一種創(chuàng)新病理冰凍切片的冰錘組件及染色加熱組件在甲狀腺術中冷凍切片中應用

傅杭州 方慶全 陳宏 廈門大學附屬第一醫(yī)院病理科 （福建 廈門 361003）

內(nèi)容提要： 目的：優(yōu)化甲狀腺術中冷凍切片技術關鍵環(huán)節(jié)，以期提高其制片質(zhì)量。方法：分別比較甲狀腺術中冷凍切片工作中不同速凍方法、固定方式與蘇木素染色方法等對制片質(zhì)量的影響。速凍方法中，使用專利冰錘時，將套筒立于冰凍托頭的四周，通過螺紋將冰錘旋入套筒內(nèi)，經(jīng)觀察窗觀測組織的厚度，旋轉(zhuǎn)冰錘操縱部使冰錘下降至與組織面接觸即可。蘇木素染色方法中，使用專利加熱組件染色時，在染色杯中倒入適量的蘇木素，將染色杯放入預熱至50?C的水浴箱中，用染色架承載冰凍切片后，放入染色杯中染色30s即可。結(jié)果：專利冰錘的速凍時效為（63.72±1.49）s，與冷凍切片機自帶冰錘的（63.07±1.44）s無顯著差異；但專利冰錘速凍條件下的組織完整性得分為（8.79±0.10）分，顯著優(yōu)于后者的（7.96±0.14）分。冷凍切片切片后立即放入AAF液內(nèi)固定30s組的細胞核染色強度、細胞質(zhì)染色強度、核質(zhì)漿對比度3項指標的得分均顯著高于室溫放置20s后固定組與用熱風吹干后固定組（P均<0.05）。冷凍切片使用專利加熱組件染色優(yōu)良率為96.9%（155/160），高于用乙醇燈加熱的91.3%（146/160）（0.01

近年來，隨著術中冷凍切片研究的不斷深入，冷凍切片已經(jīng)被廣泛應用于術中病理診斷，指導臨床醫(yī)師制定手術方案與確定手術范圍[1,2]。新鮮甲狀腺組織由于血管豐富、質(zhì)地較軟、囊腫多見，其冷凍切片制片難度顯著高于其他組織，易出現(xiàn)切片不完整、組織結(jié)構(gòu)模糊、細胞腫大、細胞核染色不清晰、細胞質(zhì)染色不清晰、核質(zhì)對比度差等不良現(xiàn)象，進而影響病理診斷質(zhì)量。為此，作者對甲狀腺冰凍切片的幾個重要步驟過程進行優(yōu)化，以期提高制片質(zhì)量與診斷水平，指導臨床術中確定正確的手術方案。

1.材料與方法

1.1 一般材料

隨機抽取本科室2021年7月～2021年12月的甲狀腺冷凍切片標本。

儀器設備：一種病理冰凍切片的冰錘組件（專利證書號第3445758號）：由冰錘與套筒組成（圖1），冰錘外側(cè)面設有與套筒內(nèi)側(cè)面相互吻合的螺紋，套筒設有觀察窗，冰錘設有操縱部。使用時，將套筒立于冰凍托頭的四周，通過螺紋將冰錘旋入套筒內(nèi)，經(jīng)觀察窗觀測組織的厚度，旋轉(zhuǎn)冰錘操縱部使冰錘下降至與組織面接觸即可。此時冰錘底面處于水平狀態(tài)。

圖1.一種病理冰凍切片的冰錘組件（注：①套筒；②冰錘）

一種病理冰凍切片的染色加熱組件（專利證書號第3399678號）：由電熱恒溫水浴箱、不銹鋼杯和染色架組成（圖2）。使用時，在染色杯中倒入適量的蘇木素，將染色杯放入預熱至50?C的水浴箱中，用染色架承載冰凍切片后，放入染色杯中染色30s即可。

圖2.一種病理冰凍切片的染色加熱組件（注：①電熱恒溫水浴箱；②不銹鋼杯；③染色架）

主要試劑：包埋劑，AAF液（由95%乙醇：乙酸：甲醛=85:5:10組成），Harri蘇木素染液。

1.2 方法

冷凍切片的制備。

1.2.1 速凍方法的比較

收集60例新鮮甲狀腺標本，按張翠霞等[1]介紹的方法取2塊甲狀腺組織，放置于冰凍托頭上，加適量的包埋劑，移至冷凍切片機的冷凍臺，隨機分為A、B 2組。A組組織放置于冷凍臺后，立即在上方加蓋專利冰錘組件以加快速凍；B組組織放置于冷凍臺后，在上方加蓋冷凍切片機配置的冰錘加快速凍。2組速凍后的組織均切取厚度為6μm的冷凍切片，切片后立即放入AAF液內(nèi)固定30s，用一種病理冰凍切片的染色加熱組件染蘇木素后，水洗、分化、返藍、染伊紅、脫水、透明、中性樹膠封固、顯微鏡觀察。比較不同速凍方法條件下甲狀腺組織冷凍切片的速凍時效與組織完整性。速凍時效：新鮮甲狀腺組織被凍成凍塊所耗的時間。

1.2.2 固定方式的比較

收集60例新鮮甲狀腺標本，按A組的方法連續(xù)切片3片，隨機分為C、D、E 3組，C組按A組的方法及時固定，余操作同A組；D組室溫放置20s后固定，余操作同C組；E組用熱風吹干后固定，余操作同C組。比較不同固定方式條件下甲狀腺組織冷凍切片細胞核染色強度、細胞質(zhì)染色強度、核質(zhì)漿對比度3項指標的得分情況。

1.2.3 染色方法的比較

收集80例新鮮甲狀腺標本，按A組的方法連續(xù)切片2片后固定，隨機分為F、G組，F(xiàn)組按A組的方法染色及后續(xù)處理；G組染蘇木素步驟改為“在載玻片組織面滴加蘇木素，用乙醇燈從載玻片下方加熱切片30s”，余操作同F(xiàn)組。比較不同染色方法的優(yōu)良率與時效。

1.3 觀察指標與判定標準

細胞核染色強度、細胞質(zhì)染色強度、核質(zhì)對比度各10分，評分標準如下：細胞核染色強、細胞質(zhì)染色強、核質(zhì)對比清晰，則各得分為10分；若切片細胞核染色較弱、細胞質(zhì)染色較弱、核質(zhì)對比較不清晰，尚不影響觀察，減1～2分；若切片細胞核染色弱、細胞質(zhì)染色弱、核質(zhì)對比不清晰，一定程度上影響觀察，減3～6分；若切片細胞核染色模糊、細胞質(zhì)染色模糊、核質(zhì)對比不清晰，嚴重影響觀察，減7～10分。由2位質(zhì)控師雙盲評片，取其得分的平均值。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，用±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 速凍方法的比較

速凍時效性的比較：A組速凍時效為（63.72±1.49）s，B組為（63.07±1.44）s，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

組織完整性的比較：A組組織完整性得分（8.79±0.10）分，B組得分為（7.96±0.14）分，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.2 固定方式對甲狀腺冷凍切片的影響

不同固定方式條件下甲狀腺組織冷凍切片的染色結(jié)果見表1。由表1可見，E組細胞核染色強度、細胞質(zhì)染色強度、核質(zhì)對比度3項指標得分均優(yōu)于D組與E組（圖3）。

表1.不同固定方式甲狀腺冷凍切片3項指標評分結(jié)果(n=60,±s,分)

表1.不同固定方式甲狀腺冷凍切片3項指標評分結(jié)果(n=60,±s,分)

注：與C組比較， 0.01

組別 細胞核染色強度 細胞質(zhì)染色強度 核質(zhì)對比度C組 9.14±0.08 9.31±0.06 9.37±0.06 D組 8.67±0.09b 8.77±0.07b 9.16±0.06a E組 8.47±0.09b 8.65±0.07b 9.08±0.07b

圖3.固定方式對甲狀腺冷凍切片的影響（C：及時固定，細胞核染色強、細胞質(zhì)染色強、核質(zhì)對比清晰；D：放置20s后固定，細胞核染色較弱、細胞質(zhì)染色較弱、核質(zhì)對比較不清晰；E：熱風吹干后固定，細胞核染色弱、細胞質(zhì)染色弱、核質(zhì)對比不清晰。）

2.3 染色方法對甲狀腺冷凍切片的影響

染色優(yōu)良率的比較：F組的染色優(yōu)良率為96.9%（155/160），高于G組的91.3%（146/160），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.53，0.01

染色時效性的比較：染1或2張冷凍切片時，F(xiàn)組染色時間為（298.1±1.89）s，G組為（302.7±1.92）s，差異不顯著（P>0.05）。同時需要染3張切片時，F(xiàn)組染色時間顯著短于G組[（303.6±2.07），（558.8±1.88）s，t=91.31，P<0.0001]。

3.討論

冷凍切片是采用低溫條件將新鮮組織快速凍成凍塊后制作切片的過程，常用于術中快速病理診斷，可確定病變組織的性質(zhì)，能夠讓外科醫(yī)師在手術過程中根據(jù)快速病理診斷結(jié)果及時決定下一步的手術方式[3,4]。

甲狀腺癌是目前較為常見的一種甲狀腺惡性腫瘤，隨著診斷甲狀腺癌的醫(yī)療方法不斷改變，甲狀腺癌檢出率逐年上升[5]。但甲狀腺組織病理學形態(tài)差異較大，加之冷凍切片的制片質(zhì)量對組織形態(tài)亦有顯著的影響，為了提高甲狀腺術中病理診斷準確率，優(yōu)化其冷凍切片技術具有重要意義。

冷凍切片機已廣泛應用于病理學冷凍切片的制片工作，通常冷凍切片機設計有冰錘，可用于加蓋在需要速凍的組織上，使待凍組織能更快地凍成凍塊。但是作者發(fā)現(xiàn)，冷凍切片機原配的冰錘設計上存在缺陷，冰錘加蓋在待凍組織上后，多數(shù)待凍組織會發(fā)生傾斜，使部分組織受擠壓而人為變形，從而導致冷凍切片組織結(jié)構(gòu)不全，造成人為假象。為了解決冷凍切片機自帶冰錘的缺陷，作者研發(fā)設計了“一種病理冰凍切片冰錘組件”，該專利冰錘具有如下優(yōu)點：①套筒及冰錘使用比熱容優(yōu)質(zhì)的材質(zhì)制作，能較快和較持久地加速待凍組織速凍；②冰錘組件配合使用時，套筒上設置的可視窗可觀察冰錘下降的所在位置，可準確地根據(jù)組織厚度調(diào)整冰錘的高度，保證冰錘不擠壓待凍組織的前提下有效縮短速凍時間，從而既能減少冷凍切片產(chǎn)生冰晶與裂隙，又避免擠壓組織，提高組織完整性。

固定是冷凍切片制作過程的一個重要步驟，固定可使組織與細胞保持或盡量接近原有的形態(tài)，使水溶性物質(zhì)擴散，抑制細胞內(nèi)酶的活性，保持細胞膜的完整性，防止切片模糊；固定還能使組織中各物質(zhì)凝固與沉淀后產(chǎn)生不同的折射率，使染色后的切片有利于觀察。因此，甲狀腺組織凍塊切片后應及時、有效地固定，才能破壞或有效抑制組織細胞內(nèi)各種酶的活性，沉淀蛋白，防止組織腐敗與自溶，防止濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)脫落，減少上皮細胞皺縮，最大限度地縮小顯微鏡下冷凍切片與常規(guī)石蠟切片在組織細胞形態(tài)上的差異。有些制作甲狀腺冷凍切片的病理技師沒有事先準備好要貼冷凍切片的載玻片，而是先用載玻片貼了冷凍切片后，再在載玻片上標注病理號、患者姓名、病案號等信息，并且在固定前先觀察冷凍切片是否切片完整、有無切到所需要觀察的結(jié)節(jié)等，有的技師擔心冷凍切片“濕固定”在后續(xù)染色過程中會脫片，將冷凍切片晾干后再固定。作者實驗發(fā)現(xiàn)，甲狀腺冷凍切片立即固定并不會增加脫片的概率；而冷凍切片在室溫晾20s后再固定，其切片按相同程序染色后細胞核染色較弱、細胞漿染色較弱、核漿對比較不清晰；用熱風吹干后固定，由于電熱吹風干燥、高溫，對甲狀腺組織造成較為嚴重的影響，也導致染色效果較差。

冷凍切片染色易受染液溫度、試劑濃度、染色時長、環(huán)境、操作習慣等因素影響，其中蘇木素染色是至關重要的環(huán)節(jié)。冷凍切片蘇木素染色環(huán)節(jié)傳統(tǒng)方法通常需要用時2～4min，為了縮短蘇木素染色時間，許多病理技師會在冷凍切片組織面滴加蘇木素，然后用乙醇燈從載玻片下方加熱。乙醇燈加熱載玻片能使載玻片上的蘇木素溫度升高，加快蘇木素染色。但是該方法存在以下缺點：玻璃導熱速度慢，蘇木素溫度上升速度難以控制，蘇木素溫度無法監(jiān)測，乙醇燈的火焰范圍小造成一次僅能染色2張片，不穩(wěn)定的溫度易導致蘇木素氧化膜析出造成污染。上述缺陷導致冷凍切片染色質(zhì)量優(yōu)劣不一。作者設計了一種病理冰凍切片的染色加熱組件（專利證書號：第3399678號），具有顯著的適用性：①水浴加熱可設置恒定的、合理的蘇木素染色溫度，對縮短蘇木素染色時間提供了基礎；②采用不銹鋼材質(zhì)制作染色杯，具有導熱速度快的優(yōu)點，可顯著縮短蘇木素染液從室溫上升至設定溫度的時間；③染色杯設計為方形高杯，與染色架及載玻片的形狀相吻合，可很大程度地節(jié)約染液的用量；④不銹鋼杯與染色架均不易受熱變形，可重復使用，經(jīng)濟實惠；⑤不銹鋼杯與染色架的規(guī)格大小可以根據(jù)冷凍切片通常需要的染色片數(shù)進行調(diào)整，具有很強的實用性。因此，使用一種病理冰凍切片的染色加熱組件進行甲狀腺冷凍切片蘇木素染色，能高效、及時、高質(zhì)量地完成冷凍切片的染色，為甲狀腺術中快速病理診斷及時性、準確性提供保障。

本研究結(jié)果表明，在甲狀腺術中冷凍切片制作過程中，使用專利冰錘顯著優(yōu)于冷凍切片機自帶的冰錘；切取甲狀腺冷凍切片后需及時、正確的固定；使用一種病理冷凍切片的染色加熱組件進行蘇木素染色效果更佳。