電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)乙肝血清學(xué)標(biāo)志物相關(guān)試劑的性能驗(yàn)證

史云峰 杜卉蓮 盤錦遼油寶石花醫(yī)院 （遼寧 盤錦 124010）

內(nèi)容提要： 目的：觀察電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙肝血清學(xué)標(biāo)志物相關(guān)試劑性能的全過(guò)程，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度。方法：選擇美國(guó)貝特曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的UniCel DxI800全自動(dòng)免疫分析儀，基于CLSI的EP15-A的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)精密度結(jié)果、準(zhǔn)確程度、線性范圍等進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：①乙肝五項(xiàng)檢測(cè)批內(nèi)CV測(cè)定結(jié)果均在廠家提供數(shù)值之下，總CV測(cè)定結(jié)果均在廠家提供數(shù)值之下；②基于UniCel DxI800全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)乙肝五項(xiàng)，三次實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示，PT均達(dá)到100%，準(zhǔn)確程度滿足要求；③基于檢測(cè)結(jié)果的回歸曲線顯示，r2=0.9958，處于“上下波動(dòng)臨界值0.03”的范圍之內(nèi)，超過(guò)0.95，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。結(jié)論：通過(guò)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙肝血清學(xué)標(biāo)志物相關(guān)試劑的性能，檢測(cè)結(jié)果十分理想。

慢性乙型肝炎（簡(jiǎn)稱，乙肝）由乙型肝炎病毒持續(xù)感染超過(guò)6個(gè)月以上，導(dǎo)致肝臟發(fā)生不同程度的炎癥壞死或纖維化。目前，臨床針對(duì)乙肝的血清學(xué)檢查分為兩種，其一，常規(guī)的乙肝五項(xiàng)檢測(cè)。主要檢測(cè)內(nèi)容為：①表面抗原（HBsAg），直接檢測(cè)患者體內(nèi)是否存在乙肝病毒；②表面抗體（抗-HBs），檢測(cè)患者免疫功能是否對(duì)乙肝病毒具備抵抗性，能否有效保證患者身體安全；③е抗原（HBeAg），主要檢測(cè)已經(jīng)侵入患者身體的病毒是否復(fù)制及具有傳染性；④е抗體（抗-HBe），檢測(cè)入侵浸提的病毒的復(fù)制過(guò)程能夠在何種程度上受到抑制，或是否能夠受到抑制；⑤核心抗體（抗-HBc），主要檢測(cè)患者是否感染過(guò)乙肝病毒，有無(wú)乙肝病史。檢測(cè)乙肝五項(xiàng)的意義在于：人類感染乙肝病毒的全周期內(nèi)，在急性期可以檢測(cè)到很高的抗-HBc水平；當(dāng)急性期過(guò)后，抗-HBc水平仍會(huì)在若干年的時(shí)間內(nèi)保持一定的高度，此外，在一些處于慢性乙肝感染狀態(tài)的患者或是病毒潛伏期（乙肝病毒攜帶者）人員的身體中，抗-HBc也會(huì)在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較高水平[1]。對(duì)于HBsAg陰性患者而言，其抗-HBc也會(huì)呈現(xiàn)出陽(yáng)性?？傮w而言，進(jìn)行抗-HBc檢測(cè)，能夠確定患者是否有過(guò)乙肝感染史，在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)其他四項(xiàng)指標(biāo)，能夠確定患者是否處于乙肝急性發(fā)作期及病情嚴(yán)重程度?？傊?，乙肝五項(xiàng)是一種通過(guò)患者自身各項(xiàng)抗體、抗原的水平，判斷其是否患有乙肝疾?。〝y帶乙肝病毒）的方式，可籠統(tǒng)地歸納為“間接檢測(cè)法”。其二，乙肝病毒的DNA檢測(cè)[2]。此種方法即直接檢測(cè)患者體內(nèi)是否含有乙肝病毒，若DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，病原體的基因組序列與乙肝病毒一致，則可確診；若不一致，則說(shuō)明患者體內(nèi)很可能不含有乙肝病毒。為了提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以對(duì)乙肝血清學(xué)標(biāo)志物相關(guān)試劑的性能進(jìn)行驗(yàn)證。本研究圍繞電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法的實(shí)際效果展開(kāi)分析，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果進(jìn)行整理，匯報(bào)如下。

1.資料與方法

1.1 儀器與試劑

選擇美國(guó)貝特曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的UniCel DxI800全自動(dòng)免疫分析儀，其特點(diǎn)如下。

第一，采用AMPPD第三代“輝光型”電化學(xué)或化學(xué)發(fā)光技術(shù)，發(fā)光底物成熟度和穩(wěn)定性均可保持較高的水準(zhǔn)；檢驗(yàn)過(guò)程的靈敏度較高，可達(dá)10～21mol/L，其內(nèi)運(yùn)用的磁性微粒子技術(shù)的優(yōu)勢(shì)為：加快反應(yīng)速度，能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速捕獲抗原、抗體，提高發(fā)光強(qiáng)度，快速達(dá)到穩(wěn)定并長(zhǎng)時(shí)間維持發(fā)光，保證生成結(jié)果處于準(zhǔn)確度[3]。

第二，每小時(shí)可完成400份測(cè)試，相關(guān)數(shù)據(jù)的生成及分析過(guò)程極快；能夠?qū)z測(cè)樣本進(jìn)行預(yù)分杯（分立4個(gè)進(jìn)樣系統(tǒng)、采用一體化的整系統(tǒng)檢測(cè)方式，其中，4個(gè)進(jìn)樣通道的優(yōu)勢(shì)如下：①加快進(jìn)樣速度、任一通道故障不影響其他操作、提高靈活性；②根據(jù)需要可任意指定檢測(cè)項(xiàng)目、保證整系統(tǒng)流程的最優(yōu)化；③共享一個(gè)檢測(cè)、孵育系統(tǒng)、共享一套沖洗、讀數(shù)系統(tǒng)；④使用同一個(gè)光量子探測(cè)器、共享一個(gè)定標(biāo)和QC結(jié)果）；此外，借助冷藏技術(shù)，大大提升樣本分析前的質(zhì)量控制水平。

第三，儀器自帶超聲波清洗、混合液攪拌技術(shù)，降低攜帶污染率，提升分析準(zhǔn)確性[4]。

本研究懸念用上?？迫A公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒五項(xiàng)檢測(cè)試劑盒，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)械注準(zhǔn)20163400924，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb五項(xiàng)分別選擇試劑盒（試紙條）、配套定標(biāo)液、水平1質(zhì)控品、水平2質(zhì)控品[5]。

1.2 方法

針對(duì)質(zhì)控品：每天檢測(cè)兩個(gè)濃度水平，連續(xù)5d進(jìn)行，每天必須完成1批檢測(cè)，且每批每個(gè)水平均需連續(xù)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。重點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為批內(nèi)的變異系數(shù)和總變異系數(shù)，與試劑生產(chǎn)廠家提供的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的變異系數(shù)小于廠家給出的臨界標(biāo)準(zhǔn)值，則視為試劑性能達(dá)標(biāo)，符合廠家的說(shuō)明[6]。

對(duì)試劑的準(zhǔn)確程度進(jìn)行驗(yàn)證。本研究供選用兩個(gè)批次共計(jì)10個(gè)水平的試劑質(zhì)控品，根據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)質(zhì)控評(píng)價(jià)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，如果驗(yàn)證結(jié)果超過(guò)國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的80%，則說(shuō)明試劑質(zhì)控品的準(zhǔn)確程度較高（合格率符合要求）[7]。

針對(duì)HBsAb定量進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)分別選取HBsAb的最低值以及最高值血清標(biāo)本，標(biāo)注為ML和MH（本研究測(cè)定的對(duì)應(yīng)值分別為2.86IU/mL以及976.34IU/mL）；選擇標(biāo)本時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡可能地與實(shí)際說(shuō)明書的線性范圍最高限度、最低限度值進(jìn)行“匹配”，并對(duì)高值血清進(jìn)行稀釋；每一份混合的血清標(biāo)本，均應(yīng)借助電化學(xué)發(fā)光儀器，完成至少兩次平行檢測(cè)，并計(jì)算出平均值，便于后續(xù)的回歸分析。在驗(yàn)證之前，儀器必須時(shí)刻保證維持正常運(yùn)轉(zhuǎn)的狀態(tài)。根據(jù)CLSI EP6-A標(biāo)準(zhǔn)，如結(jié)果分布圖的斜率無(wú)限趨近于“1”，且上下波動(dòng)范圍均不超過(guò)0.03，并且r2值超過(guò)0.95，則可認(rèn)為驗(yàn)證結(jié)果達(dá)到先行通過(guò)線性范圍驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究基礎(chǔ)數(shù)據(jù)由UniCel DxI800全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀自動(dòng)生成，精密度結(jié)果由實(shí)際測(cè)量值與廠家提供值行直接對(duì)比；準(zhǔn)確程度結(jié)果與衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行對(duì)比；線性范圍趨勢(shì)結(jié)果以線性回歸曲線模式予以顯示，以斜率作為分析界定標(biāo)準(zhǔn)。

2.結(jié)果

2.1 基于UniCel DxI800全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的乙肝精密度結(jié)果

乙肝五項(xiàng)檢測(cè)批內(nèi)CV測(cè)定結(jié)果均在廠家提供數(shù)值之下，總CV測(cè)定結(jié)果均在廠家提供數(shù)值之下，見(jiàn)表1。

表1.基于UniCel DxI800全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的乙肝精密度結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確程度結(jié)果

基于UniCel DxI800全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)乙肝五項(xiàng)，三次實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示，PT均達(dá)到100%，準(zhǔn)確程度滿足要求。

2.3 線性范圍分布趨勢(shì)結(jié)果

基于檢測(cè)結(jié)果的回歸曲線顯示，r2=0.9958，處于“上下波動(dòng)臨界值0.03”的范圍之內(nèi)，超過(guò)0.95，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.討論

目前，臨床常用的電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定系統(tǒng)包含電化學(xué)發(fā)光、磁性微粒子固相載體、鏈霉親和素-生物素間接包被技術(shù)、檢測(cè)系統(tǒng)共四個(gè)部分。其中，電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)的核心為電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，其標(biāo)志物為三聯(lián)吡啶、遞電子體為三丙胺（Tripropylamine，TPA）、反應(yīng)啟動(dòng)方式為直流電場(chǎng)。在電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，里程碑式的標(biāo)記物為三聯(lián)吡啶釕，該物質(zhì)的核心優(yōu)勢(shì)為：①是一種分子量小，具備水溶性的物質(zhì)；②整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、應(yīng)用于檢測(cè)時(shí)，對(duì)檢測(cè)樣本造成的免疫損傷小，標(biāo)記難度較低；③能夠廣泛應(yīng)用于激素、DNA檢定；④與三丙胺共同構(gòu)成電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。電化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)過(guò)程為：①發(fā)光標(biāo)記物為三聯(lián)吡啶釕；②發(fā)光底物為三丙胺；③在直流電場(chǎng)下啟動(dòng)；④反應(yīng)產(chǎn)物為三丙胺自由基（TPA*）+620nm的光子[8]。按照上述過(guò)程，經(jīng)過(guò)迅速、可控的反應(yīng)之后，三聯(lián)吡啶釕可“催化”三丙胺，發(fā)出可見(jiàn)光。深度反應(yīng)過(guò)程為：①在電化學(xué)反應(yīng)中，三丙胺分子在電極作用下，失去電子，形成陽(yáng)離子三丙胺自由基；②繼續(xù)反應(yīng)期間，陽(yáng)離子三丙胺自由基會(huì)失去氫離子，形成三丙胺自由基；③至此階段，三丙胺自由基的后續(xù)反應(yīng)分為兩種：其一，在氧化作用下，形成二丙胺和丙醛；其二，繼續(xù)失去電子，形成Ru（bpy）3+3，經(jīng)過(guò)還原反應(yīng)后，首先生成激發(fā)態(tài)的Ru（bpy）2+3，最終生成基態(tài)Ru（bpy）2+3（基態(tài)Ru（bpy）2+3失去電子后，會(huì)還原成Ru（bpy）2+3。在上述電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定過(guò)程中，作為固相載體的物質(zhì)可選擇一種獨(dú)特的磁性微粒，該物質(zhì)的特性為：①直徑達(dá)到2.8μm；②在其表面凸凹結(jié)構(gòu)的作用下，包被面積會(huì)被放大；③該微粒在反應(yīng)體系中處于“懸浮”狀態(tài)，能夠形成穩(wěn)定、均勻的液相，可促使反應(yīng)效能大幅度提升；④經(jīng)過(guò)反應(yīng)后的磁性微珠容易在電磁場(chǎng)的作用下，實(shí)現(xiàn)磁性吸引和分離。

在上述基礎(chǔ)上，電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的過(guò)程為：①檢測(cè)樣本與經(jīng)過(guò)反應(yīng)生成的磁性微珠相結(jié)合；②轉(zhuǎn)移至電極，完成標(biāo)記后免疫復(fù)合物與游離組分的分離；③施加電壓，啟動(dòng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；④對(duì)生成的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。免疫復(fù)合物形成的具體過(guò)程為：第一抗體標(biāo)記物生物素會(huì)與微磁珠相結(jié)合；第二抗體標(biāo)記物Ruthenium會(huì)產(chǎn)生光信號(hào)。上述兩種抗體都能夠與靶抗原完成特異性結(jié)合。

總體而言，電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)為：①試劑穩(wěn)定；②結(jié)果穩(wěn)定性十分優(yōu)異，樣本呈現(xiàn)出的真實(shí)情況與檢測(cè)結(jié)果之間幾乎不會(huì)產(chǎn)生較大的差異；③檢測(cè)結(jié)果的線性范圍示范寬廣，光子數(shù)范圍為0～1億；④檢測(cè)過(guò)程的靈敏度極高；⑤檢測(cè)過(guò)程中與“試劑使用”有關(guān)的步驟，在操作方面相對(duì)簡(jiǎn)便（如試劑聯(lián)體包，成分獨(dú)立、穩(wěn)定性好），大幅度降低了誤操作對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響。

運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙肝血清標(biāo)志物的性能時(shí)，除了上文所述的優(yōu)點(diǎn)之外，儀器自帶的校準(zhǔn)報(bào)警分析系統(tǒng)，能夠?qū)崟r(shí)反映漏測(cè)值方面產(chǎn)生的所有錯(cuò)誤。比如，在“定標(biāo)點(diǎn)”過(guò)程中，如果其中一個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)未能及時(shí)生成結(jié)果，則定標(biāo)報(bào)告會(huì)在相應(yīng)的結(jié)果出顯示出“NG”，從而告知檢測(cè)人員，檢測(cè)過(guò)程有所遺漏。故檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性能夠得到保證。

本研究以試劑質(zhì)控品的精密度、準(zhǔn)確程度、線性范圍分布趨勢(shì)作為檢測(cè)指標(biāo)，三項(xiàng)結(jié)果均符合生產(chǎn)廠家提供的資料，達(dá)到了廠家聲稱的性能標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程均達(dá)到實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證結(jié)果可靠。