要求，但目前我國艾草產(chǎn)業(yè)發(fā)展還處于極不平衡的狀態(tài)，品牌知名度較高的湖北蘄春和河南南陽區(qū)域艾草供不應(yīng)求[4-5]，全國大面積艾草種植和規(guī)?；N植分布嚴(yán)重不均，難以滿足全國驟增的市場需求。此外，艾葉及藥用艾條的質(zhì)量控制目前還不完善，制約了艾草行業(yè)整體的發(fā)展水平。陜西是艾葉的眾多產(chǎn)區(qū)之一，本草學(xué)考證可歸于古代“北艾”產(chǎn)區(qū)范圍內(nèi)[1，6]，在地理環(huán)境方面，陜西境內(nèi)覆蓋了艾草最適宜生長的北緯33°～36°范圍[7]，非常適宜艾草生長。因此，在艾葉市場及陜西艾葉產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的推動下，積極開展艾葉的現(xiàn)代研究對于艾葉的質(zhì)量控制具有重大意義。本文基于氣相色譜-質(zhì)譜(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS)聯(lián)用技術(shù)，對陜西代表性產(chǎn)區(qū)的艾葉樣本進(jìn)行了揮發(fā)性成分鑒定及多元統(tǒng)計分析，為陜西產(chǎn)艾葉的科學(xué)質(zhì)量控制方法的建立及物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供部分參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 手提式高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司，型號：DFT-200A)；萬分之一分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，型號：Sartorius BP61]；超聲波清洗機(jī)[小美超聲儀器(昆山)有限公司，型號：XM-P22H]；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀[島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司，型號：QP2010 Plus]。

1.2 試劑 實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.3 分析樣品 艾葉樣品來自各產(chǎn)區(qū)樣本分別于端午前1周采集，陰干后在密閉、25 ℃恒溫保存約1個月后統(tǒng)一分析。所有樣本經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所黨秋萍副研究員鑒定為艾葉。艾葉樣本產(chǎn)地信息見表1。

表1 艾葉樣本產(chǎn)地信息

2 方法

2.1 樣本制備 取陰干艾葉適量，采用多功能粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉，精密稱取100 g于圓底燒瓶中，加水1.2 L，以揮發(fā)油提取裝置提取5 h，提取完畢讀取揮發(fā)油體積后收集揮發(fā)油部分，經(jīng)一次性注射器含0.22 μm的有機(jī)濾膜的濾頭濾過后直接進(jìn)行分析。

2.2 樣本分析 采用島津GC-MS-QP2010 Plus氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行樣品分析，色譜及質(zhì)譜參數(shù)如下。色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；升溫梯度：80～10 ℃/min，300 ℃，5 min；分流比：30∶1；恒線速度模式：30 cm/s；載氣：He；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：300 ℃；進(jìn)樣口溫度：300 ℃；質(zhì)量掃描范圍：m/z 29～550；進(jìn)樣量：0.4 μL。

2.3 數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Nist 2017標(biāo)準(zhǔn)譜庫，經(jīng)手動扣除背景干擾信息及解卷積后進(jìn)行碎片離子信息比對，選取匹配度最高的成分進(jìn)行確認(rèn)，整理成分峰面積矩陣表。以所鑒定的共有成分作為樣本信息，比較蘄春產(chǎn)艾葉與陜西產(chǎn)艾葉樣本的共性和差異。將21個樣本的峰面積矩陣表導(dǎo)入Origin 2021，選擇中位數(shù)聚類法、平方Euclidean距離作為聚類參數(shù)，導(dǎo)出樹狀圖分類結(jié)果。以揮發(fā)性成分峰面積為樣本特征，以產(chǎn)地為變量，按照陜西和蘄春2個產(chǎn)地預(yù)先對樣本進(jìn)行分組，整理數(shù)據(jù)矩陣，采用MetaboAnalyst 5.0對21批艾葉樣本原始數(shù)據(jù)分別經(jīng)過平方根轉(zhuǎn)換、帕累托轉(zhuǎn)換，得到標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)矩陣后分別進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)[8]及有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA)[9]。PLS-DA模型進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證(Cross Validation)。最后，采用Origin 2021軟件單獨(dú)對陜西15個樣本進(jìn)行主成分分析，提取陜西產(chǎn)艾葉中揮發(fā)性成分的主成分特征，數(shù)據(jù)以主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率進(jìn)行評價。

3 結(jié)果

3.1 艾葉樣本中揮發(fā)性成分鑒定 樣本中成分的離子流主要集中于10～20 min之間，25 min后基本無色譜峰，說明樣本中成分已經(jīng)充分離子化。樣本GC-MS總離子流見圖1。初步鑒定到13個共有成分，匹配度均大于80。揮發(fā)性成分MS信息見表2。

圖1 艾葉樣本GC-MS總離子流圖

表2 揮發(fā)性成分MS信息

3.2 蘄春與陜西產(chǎn)艾葉樣本揮發(fā)性共有成分的整體聚類分析比較 所分析的21批次艾葉，以揮發(fā)性共有峰為主要特征，大體可聚為3類，其中8號(陜南)與12號(陜南)、17號(關(guān)中)、13號(陜南)距離較近，聚為一類，16號(關(guān)中)與其他所有樣本都較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一類，蘄春樣本與所有陜北樣本、部分陜南、關(guān)中樣本聚為一類。見圖2。

圖2 蘄春與陜西產(chǎn)艾葉樣本聚類分析

3.3 蘄春與陜西產(chǎn)艾葉樣本揮發(fā)性共有成分的整體多元分析比較 由各產(chǎn)地樣本的PCA積分圖(圖3-A)的分布可知，蘄春和陜西產(chǎn)地樣本特征整體重疊，蘄春樣本(紅色圓點(diǎn))與陜西3個產(chǎn)區(qū)樣本(綠色圓點(diǎn))沒有顯示出明顯分簇的狀態(tài)，說明在整體特征上蘄春樣本與陜西3個區(qū)域樣本未能體現(xiàn)出差異。PLS-DA得分圖也可發(fā)現(xiàn)蘄春和陜西產(chǎn)地樣本依然沒有明顯的分簇(圖3B)。為了驗(yàn)證PLS-DA模型的預(yù)測性能，對所建立的PLS-DA模型進(jìn)行了內(nèi)部交叉驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在基于各主成分的驗(yàn)證中，模型的R2值均在0.5以下，Q2值出現(xiàn)負(fù)值(見圖3-C)，這說明基于蘄春和陜西2個產(chǎn)地分組而建立的PLS-DA模型不能顯示出2組樣本的差異，對樣本進(jìn)行分組的模型建立不成功，從反面證實(shí)了PCA分析的結(jié)果。

圖3 蘄春與陜西產(chǎn)艾葉樣本揮發(fā)性共有成分的PCA、PLS-DA分析

3.4 陜西產(chǎn)艾葉樣本中揮發(fā)性特征成分的主成分分析 總方差的76.04%貢獻(xiàn)來自于主成分1，11.05%來自于主成分2，5.97%來自于主成分3，主成分1、2、3累計貢獻(xiàn)了93.06%的方差，主成分1和主成分2合計貢獻(xiàn)了87.09%方差，從統(tǒng)計出的累計方差結(jié)果來看，主成分1和主成分2已經(jīng)基本可代表陜西產(chǎn)樣本的主要特征，主成分1、2、3合起來能夠更加全面代表陜西產(chǎn)艾葉樣本的特征。見圖4。對主成分1貢獻(xiàn)率較大(系數(shù)大于0.6)的成分是α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龍腦、側(cè)柏酮；對主成分2貢獻(xiàn)率較大(系數(shù)大于0.6)的成分有薄荷醇、丁香酚、龍腦；對主成分3貢獻(xiàn)率較大的成分有香芹酮、γ-松油烯。此部分的主成分分析結(jié)果表明，陜西不同產(chǎn)地艾葉中最主要的揮發(fā)性特征成分有α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龍腦、側(cè)柏酮、薄荷醇、丁香酚、香芹酮、γ-松油烯。其中位于第1主成分的α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龍腦、側(cè)柏酮是本文基于多元統(tǒng)計分析得到的核心成分群。

圖4 陜西產(chǎn)艾葉樣本主成分分析

4 討論

本文對陜西代表性產(chǎn)區(qū)的艾葉樣本進(jìn)行了揮發(fā)性成分鑒定及多元統(tǒng)計分析，以期初步得到陜西產(chǎn)艾葉中揮發(fā)性成分特征。基于21批次的艾葉中的共有性揮發(fā)性成分，分別進(jìn)行了聚類分析、整體多元統(tǒng)計分析和PCA。PCA是一種無監(jiān)督的分析方法，默認(rèn)所有樣本對模型有著同樣的貢獻(xiàn)進(jìn)行分析，當(dāng)樣本的組間差異較大，而組內(nèi)差異較小時，無監(jiān)督分析方法可以明顯區(qū)分組間差異，當(dāng)樣本的組間差異不明晰，而組內(nèi)差異較大時，無監(jiān)督分析方法難以發(fā)現(xiàn)和區(qū)分組間差異。本文首先按照產(chǎn)地進(jìn)行分組，分析蘄春組和陜西產(chǎn)艾葉2組的組間差異發(fā)現(xiàn)，PCA無法得出2組樣本之間的差異，造成上述結(jié)果有2種可能，一種是2個產(chǎn)地樣本之間確實(shí)沒有統(tǒng)計意義上的顯著差異，另一種可能是由于組內(nèi)差異大于組間差異，此時采用PCA得出的結(jié)論將不合理。PLS-DA是一種有監(jiān)督的分類模型，能夠很好地解決無監(jiān)督分析中遇到的這些問題。但為了避免PLS-DA模型存在的過擬合風(fēng)險，常常采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行輔助評價所建立模型的預(yù)測性能[10]，內(nèi)部交叉驗(yàn)證的參數(shù)Q2數(shù)值越大則表示模型的預(yù)測能力越好[11]。一般情況下，模型具備良好的預(yù)測性能要求Q2至少大于0.5[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Q2始終是負(fù)值，說明此處所建立的PLS-DA模型不能具備預(yù)測組間差異的可靠性能，也可以說從另一角度也說明了組間差異沒有達(dá)到足以忽略組內(nèi)差異，達(dá)到組間區(qū)分的程度。從PCA和PLS-DA結(jié)果均可以看出，陜西的15批次艾葉之間組成的團(tuán)簇面積較大，說明陜西各個產(chǎn)地艾葉之間也具有一定差異，部分地區(qū)樣本與蘄春樣本較為接近，另一部分則區(qū)別較明顯，這可能也是造成陜西產(chǎn)艾葉與蘄春產(chǎn)艾葉整體特征無差異的原因之一。此外，本文基于蘄春與陜西15個批次艾葉中共有成分進(jìn)行了PCA、PLS-DA，對于陜西或蘄春艾葉中的特有成分目前無法共同分析，后期還將繼續(xù)就蘄春產(chǎn)艾葉和其他產(chǎn)區(qū)艾葉的共性和特性開展工作。

目前，2020版《中華人民共和國藥典》中對于艾葉的質(zhì)量控制，僅限于桉油精和龍腦2個成分。本文基于主成分分析得出了在統(tǒng)計學(xué)意義上陜西產(chǎn)艾葉中的對主成分具有較大貢獻(xiàn)的成分，可為陜西產(chǎn)艾葉的進(jìn)一步質(zhì)量評價研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其中有不少成分也是文獻(xiàn)[14-17]報道的與艾葉藥理活性相關(guān)的成分，如龍腦具有抑菌、鎮(zhèn)靜安神等藥效作用，與艾葉的整體藥效作用相關(guān)。α-松油醇對指狀青霉抑霉唑抗性菌株P(guān)dw03具有明顯抑制作用[18]。側(cè)柏酮是一種類單萜酮[19]，是從金鐘柏中分離得到的酊類能增強(qiáng)脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-2、γ干擾素)的作用，具有抗腫瘤能力[20]。此外，α-石竹烯、氧化石竹烯被報道具有鎮(zhèn)痛抗炎活性等[21-22]，β-蒎烯已被證實(shí)具有抑菌、殺蟲、抗腫瘤活性，α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉油醇、莰烯具有保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷；丁香酚、芳樟醇、紫蘇醛的抗氧化、抗菌、抗腫瘤等藥理活性均與艾葉的藥理活性高度相關(guān)[23-26]。

本文僅從6批蘄春產(chǎn)艾葉和15批陜西產(chǎn)艾葉的13個共有性揮發(fā)性成分入手，初步的多元統(tǒng)計分析沒有發(fā)現(xiàn)陜西產(chǎn)艾葉與蘄春產(chǎn)艾葉在共性成分特征上有顯著差異，可為陜西產(chǎn)艾葉質(zhì)量研究提供初步依據(jù)；但在今后的研究中，還需要對2個產(chǎn)地艾葉的差異性成分特征進(jìn)行進(jìn)一步分析，從而對陜西產(chǎn)艾葉的全面質(zhì)量控制提供更加全面的數(shù)據(jù)支撐。

5 結(jié)論

本文采用GC-MS方法分析了蘄春及陜西產(chǎn)21批艾葉樣本中揮發(fā)性成分，并以揮發(fā)性共有峰為樣本特征，通過樣本的聚類分析、PCA、PLS-DA和對成分的PCA，初步發(fā)現(xiàn)：陜西產(chǎn)艾葉與蘄春產(chǎn)艾葉在13個揮發(fā)性共有成分特征方面，沒有明顯差異；陜西產(chǎn)艾葉揮發(fā)性成分的主要特征成分有α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龍腦、側(cè)柏酮、薄荷醇、丁香酚等。