CNPY2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α通路在有氧運動干預(yù)非酒精性脂肪性肝病中的作用

李軍漢 王佳倩 李亞龍 蔣昌君

成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院（成都 610041）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[1]。大多數(shù)NAFLD 患者有單純性脂肪肝（肝臟輕度脂肪性變），少數(shù)患者發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，并可逐步發(fā)展為肝硬化和肝癌[2]。在過去的幾十年里，NAFLD 是全球最常見的慢性肝病之一，也被認(rèn)為是肝酶異常的最常見原因[3]。隨著肥胖和糖尿病的日益流行，NAFLD 的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐漸上升[4]。目前，NAFLD 的治療方法主要包括服用減肥藥物、實施減肥手術(shù)以及采用胰島素增敏劑、降脂劑、抗氧化劑、益生菌、抗腫瘤壞死因子藥、細胞保護劑和其他新藥等[5]。 NAFLD 在臨床治療上尚無特效藥[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，NAFLD 的發(fā)生與久坐少動呈正相關(guān)。近期文獻[7]報道，飲食調(diào)整和運動等包含在內(nèi)的生活方式改變?yōu)橹委烴AFLD 的首選方法。研究發(fā)現(xiàn)[8]，運動可有效改善NAFLD。但迄今為止，運動改善NAFLD 的分子作用機制不詳。

Canopy 成纖維細胞生長因子信號調(diào)節(jié)因子2（Canopy FGF signaling regulator 2，CNPY2）是一種含有皂苷B-型域的成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）調(diào)節(jié)蛋白。Hatta 等[9]首次通過實驗研究，檢測了CNPY2蛋白和CNPY2 mRNA在小鼠體內(nèi)的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNPY2在骨骼肌、心肌、平滑肌、血液、內(nèi)皮和上皮等不同器官和組織中廣泛分布，以心臟、肺、胰腺和肝臟中表達較高，在骨骼肌、腎臟、脾臟和胃中表達次之，在睪丸、大腦、大腸和小腸中表達最少；其次，在唾液腺、乳腺和甲狀腺管腔中，CNPY2 染色顯陽性，提示CNPY2 作為內(nèi)分泌蛋白發(fā)揮細胞外泌體作用的可能性。目前，CNPY2 沒有得到廣泛的研究，其已知的生物學(xué)功能十分有限。有限的文獻研究報道，CNPY2 參與神經(jīng)突生長、膠質(zhì)瘤C6細胞和血管平滑肌細胞的增殖和遷移過程[10]。在缺氧時，低氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia inducible factor 1，HIF-1α）可引起血管平滑肌細胞CNPY2 表達增加[11]。CNPY2通過FGF21調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體和細胞脂蛋白代謝[12]。此外，在人類非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，CNPY2 通過激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制NSCLC 細胞凋亡[13]。由此可見，CNPY2 在細胞生長、遷移、凋亡和脂質(zhì)代謝中扮演重要作用[14]。近期文獻[15]報道，CNPY2在肝細胞癌中表達上調(diào)。有學(xué)者[16]通過10周高脂膳食喂養(yǎng)成功誘導(dǎo)NAFLD 小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNPY2 調(diào)控PKR 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狀激酶（protein kinase R-like ER ki?nase，PERK）/真核細胞翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）信 號 通 路 在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。運動作為一種低成本治療手段，可有效預(yù)防和改善NAFLD，其深層機制被證實與運動調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）水平相關(guān)[17]。然而，運動是否通過CNPY2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 PERK/eIF2a 通路，從而發(fā)揮其對NAFLD 的改善作用，尚不得而知。

有關(guān)運動改善非酒精性脂肪性肝病的研究多為人體[18]和動物[19]實驗，細胞實驗未見文獻報道。研究表明，體內(nèi)能量代謝關(guān)鍵蛋白激酶—腺苷磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein ki?nase，AMPK）在不同運動時均可被激活，因此，AMPK激動劑在細胞實驗中常用來模擬運動刺激[20，21]。本研究聚焦于CNPY2 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a 信號通路，通過高脂膳食誘導(dǎo)NAFLD 小鼠模型，并進行有氧運動干預(yù)；同時，通過棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)構(gòu)建HepG2 細胞NAFLD 體外模型[22]，采用AMPK 激動劑（GSK621）、CNPY2 重組蛋白和 PERK 抑制劑（GSK2606414）干預(yù)，探討CNPY2 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α信號通路在有氧運動干預(yù)NAFLD 中的可能作用機制，以期為NAFLD 的運動康復(fù)和相關(guān)靶點篩選提供實驗依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：LEICARM2126 切片機、YT-6C 生物組織攤烤片機、勻漿機、蛋白定量儀、Bio-Rad 水平電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系統(tǒng)、BMII 型病理組織包埋機、Olympus BX51 光學(xué)顯微鏡、Nikon Eclipse55i 熒光顯微鏡等。

主要試劑：人肝癌HepG2 細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫；棕櫚酸（P5585）和油紅O（01391）購自美國Sigma公司；抗體CNPY2（14635-1-AP）和PERK（20582-1-AP）購自proteintech 公司；抗體血紅素加氧酶- 1（haem oxygenase- 1，HO- 1）（ET1604- 45），NADPH 氧 化 酶- 1（NADPH oxidase 1，NOX- 1）（ER1913-99）和p-eIF2α（ET1603-14）購自華安生物；抗體核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）（ab92946）、IgG（ab6721）購自abcam 公司；β-actin（AC026）購自abclonal 公司；ELISA 檢測試劑盒白介素-1a（interleukin-1α，IL-1α）（ZC-32340）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）（ZC-32446）和 腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（ZC-35733）購自上海茁彩。CNPY2 重組蛋白（13771-H08H）購自Sino Bilogical 公司；AMPK 激動劑（GSK621）（516535-5MC）購 自MCE 公 司；PERK 抑 制 劑（GSK2606414）（B6020-1mg）購自APEBIO公司。

1.2 動物分組及模型評價

1.2.1 動物分組及運動方案

30只8周齡雄性C57/BL6J小鼠由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，SPF/VAF 級，許可證編號：JSNJ（蘇）2020-0003，按隨機數(shù)字表法分為普通飲食組（普飲組）、高脂飲食組（高脂組）和高脂飲食運動組（高脂運動組），每組10 只。所有小鼠在成都體育學(xué)院實驗中心小動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)，室溫18℃～22℃，相對濕度45 %～55 %，12 h陰暗交替，自由飲食飲水。普飲組給予普通飼料飼養(yǎng)，高脂組和高脂運動組給予高脂飼料飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)18周。在實驗第9周，從各組中分別隨機抽取2 只小鼠，禁食12 h，以4 ml/kg 腹腔內(nèi)注射2 % 戊巴比妥鈉溶液麻醉，取肝臟左葉做油紅O病理形態(tài)檢測，結(jié)合血脂變化，以確認(rèn)模型制備成功[23]。從第10 周開始，高脂運動組進行有氧運動訓(xùn)練干預(yù)，直至實驗結(jié)束，取小鼠肝臟。

運動訓(xùn)練方案[24]：高脂運動組小鼠先進行1周跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，初始速度為8 m/min×10 min，20 min/d，每天以0.5 m/min的速度和10 min/d的時間遞增，直至運動時間達到60 min/d，運動速度達到12 m/min，正式運動持續(xù)8 周，每周運動5 天，普飲組和高脂組小鼠靜置于沒有開機的跑步機上，持續(xù)時間和頻率與高脂運動組相同。

1.2.2 取材和模型評價

為避免運動應(yīng)激反應(yīng)，實驗結(jié)束后48 h取材。取材前禁食12 h，以4 ml/kg 腹腔內(nèi)注射2 % 戊巴比妥鈉溶液麻醉，以腹部正中切口打開腹腔，迅速取出肝臟。用4%多聚甲醛將肝組織固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。采用NAS 評分[25]標(biāo)準(zhǔn)對肝組織脂肪性變進行病理學(xué)評分。NAS 評分標(biāo)準(zhǔn)如下：含脂肪滴肝細胞散在、稀少，0分；含脂肪滴肝細胞≤1/4，1分；含脂肪滴肝細胞≤1/2，2 分；含脂肪滴肝細胞≤3/4，3 分；肝組織幾乎被脂滴所代替，其面積>3/4，4分。

1.3 HepG2細胞培養(yǎng)與分組

HepG2 細胞用含10% FBS 和1% 青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放置在條件為37℃、5% CO2和95%空氣的細胞培養(yǎng)箱中，至細胞融合率達80%～90% 時加入0.25% 胰蛋白酶消化細胞，按1：3比例進行傳代及后續(xù)實驗操作。

實驗分為8 組：即空白對照組（C 組），模型組（M組），AMPK 激動劑干預(yù)組（GSK621 組），CNPY2 重組蛋白干預(yù)組（CNPY2 組），CNPY2 重組蛋白+ AMPK激動劑干預(yù)組（CNPY2+ GSK621 組），CNPY2 重組蛋白+ PERK 抑制劑干預(yù)組（CNPY2+GSK2606414 組），AMPK 激動劑+PERK 抑制劑干預(yù)組（GSK621+GSK2606414 組），CNPY2 重組蛋白+AMPK 激動劑+PERK 抑制劑干預(yù)組（CNPY2+ GSK621+ GSK2606414組）。

除空白對照組外，其余各組在加入棕櫚酸（palmit?ic acid，PA）（濃度250 μM）孵育肝細胞24 h，誘導(dǎo)NAFLD 體外模型后[22]，采用AMPK 激動劑（GSK621）（濃度1 μM）模擬細胞水平運動效應(yīng)[21]，以及CNPY2重組蛋白（CNPY2）（濃度2.5 ng/mL）和PERK 抑制劑（GSK2606414）（濃度0.5 μM）干預(yù)24 h。具體干預(yù)方案為：GSK621組加入AMPK 激動劑干預(yù)24 h；CNPY2組加入CNPY2 重組蛋白干預(yù)24 h；CNPY2+ GSK621組加入AMPK 激動劑和CNPY2 重組蛋白共同干預(yù)24 h；CNPY2+ GSK2606414 組加入CNPY2 重組蛋白和PERK 抑制劑共同干預(yù) 24 h；GSK621 +GSK2606414 組加入AMPK 激動劑和PERK 抑制劑共同干預(yù) 24 h；CNPY2+ GSK621+ GSK2606414 加入AMPK 激動劑、CNPY2 重組蛋白和PERK 抑制劑共同干預(yù)24 h。

1.4 蛋白提取和Western Blotting檢測

提取肝組織和肝細胞總蛋白，具體步驟如下：肌組織50 mg，加人預(yù)冷RIPA 裂解液500 μ1，電動勻漿機勻漿，靜置10 min后，12 000 rpm低溫離心15 min，取上清；收集肝細胞蛋白，超聲細胞破碎儀破碎細胞后靜置10 min，4℃離心，取上清，BCA法測肝組織和肝細胞總蛋白含量。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，室溫下5%BSA 封閉1 h，4℃過夜孵育一抗，CNPY2 稀釋濃度為1∶400，PERK、HO-1、Nrf2、NOX-1、p-eIF2α稀釋濃度均為1∶1000，β-actin 稀釋濃度為1∶100000。次日TBST 清洗，室溫孵育二抗1 h，再次TBST 清洗。ECL 發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像。βactin 作為內(nèi)參，使用 Gel-pro 圖像分析軟件，對Western Blot 結(jié)果進行灰度掃描并量化分析，蛋白表達量用“目的蛋白/β-actin”計算。

1.5 HepG2細胞油紅O染色

用預(yù)冷PBS 清洗細胞3 次，然后用4%多聚甲醛固定細胞10 min。加入油紅O 染液于6 孔板內(nèi)，室溫反應(yīng)10 min，用60%的異丙醇進行脫色，緊接著用蘇木素染核30 s，重新用60%的異丙醇清洗2～3 次，倒置顯微鏡下觀察，油紅O 染色結(jié)果進行量化分析。同時將細胞種植于96 孔板，重復(fù)上述操作，最后使用100%異丙醇溶解已染色的細胞，酶標(biāo)儀在波長600 nm 處檢測其吸光度值。

1.6 HepG2 細胞qRT-PCR 檢測

按照Trizol 法提取HepG2 細胞總RNA，用Nano?drop ND-1000 分光光度計測定RNA 的純度及濃度，選取OD 值在1.80～2.0 間的樣品按照TAKARA Prime Script TM RTMaster Mix 試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL。RT-PCR 反應(yīng)體系為10 μL，按照TAKARASYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TliR?NaseH Plus）試劑盒說明書，采用LightCycler480 進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。所有引物設(shè)計與合成委托由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，并以ULTRAPAGE 純化，引物設(shè)計見表1。以β-actin 作為內(nèi)對照，計算相對量，采用2－ΔΔCT法分析。

表1 引物設(shè)計

1.7 HepG2 細胞上清液ELISA 檢測

將各組細胞培養(yǎng)基移取至離心管中，在4℃下以1500 rpm 的速度離心10 min，收集各組細胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書，檢測各組上清液中IL-6、IL-1α、TNF-α細胞因子水平。每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個復(fù)孔，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝組織病理形態(tài)變化

各組小鼠肝臟病理形態(tài)結(jié)果（圖1A）顯示：高脂組肝細胞可見明顯脂肪性變，肝細胞內(nèi)有大量脂肪空泡充填；高脂運動組肝細胞脂肪性變程度顯著減輕。肝細胞脂肪性變積分結(jié)果（圖1B）顯示：高脂組肝細胞脂肪性變積分較普飲組顯著升高（P＜0.05），高脂運動組肝細胞脂肪性變積分較高脂組顯著降低（P＜0.05），提示有氧運動顯著改善小鼠肝組織病理形態(tài)。

圖1 各組肝臟病理形態(tài)變化（×400）

2.2 各組小鼠肝組織CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號通路表達變化

各組小鼠肝組織Western Blotting 結(jié)果（見圖2）顯示，與普飲組比較，高脂組CNPY2、PERK、p-eIF2α蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與高脂組比較，高脂運動組以上指標(biāo)顯著降低（P＜0.05），提示有氧運動下調(diào)小鼠肝組織CNPY2 表達，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α信號通路。

圖2 各組小鼠肝組織CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號通路表達變化

2.3 各組HepG2 細胞油紅O染色變化

各組HepG2 細胞油紅O 染色結(jié)果（見圖3 A）顯示，對照組肝細胞數(shù)量多，細胞排列整齊，肝細胞呈不規(guī)則多角形或卵圓形生長，胞質(zhì)染色淺淡或無明顯著色；與對照組比較，模型組肝細胞內(nèi)脂滴明顯增多；與模型組比較，CNPY2 重組蛋白干預(yù)組紅染顆粒增加，其余干預(yù)組脂滴數(shù)量較模型組不同程度減少。各組肝細胞脂滴光密度結(jié)果（見圖3 B）顯示：模型組（M組）肝細胞脂滴光密度較對照組（C組）顯著增加（P＜0.01）；與模型組（M 組）比較，CNPY2 重組蛋白干預(yù)組（CNPY2組）肝細胞脂滴光密度顯著增加（P＜0.05），AMPK 激動劑干預(yù)組（GSK621組）肝細胞脂滴光密度顯著下降（P＜0.05）；與CNPY2 組比較，CNPY2+GSK2606414 組和CNPY2+GSK621 組肝細胞脂滴光密度均顯著下降（P＜0.05）；與 GSK621+ GSK2606414 組比較，GSK621+GSK2606414+CNPY2 組肝細胞脂滴光密度顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組HepG2細胞脂滴變化（×400）

2.4 各組HepG2 細胞CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號通路表達變化

各組HepG2 細胞CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號通路表達變化結(jié)果（見圖4）顯示：與對照組（C 組）比較，模型組（M 組）肝細胞CNPY2、PERK 和p-eIF2α、CNPY2 mRNA 和PERK mRNA 表 達 顯 著 增 加（P＜0.05）；與M 組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子表達均顯著升高（P＜0.05），AMPK激動劑干預(yù)組（GSK621）以上分子表達顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2 組 比 較，CNPY2+ GSK621 組 和CNPY2+GSK2606414 組以上分子表達均顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414 + GSK621 組比較，GSK2606414 +GSK621+CNPY2組以上分子表達顯著升高（P＜0.05）。

圖4 各組HepG2 細胞CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號通路表達變化

2.5 各組HepG2 細胞氧化應(yīng)激分子表達變化

各組HepG2 細胞氧化應(yīng)激分子表達變化結(jié)果（見圖5）顯示：與對照組（C組）比較，模型組（M組）肝細胞Nrf2、HO-1、NOX-1 蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與M 組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子表達顯著升高（P＜0.05），AMPK 激動劑干預(yù)組（GSK621）以上分子表達顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2組 比 較 ，CNPY2 + GSK621 組 和 CNPY2 +GSK2606414 組以上分子表達均顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414 + GSK621 組比較，GSK2606414 +GSK621+CNPY2組以上分子表達顯著升高（P＜0.05）。

圖5 各組HepG2 細胞氧化應(yīng)激分子表達變化

2.6 各組HepG2 細胞炎癥因子濃度變化

各組HepG2 細胞炎癥因子濃度變化結(jié)果（見圖6）顯示：與對照組（C 組）比較，模型組（M 組）肝細胞上清液IL-1a、IL-6 和TNF-a 濃度顯著增加（P＜0.05）；與M 組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子濃度顯著升高（P＜0.05），AMPK 激動劑干預(yù)組（GSK621）以上分子濃度顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2組比較，CNPY2+GSK621 組和CNPY2+GSK2606414組以上分子濃度顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414+GSK621 組比較，GSK2606414 + GSK621+CNPY2組以上分子濃度顯著升高（P＜0.05）。

圖6 各組HepG2 細胞炎癥因子濃度變化

3 討論與分析

NAFLD 是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，其主要病理學(xué)特征為肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，早期病理僅為單純性肝細胞脂肪樣變，而中晚期會繼發(fā)炎性細胞浸潤、肝細胞凋亡和壞死[26]。動物模型和細胞模型是NAFLD 研究的常用手段。動物模型實驗周期長、能模擬體內(nèi)環(huán)境，但個體差異較大[27]；細胞模型簡便、高效，能克服個體差異的影響，更適于開展機制研究[28]。病理形態(tài)組織學(xué)是NAFLD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[29]。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD 小鼠動物模型，肝組織病理形態(tài)結(jié)果顯示，高脂組肝細胞脂肪性變較普飲組顯著增加，提示NAFLD 動物模型復(fù)制成功。NAFLD 體外模型的構(gòu)建常采用棕櫚酸誘導(dǎo)、油酸誘導(dǎo)、游離脂肪酸誘導(dǎo)、油酸與棕櫚酸按一定比例混合誘導(dǎo)等方法[30]。棕櫚酸（PA）容易引發(fā)肝臟的脂肪變性，是飲食和血清中最豐富的游離脂肪酸[31]。PA 常用于誘導(dǎo)肝細胞HepG2 體外模擬非酒精性脂肪肝的損傷及脂質(zhì)沉積[32].。研究報道[22]，棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細胞24 h，肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積累顯著增多，提示棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細胞24 h 可成功建立NAFLD 體外模型。本研究結(jié)果顯示：模型組在棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細胞24 h 后，油紅O 染色可見其肝細胞內(nèi)脂滴顯著增加，提示本研究成功誘導(dǎo)肝細胞NAFLD 體外模型。

研究報道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是NAFLD 發(fā)展進程中重要的病理基礎(chǔ)[33]。ERS 的信號通路由PERK、ATF6 和IRE1α三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78（BiP）組成。在非應(yīng)激狀態(tài)下，BiP 的腔域抑制著PERK、ATF6和IRE1α的活性，并與這些跨膜蛋白結(jié)合。然而，當(dāng)未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累時，BiP 與PERK、IRE1α和ATF6α解離，優(yōu)先與未折疊蛋白結(jié)合，從而激活ERS信號通路[34]。 CNPY2是CNPY蛋白家族（CNPY1、CNPY2、CNPY3 和CNPY4）之一，它是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可溶性蛋白[15]。有研究[16]報道，CNPY2參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CNPY2 可激活PERK/eIF2α通路，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要分子組成之一。本研究動物實驗結(jié)果顯示，CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α通路參與高脂膳食誘導(dǎo)小鼠NAFLD 形成，有氧運動可有效抑制CNPY2/PERKeIF2α通路活性，降低CNPY2/PERK-eIF2α通路相關(guān)分子表達，從而有效改善NAFLD。細胞實驗結(jié)果顯示，棕櫚酸誘導(dǎo)肝細胞NAFLD 體外模型，與對照組比較，模型組CNPY2/PERK-eIF2α通路相關(guān)分子表達顯著升高。與模型組比較，CNPY2 重組蛋白干預(yù)組上述通路相關(guān)分子表達顯著升高，AMPK 激動劑干預(yù)組上述通路相關(guān)分子表達顯著降低，提示CNPY2 重組蛋白干預(yù)可激活CNPY2/PERK-eIF2α信號通路，促進棕櫚酸作用效應(yīng)，而AMPK 激動劑有效抑制CNPY2/PERKeIF2α信號通路，逆轉(zhuǎn)棕櫚酸作用效應(yīng)。研究結(jié)果還顯示，AMPK激動劑和PERK 抑制劑均可逆轉(zhuǎn)CNPY2 重組蛋白干預(yù)效應(yīng)，提示AMPK 激動劑（模擬細胞運動效應(yīng)）通過CNPY2 有效抑制PERK/eIF2α信號通路活性，從而逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細胞NAFLD。以上研究結(jié)果共同表明，CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α信號通路在有氧運動干預(yù)NAFLD 中發(fā)揮重要作用。有氧運動可能通過下調(diào)CNPY2 表達，抑制PERK/eIF2α信號通路活性，降低PERK/eIF2α信號通路相關(guān)分子表達，從而改善NAFLD。

研究報道，NAFLD 中肝細胞ERS 與肝細胞脂質(zhì)異常積聚、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[35]。血紅素加氧酶-1（haem oxygenase-1，HO-1）是一種廣泛存在的抗氧化防御酶，幾乎分布于所有的組織和器官，對氧化損傷具有良好的保護效應(yīng)，成為研究抗氧化損傷的首選靶基因之一[36]。在炎性反應(yīng)中，HO系統(tǒng)被認(rèn)為是細胞最重要的保護通路之一，參與抗炎與多種急慢性氧化應(yīng)激損傷[37]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear fac?tor E2-related factor 2，Nrf2），在機體抗氧化應(yīng)激中起著重要作用。Nrf2 感受氧化應(yīng)激，使抗氧化酶（包括HO-1）分子表達升高，減輕自由基損傷，是調(diào)節(jié)細胞抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子[38]。有研究表明，Nrf2抑制脂質(zhì)沉積和氧化應(yīng)激[39]。NADPH 氧化酶（NADPH oxi?dase，NOX）是細胞內(nèi)氧自由基的主要來源[40]。NOX-1可以調(diào)控細胞內(nèi)自由基的生成，是NOX 蛋白家族成員之一[41]。IL-1α、IL-6 和TNF-α是重要的炎癥因子，在炎癥反應(yīng)啟動中具有重要作用，其濃度與炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)[42]。我們推測，CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α通路在棕櫚酸誘導(dǎo)NAFLD 中發(fā)揮作用，其機制可能與氧化應(yīng)激和炎癥有關(guān)。本研究細胞實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組肝細胞HO-1、Nrf2、NOX-1蛋白表達及肝細胞上清液IL-1α、IL-6 和TNF-α濃度均顯著增加，提示棕櫚酸誘導(dǎo)肝細胞NAFLD 體外模型形成，導(dǎo)致肝細胞氧化應(yīng)激和細胞炎癥增加。與模型組比較，CNPY2 重組蛋白干預(yù)組以上分子表達顯著升高，AMPK 激動劑干預(yù)組上述分子表達顯著降低，提示CNPY2 重組蛋白增加肝細胞氧化應(yīng)激和炎癥因子水平，對棕櫚酸干預(yù)效應(yīng)具有促進作用，而AMPK激動劑減少肝細胞氧化應(yīng)激和炎癥因子水平，抑制棕櫚酸干預(yù)效應(yīng)，提示AMPK 激動劑（模擬細胞運動效應(yīng)）可有效抑制和逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細胞NAFLD，其機制可能與AMPK 激動劑減少肝細胞氧化應(yīng)激和炎癥水平有關(guān)。以上研究結(jié)果表明，有氧運動可有效改善NAFLD，其機制可能與其抑制肝細胞氧化應(yīng)激，減少細胞炎癥有關(guān)。

4 結(jié)論

CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號通路參與NAFLD形成。有氧運動可有效改善NAFLD，其機制可能與其下調(diào)CNPY2 表達，通過抑制PERK/eIF2α通路活性，降低PERK/eIF2α信號通路相關(guān)分子表達，從而減少肝細胞氧化應(yīng)激和細胞炎癥有關(guān)。