有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)阿爾茲海默癥小鼠Notch信號(hào)通路甲基化的影響

張業(yè)廷 付燕 李雪 袁瓊嘉

1 中國(guó)民用航空飛行學(xué)院（四川 廣漢 618307）

2 西南民族大學(xué)體育學(xué)院（成都 610041）

3 成都體育學(xué)院（成都 610041）

許多學(xué)者致力于探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）有益影響的機(jī)制，并已有幾種機(jī)制被用來(lái)解釋體育活動(dòng)對(duì)AD 的防治作用，包括：運(yùn)動(dòng)可減少β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）生成、促進(jìn)Aβ清除、抑制Aβ斑塊沉積和磷酸化Tau的堆積；運(yùn)動(dòng)可增加海馬、大腦皮質(zhì)等部位神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)海馬神經(jīng)和突觸的發(fā)生，加強(qiáng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)系，提高突觸可塑性等[1-4]；運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)機(jī)體抗自由基能力，抑制其神經(jīng)毒性等[5]。也有學(xué)者開展了運(yùn)動(dòng)對(duì)AD 小鼠成年海馬神經(jīng)發(fā)生（adult hippocam?pal neurogenesis，AHN）的研究，AHN 是神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）通過(guò)前體細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞的擴(kuò)增，以及這些新生神經(jīng)元與現(xiàn)有神經(jīng)回路的整合，產(chǎn)生新的功能性成熟齒狀顆粒細(xì)胞（dentate gran?ule cells，DGCs）的過(guò)程。運(yùn)動(dòng)后齒狀回神經(jīng)發(fā)生的增加與空間記憶的增強(qiáng)有關(guān)，而通過(guò)局部伽馬射線照射海馬區(qū)域抑制神經(jīng)發(fā)生消除了運(yùn)動(dòng)刺激對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的改善作用[6，7]。但是這些研究并沒(méi)有完全闡明運(yùn)動(dòng)如何調(diào)控AHN及影響學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制。

神經(jīng)發(fā)生貫穿于人的一生，其主要存在的兩個(gè)腦區(qū)分別是海馬齒狀回（dentate granulosa，DG）的亞顆粒區(qū)（subgranular zone，SGZ）和側(cè)腦室的室下區(qū)（sub?ventricular zone，SVZ）[8]。神經(jīng)發(fā)生是指成年NSCs通過(guò)成神經(jīng)細(xì)胞和中間祖細(xì)胞的擴(kuò)增，以及將新生神經(jīng)元與固有的神經(jīng)回路進(jìn)行整合，產(chǎn)生新的功能性成熟DGCs 的過(guò)程[9]。與此同時(shí)，成年的神經(jīng)發(fā)生會(huì)受到外部環(huán)境影響和內(nèi)在遺傳因素的嚴(yán)格控制[10]。通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Notch通路成分在出生后早期和成年大腦的神經(jīng)生發(fā)區(qū)內(nèi)表達(dá)，這也支持了Notch信號(hào)調(diào)節(jié)成年后NSCs 的可能性[11，12]。Notch 信號(hào)的抑制是一種已知的誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的條件，它會(huì)導(dǎo)致Hes1 的下調(diào)以及神經(jīng)元素2（Neurogenin2，Ngn2）和Dll1的持續(xù)上調(diào)[13]。包括DNA甲基化在內(nèi)的表觀遺傳修飾在干細(xì)胞功能中起著重要作用，已成為NSCs中外部環(huán)境影響和基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄控制的重要環(huán)節(jié)[14]。DNA的甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methylation，DNMTs）催化的。DNMTs 的表達(dá)水平通常會(huì)隨著細(xì)胞的分化而降低；然而，DNMT1和DNMT3a即使在成年人的大腦中，包括海馬區(qū)，仍然表達(dá)[15]。有研究結(jié)果表明，盡管Notch 信號(hào)活躍，但其表觀遺傳沉默仍然導(dǎo)致了神經(jīng)元分化[16]。與神經(jīng)生成相關(guān)的基因Notch1、RG?MA和AKT1在基因體中獲得5-羥甲基胞嘧啶，并在分化過(guò)程中上調(diào)。目前，還沒(méi)有研究對(duì)胚胎期和成年期Notch 信號(hào)元件的DNA 甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)。Notch1的低活性降低了組織特異性基螺旋環(huán)螺旋（bHLH）基因活性，導(dǎo)致Ngn2等前神經(jīng)bHLH因子的上調(diào)；這些因子會(huì)抑制神經(jīng)祖細(xì)胞（neuro progenitor cells，NPCs）的維持，促進(jìn)神經(jīng)分化。Notch1、Hes1 和Ngn2 對(duì)NCSs的發(fā)展至關(guān)重要，因此可能是表觀遺傳修飾的候選基因。

盡管AD 癥狀背后的確切神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制仍不清楚，但大腦中與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的區(qū)域，如海馬和前額葉皮質(zhì)，出現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)元丟失，這在AD 大腦中很明顯。AHN 對(duì)學(xué)習(xí)和記憶功能的影響表明它參與了AD 的病程發(fā)展，因?yàn)椴涣嫉挠洃浌δ芸梢栽贏D 確診前15年出現(xiàn)[17]。轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型顯示，海馬依賴的學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)（如空間學(xué)習(xí)、物體識(shí)別和情境恐懼條件反射）存在缺陷[18]。然而，對(duì)AD 小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制及Notch1、Hes1和Ngn2的潛在關(guān)系尚未完全了解。通過(guò)研究三個(gè)Notch 通路基因啟動(dòng)子的DNA 甲基化，我們將探討運(yùn)動(dòng)調(diào)控海馬神經(jīng)基因的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。本研究的問(wèn)題是運(yùn)動(dòng)是否會(huì)影響Notch 通路基因啟動(dòng)子的DNA 甲基化，從而可能在AD引起的神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中參與調(diào)控Notch信號(hào)靶基因活性。因此，我們利用甲基化特異性PCR（Methylationspecific PCR，MSP），研究Notch1、Hes1 和Ngn2 在AD小鼠中的DNA甲基化水平。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康3 月齡APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠，體重25～30 g，購(gòu)于“南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院”，許可證號(hào)：蘇ICP備10073918號(hào)-3。動(dòng)物的飼養(yǎng)條件：環(huán)境清潔安靜，室溫20℃～28℃，相對(duì)濕度為40%～60%，模擬自然光照條件，每日光照12 小時(shí)，自由攝取動(dòng)物飼料和飲用純凈水，每周換經(jīng)過(guò)紫外線嚴(yán)格消毒的墊料、食物及飲用水。將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為兩組：AD 對(duì)照組（ADC）、AD 運(yùn)動(dòng)組（ADE），每組20 只。對(duì)照組不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行為期5 個(gè)月的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)。運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，將所有AD小鼠取材進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2 有氧運(yùn)動(dòng)方案

在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練開始前，所有的運(yùn)動(dòng)組小鼠適應(yīng)跑步機(jī)環(huán)境10 min，連續(xù)兩天（第一天5 m/min，第二天8 m/min）。適應(yīng)結(jié)束后，各運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，每周5天，每天30 min，持續(xù)5 個(gè)月。在每次訓(xùn)練過(guò)程中，以10 m/min 的速度開始跑5 min，然后以15 m/min 跑20 min，最后以10 m/min 的速度跑5 min 結(jié)束。在這種強(qiáng)度下，當(dāng)小鼠停止不運(yùn)動(dòng)時(shí)，不對(duì)小鼠進(jìn)行電刺激，只輕柔地觸摸尾巴讓小鼠繼續(xù)運(yùn)動(dòng)[19]。

1.3 腦組織取材和相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

腦組織取材于運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后24 h～48 h 內(nèi)進(jìn)行。經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水及慢速灌注預(yù)冷至4℃的4%多聚甲醛后，用眼科剪、鑷子迅速剝開顱骨取出腦組織。每組隨機(jī)取6只腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后將腦組織依次放入10%、20%、30%的蔗糖溶液中進(jìn)行梯度脫水5～7 d。在冰凍切片機(jī)中根據(jù)腦立體定位圖冠狀面切取海馬部位制作厚度為5 μm 的切片10 張，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫糜谥谱鞅鶅銮衅詡涿庖邿晒庥^察分析。6 只用于提取蛋白（蛋白儲(chǔ)存于4℃冰箱）進(jìn)行免疫蛋白印跡檢測(cè)。6只用于提取DNA（DNA儲(chǔ)存于－20℃冰箱）進(jìn)行甲基化特異性PCR 檢測(cè)及提取mRNA（mRNA 儲(chǔ)存于－20℃冰箱）用于檢測(cè)海馬神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。

1.4 免疫熒光染色觀察海馬蛋白表達(dá)

通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)量。取出事先切好保存于－20℃冰箱的冰凍腦組織切片，在4°C環(huán)境下于4%多聚甲醛中固定10 min。用PBS 清洗兩次后，在組織切片上滴加3%的過(guò)氧化氫溶液封閉，避光室溫孵育25 min，于4°C 環(huán)境下孵育一抗（表1）過(guò)夜。第二天，PBS 清洗后，用熒光抗體（1︰100，R＆D Sys?tems USA）37°C環(huán)境下避光孵育1 h。采用DAPI染色劑進(jìn)行核染色。利用OLYMPUS顯微鏡獲得熒光圖像，每張切片采取20×、40×放大倍數(shù)圖片，高倍視野均在低倍視野區(qū)域內(nèi)選取，其中在400倍光鏡下選取5個(gè)互不重疊相同面積的視野進(jìn)行采集，使用Image-ProPlus +6.0軟件分析熒光強(qiáng)度（AU/μm2）。

表1 抗體信息

1.5 Real-time PCR 檢測(cè)海馬神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

在通風(fēng)櫥內(nèi)提取海馬組織mRNA，加RNAzol 入EP管中處理勻漿后的海馬組織，再加入DEPC處理水，振蕩離心，取出上清液，加入75%濃度乙醇，在室溫環(huán)境下靜置離心，吸凈上清液，留下EP 管底部白色沉淀物；加入75%濃度的乙醇，離心后吸盡上清液，然后加入DEPC 處理水溶解mRNA。將提取的mRNA 于當(dāng)天反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在PCR 管中配置qPCR 反應(yīng)體系，加入12.5 μl 的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix試劑，加入上下游引物（≤5 μM）（表2），DNA 模板（≈1000 ng），用不含核酸酶的ddH2O配至配至25 μl。完全混合預(yù)混液，分配至八聯(lián)管中。將八聯(lián)管放入CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x中，按三步法循環(huán)方案進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，分析PCR 產(chǎn)物的融解曲線，確定反應(yīng)特異性。數(shù)據(jù)處理采用2-△△CT（Livak）方法。

表2 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.6 Western Blot 檢測(cè)小鼠大腦海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)量

根據(jù)小鼠腦組織立體定位圖譜，可以用鑷子輕松將海馬組織剝離大腦，取出海馬組織，稱重后放入EP管中，加入RIPA裂解液，室溫環(huán)境下靜置30 min，然后將其放入離心機(jī)中離心，吸取EP 管中上清液，加入5×上樣緩沖液，于95℃金屬浴中加熱5 min～10 min 以使蛋白質(zhì)充分的變性。用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（15～20 mA 電流轉(zhuǎn)膜30 min）。去脂牛奶封閉目的蛋白條帶1 h，之后用一抗（表1）分別將帶有相應(yīng)目的蛋白的PVDF 膜在4°C 環(huán)境中孵育過(guò)夜。第二天，TBST液洗滌PVDF膜，然后用二抗室溫孵育1 h；洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，獲得蛋白印跡圖像。掃描膠片，利用Gel pro plus軟件對(duì)內(nèi)參蛋白和目的蛋白進(jìn)行光密度（OD）值的分析（蛋白表達(dá)量=目的蛋白OD值/內(nèi)參蛋白OD值）。

1.7 甲基化檢測(cè)相關(guān)基因

將海馬組織用注射器反復(fù)吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，離心后倒除上清液，加緩沖液GA，振蕩放置后加入蛋白酶K，震蕩混勻再加入緩沖液GB，混勻，70℃放置后加入200 μl 無(wú)水乙醇，將溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中，離心后倒掉廢液，向CB3中加入緩沖液GD，離心后倒掉廢液，再向CB3 中加入漂洗液PW 離心，室溫放置以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，將CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位滴加TE洗脫緩沖液，離心后將溶液收集到離心管中。將提取的基因組DNA用重亞硫酸鹽處理。取0.2 ml PCR管，配制PCR反應(yīng)體系（表3），PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表4（M：甲基化序列引物；U：非甲基化序列引物），PCR擴(kuò)增條件見表5。反應(yīng)終產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳30 min（5V/cm 電壓，1×TAE Buffer），最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。甲基化百分比=甲基化條帶光密度值/（甲基化條帶光密度值+ 非甲基化條帶光密度值）×100%。

表3 PCR反應(yīng)體系

表4 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

表5 PCR擴(kuò)增條件

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠海馬Notch1檢測(cè)結(jié)果

由圖1 可知，ADE 組海馬Notch1 mRNA 表達(dá)顯著低于ADC 組（t=4.496，P＜0.01），ADE 組海馬Notch1 蛋白表達(dá)顯著低于ADC組（t=8.602，P＜0.01）。

圖1 各組小鼠海馬Notch1基因及蛋白表達(dá)比較

小鼠海馬Notch1表達(dá)熒光圖見圖2，圖中藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，紅色代表Notch1免疫陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)。如圖3所示，ADE組小鼠海馬DG區(qū)Notch1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著低于ADC 組（t=4.193，P＜0.01）；ADE 組小鼠海馬DG區(qū)Notch1免疫陽(yáng)性產(chǎn)物熒光強(qiáng)度與ADC組相比沒(méi)有顯著差異（t=1.668，P=0.126）。

圖2 各組小鼠海馬DG區(qū)Notch1表達(dá)熒光圖

圖3 各組小鼠海馬Notch1熒光表達(dá)比較

2.2 小鼠海馬Hes1檢測(cè)結(jié)果

如圖4所示，ADE 組海馬Hes1 mRNA 表達(dá)顯著低于ADC 組（t=4.388，P＜0.01）。ADE 組海馬Hes1 蛋白表達(dá)顯著低于ADC組（t=7.906，P＜0.01）。

圖4 各組小鼠海馬Hes1基因及蛋白表達(dá)比較

小鼠海馬Hes1 表達(dá)熒光圖見圖5，圖中藍(lán)色代表DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核，紅色代表Hes1 免疫陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)。如圖6所示，ADE組小鼠海馬DG區(qū)Hes1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著低于ADC 組（t=5.524，P＜0.01）；ADE 組小鼠海馬DG區(qū)Hes1免疫陽(yáng)性產(chǎn)物熒光強(qiáng)度顯著低于ADC組（t=2.308，P＜0.05）。

圖5 各組小鼠海馬Hes1表達(dá)熒光圖

圖6 各組小鼠海馬Hes1熒光表達(dá)比較

2.3 小鼠海馬Ngn2檢測(cè)結(jié)果

如圖7所示，ADE組海馬Ngn2 mRNA表達(dá)顯著高于ADC 組（t=－2.995，P＜0.05）。ADE 組海馬Ngn2 蛋白顯著高于ADC組（t=－5.934，P＜0.01）。

圖7 各組小鼠海馬Ngn2基因及蛋白表達(dá)比較

各組小鼠海馬Ngn2 表達(dá)熒光圖見圖8，圖中藍(lán)色代表DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核，紅色代表Ngn2 免疫陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)。如圖9 所示，ADE 組小鼠海馬DG 區(qū)Ngn2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著高于ADC組（t=－5.176，P＜0.01）；ADE組小鼠海馬DG區(qū)Ngn2免疫陽(yáng)性產(chǎn)物熒光強(qiáng)度顯著高于ADC組（t=－2.373，P＜0.05）。

圖8 各組小鼠海馬Ngn2表達(dá)熒光圖

圖9 各組小鼠海馬Ngn2熒光表達(dá)

2.4 小鼠海馬Notch1、Hes1和Ngn2的甲基化檢測(cè)

ADE 組小鼠海馬Notch1 及Hes1 的甲基化率顯著高于ADC 組（t=－5.679，P＜0.01；t=－21.720，P＜0.01；圖10A、B、C）；ADE 組小鼠海馬Ngn2 的甲基化率顯著少于ADC組（t=4.989，P＜0.01；圖10A、D）。

圖10 各組小鼠海馬Notch1、Hes1和Ngn2甲基化檢測(cè)

3 討論

Notch 信號(hào)在海馬齒狀回顆粒下層的神經(jīng)發(fā)生控制中也起著重要作用[20，21]?；虺聊瑢?shí)驗(yàn)表明，Notch和Notch信號(hào)通路組分在調(diào)控成年DG神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中起重要作用。Notch1條件性缺失或激活Notch1過(guò)表達(dá)對(duì)成年DG 的神經(jīng)發(fā)生有顯著影響[22]。通過(guò)激活Notch1 表達(dá)會(huì)使其胞內(nèi)活性形式NICD 增加，NICD 復(fù)合物形成則激活Notch 信號(hào)通路增加NSCs，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖，并可能導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生成[23]。而NICD 復(fù)合物會(huì)提高Hes1、Hes5 等轉(zhuǎn)錄抑制基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制神經(jīng)分化發(fā)育相關(guān)基因（Mammalian achaete-scute homologue-1，Mash1）、Ngn2 等促神經(jīng)元發(fā)生相關(guān)基因以及Dll1 的轉(zhuǎn)錄，從而維持NSCs 的增殖活力與多能性[24]。抑制Notch 信號(hào)能夠?qū)е翲es1 的下調(diào)和Ngn2的持續(xù)上調(diào)，這將不足以刺激神經(jīng)元分化[13]。例如非二噁英樣聯(lián)苯多氯化物、Notch 信號(hào)通路抑制劑DAPT 等則可以通過(guò)抑制Notch1 的表達(dá)來(lái)減少NSCs的增殖并導(dǎo)致其向神經(jīng)元方向分化[25]。

在AHN中，NSCs是選擇繼續(xù)增殖還是向神經(jīng)元分化，Notch 信號(hào)通路則起到了關(guān)鍵的作用。通過(guò)調(diào)節(jié)Notch 信號(hào)通路可以阻止受損腦區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞迅速填充以及成年動(dòng)物腦內(nèi)NPCs向膠質(zhì)細(xì)胞分化，從而為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的恢復(fù)提供有利條件。在體外通過(guò)對(duì)Notch 信號(hào)通路的調(diào)控可以精確影響NSCs 向神經(jīng)功能細(xì)胞分化的過(guò)程和比例[26]。而在體內(nèi)，通過(guò)抑制Notch1 形成NICD 復(fù)合物可以降低Notch 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而減少細(xì)胞的增殖，并間接促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元方向分化[27]。Pierre 等發(fā)現(xiàn)通過(guò)提高BCL6 表達(dá)，增加其與SIRT1 的相互作用可以抑制Notch 信號(hào)通路，從而導(dǎo)致大量的NSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化[16]。

AD 患者腦部多存在Notch 信號(hào)通路異常，但這些信號(hào)通路在成熟神經(jīng)系統(tǒng)中的功能和阿爾茲海默病發(fā)病中的作用尚未完全明確[28]。淀粉樣前體蛋白（Amy?loid precursor protein，APP）被γ分泌酶（γ-secretase）裂解，產(chǎn)生Aβ，被認(rèn)為與AD 患者的神經(jīng)變性有關(guān)[29]。早老素（PS）是γ分泌酶蛋白水解復(fù)合物的催化分子，它的突變是早發(fā)型家族性AD的主要原因。除了APP外，γ分泌酶底物還包括Notch1同源物、Notch配體Delta和Jagged 以及其他I 型膜蛋白，這引起了人們對(duì)于抑制γ分泌酶而產(chǎn)生的毒性機(jī)制的關(guān)注[30]。γ分泌酶對(duì)Notch蛋白水解的改變可能參與AD的發(fā)病機(jī)制[29]。因此，研究AD 中Notch 信號(hào)通路對(duì)闡明AD 的多種發(fā)病機(jī)制以及治療和預(yù)防AD 具有重要意義。而目前缺乏相應(yīng)的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能夠降低AD 小鼠海馬Notch1、Hes1的表達(dá)，而增加Ngn2的表達(dá)，但是運(yùn)動(dòng)通過(guò)怎樣的機(jī)制引起這一變化并不清楚。

表觀遺傳修飾，包括DNA 甲基化，已被證明參與干細(xì)胞的中心功能，并作為NSCs細(xì)胞外環(huán)境影響與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的重要環(huán)節(jié)[31]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA 的甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化的。DNMTs 的表達(dá)水平通常隨著細(xì)胞的分化而降低；然而，DNMT1 和DNMT3a 即使在有絲分裂為主的成年大腦中仍然表達(dá)，包括海馬區(qū)[32]。神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因Notch1 在基因體中獲得5-羥甲基胞嘧啶，并在分化過(guò)程中上調(diào)[33]。Notch1 的低活性降低了組織特異性堿性螺旋-環(huán)-螺旋（helix–loop–helix，bHLH）基因活性，導(dǎo)致Ngn2 等前神經(jīng)bHLH 因子的上調(diào)；這些因子抑制神經(jīng)祖細(xì)胞的維持，促進(jìn)神經(jīng)元分化。Notch1、Hes1 和Ngn2對(duì)于NCSs的發(fā)展至關(guān)重要，可能是表觀遺傳修飾的候選基因。有研究表明，DNA 甲基化可能參與調(diào)控成年神經(jīng)發(fā)生中的Notch 信號(hào)活性，Notch1、Hes1 和Ngn2 啟動(dòng)子的DNA 甲基化與海馬神經(jīng)發(fā)生中的基因抑制有關(guān)[34]。出生后改變DNA 甲基化，被認(rèn)為有助于一些復(fù)雜疾病的晚發(fā)[35]。不同的環(huán)境，尤其是應(yīng)激反應(yīng)似乎能夠改變整個(gè)基因組的DNA甲基化過(guò)程[36]。然而，Notch1、Hes1和Ngn2在運(yùn)動(dòng)對(duì)AD小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制和潛在關(guān)系尚不完全清楚。目前，還沒(méi)有關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)AD 小鼠海馬Notch 信號(hào)元件的DNA 甲基化水平所進(jìn)行的檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)后AD小鼠海馬Notch1及Hes1的甲基化率顯著增加，而其Ngn2 的甲基化率則顯著減少。因此，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)提高Notch1及Hes1的甲基化率，降低Ngn2 的甲基化率，從而降低Notch1 及Hes1的表達(dá)、提高Ngn2的表達(dá)。而這可能是長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)顯著促進(jìn)AD小鼠海馬AHN的增殖及分化過(guò)程的重要原因之一。但是，運(yùn)動(dòng)對(duì)Notch 信號(hào)元件DNA 甲基化水平的改變是如何影響AD 小鼠海馬AHN 過(guò)程的，還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)提高AD 小鼠海馬Notch1及Hes1 的甲基化率，降低海馬Ngn2 的甲基化率，從而降低海馬Notch1 及Hes1 的表達(dá)，以及提高海馬Ngn2的表達(dá)。