銀離子泡沫敷料的亞慢性全身毒性研究

黃燕倩 莫怡飛 向健 張曉麗 盧玉沛 楊立峰 廣東省醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗所 （廣東 廣州 510080）

內容提要： 目的：比較不同浸提比例下銀離子泡沫敷料亞慢性全身毒性試驗結果的差異。方法：對兩組SD大鼠分別給予不同濃度的銀離子泡沫敷料浸提液，綜合比較臨床觀察、體重變化、血液學、血液生化、大體尸檢和組織病理學檢查結果，觀察兩組動物的亞慢性全身毒性反應。結果：浸提比例為0.4g/mL的銀離子泡沫敷料浸提液，會導致大鼠體重增長緩慢。結論：提高銀離子泡沫敷料的浸提比例，可以觀測到大鼠全身毒性反應。

研究表明，銀離子具有良好的廣譜抗菌性，可以有效殺滅細菌、真菌和霉菌，且較少產生抗菌性[1]。利用這一原理，銀離子在醫(yī)療衛(wèi)生領域等到廣泛的應用，例如在牙科材料、傷口修復和婦科疾病治療中都發(fā)揮著重要作用，而且也常用于導管、支架、硅橡膠等醫(yī)療器械[2]。尤其在創(chuàng)傷抗菌敷料上，對外科、多種疾病引起的皮膚潰瘍等創(chuàng)面治療具有突出效果[3]。然而，銀離子作為一種金屬離子，其抑菌殺菌作用無選擇性，在一定濃度下，對生物體正常的細胞也會造成的損傷，對人體依然具有一定的毒性作用[4]。鑒于銀離子優(yōu)秀的抗菌特性，銀離子抗菌材料已然成為當今醫(yī)療器械研究的熱點。如何安全合理地應用銀離子，探索其在生物體上引發(fā)生物毒性的閾值是值得關注的。本文對銀離子敷料兩種給藥濃度實驗結果進行比較，以期對銀離子敷料這一類醫(yī)療器械的全身毒性研究提供一定的參考。

1.材料與方法

1.1 一般材料

本實驗起止時間：2021年3月～2021年11月。

供試品液制備：取銀離子泡沫敷料，除吸水容量外分別按0.1g/mL和0.4g/mL的比例加入生理鹽水，37?C下放置72h，取浸提液作為供試品。浸提比例為0.1g/mL的浸提液設為A液，浸提比例為0.4g/mL的設為B液。生理鹽水作為對照液。

實驗動物：檢疫合格的SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，雌性未產并無孕。動物來源：廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 方法

設置A、B兩組實驗，每組各40只動物，雌雄各半，雌性未產并無孕。隨機分配為對照組和觀察組。A、B兩組觀察組動物按10mL/kg的比例分別皮下注射給予浸提比例為0.1g/mL和0.4g/mL的浸提液。對照組動物均按照10mL/kg的比例皮下注射給予生理鹽水。連續(xù)注射90d后，分別比較觀察組A與對照組A、觀察組B與對照組B動物的各項指標，比較給予不同濃度浸提液大鼠的全身毒性反應。實驗設計如表1所示。

表1.實驗設計

實驗期間每天觀察并記錄動物的一般狀態(tài)和毒性表現(xiàn)。于實驗開始時、實驗開始后每周及安樂死前記錄動物體重。實驗終期經腹主動脈采血后進行血液常規(guī)和血生化檢測。采血后對動物進行大體剖檢，及時稱量記錄各主要臟器的濕重，并進行組織病理學檢查。

1.3 觀察指標

比較臨床觀察、體重變化、血液學、血液生化、大體尸檢和組織病理學檢查結果，觀察兩組動物的亞慢性全身毒性反應。分析浸提液濃度與受試動物異常指標產生的相關性。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 臨床觀察

實驗期間，各組大鼠外觀、一般狀態(tài)和行為活動未見明顯異常。

2.2 動物體重

在B組實驗中，觀察組動物在實驗中后期體重增長速度明顯較對照組緩慢，且經統(tǒng)計學分析觀察組動物體重與對照組相比存在統(tǒng)計學差異。與對照組相比較，觀察組雌性動物體重在實驗第49天和第56天有顯著差異（P<0.05），第63天起至實驗結束，有極顯著差異（P<0.01）；觀察組雄性動物體重在第21天、第28天和第35天有顯著差異（P<0.05），第42天起至實驗結束，有極顯著差異（P<0.01）。在A組實驗中，觀察組與對照組相比較，雌性動物體重未見統(tǒng)計學差異，雄性動物在實驗第84天有顯著差異（P<0.05），在第90天有極顯著差異（P<0.01）。各組實驗動物體重變化見圖1。

圖1.各實驗組動物體重變化趨勢

2.3 血液學數(shù)據(jù)分析

A組實驗中，與對照組同性別動物相比較，觀察組雌性動物血小板（Platelet，PLT）升高，雌雄性動物白細胞（WhiteBlood Cell，WBC）均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在B組實驗中，與對照組同性別動物相比較，觀察組雄性動物紅細胞（Red Blood Cell，RBC）降低。A、B兩組實驗中其他血液學指標無統(tǒng)計學意義的差異（P>0.05）。以上統(tǒng)計學差異主要由個別數(shù)值偏差加大引起，臨床觀察未見動物異常反應，故認為差異無毒理學意義。見表2。

表2.血液數(shù)據(jù)(n=10,±s)

表2.血液數(shù)據(jù)(n=10,±s)

注1：凝血酶原時間（Prothrombin Time，PT），平均紅細胞體積（Mean Corpuscular Volume，MCV），紅細胞壓積（Hematocrit，HCT），血紅蛋白（hemoglobin，HGB）注2：與同一時期對照組同性別動物相比，aP<0.05，表示統(tǒng)計學上有顯著差異，bP<0.01，表示有極顯著差異；無標記即為P>0.05，表示無統(tǒng)計學差異

指標 雌性 雄性 雌性 雄性對照組A 觀察組A 對照組A 觀察組A 對照組B 觀察組B 對照組B 觀察組B PT(S) 8.2±0.4 8.3±0.5 11.4±4.1 9.7±1.4 8.44±0.33 8.14±0.42 9.34±0.56 9.06±0.43 RBC(×1012/L) 8.73±0.50 9.18±0.58 10.08±0.42 10.03±0.58 8.00±2.84 8.81±0.46 10.27±0.37 9.80±0.33b MCV(fL) 51.1±1.2 51.2±2.0 47.1±1.6 48.1±1.6 53.5±4.7 51.5±2.6 47.4±1.2 47.6±1.9 HCT(%) 44.6±2.1 46.9±2.6 47.5±2.2 48.3±3.6 46.3±2.5 45.2±1.4 47.4±2.1 46.6±1.5 HGB(g/L) 159±8 166±9 172±8 174±13 165±10 162±5 172±11 165±6 PLT(×109/L) 1,172±170 1,375±158a 1,285±132 1,293±381 1,157±165 1,254±95 1,279±140 1,389±189 WBC(×109/L) 9.08±3.23 6.19±1.39a 13.83±2.17 8.62±2.04b 9.00±2.50 10.35±2.87 13.71±4.30 15.04±3.93

2.4 臨床生化分析

在A組實驗中，與對照組動物同性別動物相比較，觀察組雌雄性動物白蛋白（Albumin，ALB）、總蛋白（Total Protein，TP）均降低，雌性動物血糖（Blood Glucose，GLU）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）升高，雄性動物堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、丙氨酸轉氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、甘油三酯（Triglyceride，TG）降低，肌酐（Creatinine，Cre）和BUN升高。在B組實驗中，與對照組動物同性別動物相比較，觀察組雌性動物Glu升高，雄性動物TP升高。A、B兩組實驗中其他臨床生化指標無統(tǒng)計學意義的差異（P>0.05）。見表3。

表3.臨床生化數(shù)據(jù)(n=10,±s)

表3.臨床生化數(shù)據(jù)(n=10,±s)

注1：天冬氨酸轉氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST），總膽固醇（Total Cholesterol，TCHO），總膽紅素（Total Bilirubin，TBil）注2：與同一時期對照組同性別動物相比，aP<0.05，表示統(tǒng)計學上有顯著差異，bP<0.01，表示有極顯著差異；無標記即為P>0.05，表示無統(tǒng)計學差異

指標 雌性 雄性 雌性 雄性對照組A 觀察組A 對照組A 觀察組A 對照組B 觀察組B 對照組B 觀察組B 35±3 32±2a 29±1 27±1b 37.0±1.4 35.4±2.1 31.1±0.7 31.4±1.3 36±6 44±12 77±15 63±12a 43.7±14.7 51.7±15.6 85.2±14.7 84.0±7.5 32±15 35±11 33±5 27±5a 51.7±9.3 59.0±39.8 69.7±17.9 65.2±8.9 130±45 148±57 123±25 129±21 153±28 130±28 210±58 206±44 2.10±0.48 2.17±0.28 1.52±0.29 1.54±0.20 2.28±0.38 2.20±0.42 1.48±0.25 1.55±0.23 42±6 52±20 36±6 55±10b 61.2±10.6 70.4±13.8 61.7±4.9 58.9±5.5 8.67±0.73 10.67±1.95a 9.16±1.00 10.64±3.01 7.38±0.89 8.37±0.85a 8.84±1.56 9.08±1.71 2.07±0.25 2.02±0.24 1.99±0.32 2.24±0.36 0.35±0.15 0.29±0.10 0.23±0.08 0.27±0.09 58±5 51±3b 51±3 45±2b 56.1±2.8 53.4±3.1 47.9±1.8 50.8±3.2a 0.69±0.28 0.79±0.25 1.10±0.30 0.77±0.23a 0.72±0.43 0.67±0.20 0.81±0.12 0.71±0.15 7.59±0.96 9.48±0.92b 6.44±0.87 7.70±1.56a 8.86±1.23 10.58±2.36 8.63±1.63 8.88±1.20 ALB(g/L) ALP(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) TCHO(mmol/L)Cre(μmol/L) Glu(mmol/L) TBil(μmol/L) TP(g/L) TG(mmol/L) BUN(mmol/L)

2.5 大體剖檢及臟器重量和系數(shù)

大體剖檢中，實驗的所有大鼠均未見明顯損傷或病變。解剖時及時記錄臟器濕重。經統(tǒng)計學分析，A組實驗中，觀察組雌性動物心臟重量及系數(shù)較對照組雌性動物減??；觀察組雄性動物肝臟重量及系數(shù)、腦系數(shù)較對照組雄性動物減小，差異具有統(tǒng)計學意義。B組實驗中，觀察組雌性動物心臟、肝臟臟器重量較對照組減小，腦系數(shù)增大；觀察組雄性動物心臟、脾臟、腎、腎上腺和腦系數(shù)增大，差異具有統(tǒng)計學意義。A、B兩組實驗中其他臟器重量、臟器系數(shù)無統(tǒng)計學意義的差異（P>0.05）。見表4、表5。

表4.各組大鼠臟器重量統(tǒng)計數(shù)據(jù)(n=10,±s,g)

表4.各組大鼠臟器重量統(tǒng)計數(shù)據(jù)(n=10,±s,g)

注：與同一時期對照組同性別動物相比，aP<0.05，表示統(tǒng)計學上有顯著差異，bP<0.01，表示有極顯著差異；無標記即為P>0.05，表示無統(tǒng)計學差異

臟器 雌性 雄性 雌性 雄性對照組A 觀察組A 對照組A 觀察組A 對照組B 觀察組B 對照組B 觀察組B心 1.065±0.150 0.917±0.071a 1.831±0.090 1.746±0.120 1.011±0.070 0.926±0.081a 1.606±0.116 1.541±0.153肝 8.199±1.247 7.700±0.486 14.532±1.138 12.357±0.961b 8.150±0.874 7.294±0.247a 13.566±0.908 12.394±1.517脾0.533±0.060 0.486±0.044 0.889±0.079 0.868±0.134 0.539±0.061 0.537±0.102 0.888±0.079 0.911±0.130腎1.765±0.219 1.720±0.139 3.058±0.233 3.161±0.190 1.817±0.214 1.768±0.101 3.077±0.210 3.083±0.304腎上腺 0.060±0.010 0.059±0.008 0.060±0.008 0.059±0.010 0.062±0.008 0.053±0.011 0.061±0.008 0.063±0.010胸腺 0.447±0.050 0.404±0.081 0.520±0.158 0.474±0.143 0.416±0.093 0.392±0.087 0.535±0.116 0.448±0.133腦1.934±0.080 1.948±0.085 2.119±0.099 2.132±0.060 2.003±0.147 1.982±0.096 2.205±0.128 2.157±0.082子宮 0.773±0.173 0.771±0.178 3.901±0.308 3.838±0.277 0.692±0.142 0.849±0.640 3.680±0.386 3.642±0.392卵巢 0.142±0.034 0.147±0.025 1.446±0.134 1.452±0.138 0.129±0.034 0.114±0.014 1.417±0.151 1.340±0.132

表5.各組大鼠臟器系數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)(n=10,±s,%)

表5.各組大鼠臟器系數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)(n=10,±s,%)

注：與同一時期對照組同性別動物相比，aP<0.05，表示統(tǒng)計學上有顯著差異，bP<0.01，表示有極顯著差異；無標記即為P>0.05，表示無統(tǒng)計學差異

臟器 雌性 雄性 雌性 雄性對照組A 觀察組A 對照組A 觀察組A 對照組B 觀察組B 對照組B 觀察組B心0.350±0.040 0.302±0.024b 0.307±0.016 0.308±0.016 0.305±0.020 0.307±0.025 0.255±0.014 0.274±0.019a肝2.697±0.332 2.541±0.280 2.432±0.124 2.176±0.112b 2.463±0.268 2.417±0.087 2.157±0.122 2.204±0.188脾 0.175±0.014 0.161±0.023 0.149±0.015 0.153±0.020 0.162±0.014 0.177±0.029 0.141±0.012 0.162±0.015b腎 0.580±0.050 0.566±0.047 0.513±0.045 0.557±0.031a 0.549±0.058 0.586±0.027 0.490±0.038 0.551±0.064a腎上腺 0.020±0.003 0.020±0.003 0.010±0.001 0.010±0.001 0.019±0.002 0.017±0.004 0.010±0.001 0.011±0.001a胸腺 0.148±0.023 0.133±0.029 0.087±0.026 0.083±0.024 0.126±0.029 0.130±0.025 0.085±0.018 0.071±0.029腦 0.639±0.036 0.643±0.063 0.355±0.018 0.376±0.023a 0.606±0.052 0.657±0.043a 0.351±0.028 0.387±0.041a子宮 0.254±0.048 0.255±0.066 0.655±0.065 0.678±0.062 0.210±0.046 0.280±0.206 0.586±0.067 0.652±0.092卵巢 0.047±0.013 0.048±0.007 0.242±0.023 0.256±0.028 0.039±0.010 0.038±0.005 0.226±0.030 0.241±0.036

2.6 組織病理

對所有大鼠的主要臟器進行組織病理學觀察，主要見脾臟含鐵血黃素沉積，偶見肝內肉芽腫，在對照組與觀察組大鼠均可見，認為與實驗樣品無關。見圖2、圖3。

圖2.肝臟，肉芽腫

圖3.脾臟，含鐵血黃素沉積

3.討論

本次實驗采用同樣的染毒方式與染毒周期，比較不同濃度下銀離子泡沫敷料亞慢性全身毒性試驗差異。研究結果表明，當浸提比例為0.4g/mL時，從實驗中期開始直至實驗結束，觀察組大鼠體重增長速度均小于對照組同性別大鼠，同一時期對照組大鼠體重明顯大于觀察組同性別大鼠，差異顯著，并且隨著時間推移，差異呈逐漸增大趨勢。這種現(xiàn)象在雌雄性大鼠中均出現(xiàn)。觀察組動物心臟、肝臟重量較對照組小，但僅雌性動物間的差異具有統(tǒng)計學意義。血液學和臨床生化指標與對照組相比較未發(fā)現(xiàn)明顯的異常。綜上，認為在0.4g/mL的浸提比例下，銀離子敷料明顯影響觀察組大鼠體重增長。當浸提比例為0.1g/mL時，觀察組雌性動物體重與對照組同性別動物比較，未見有統(tǒng)計學意義的差異。僅觀察組雄性動物在實驗第84天和第90天時與對照組雄性動物相比體重較低，差異有統(tǒng)計學意義，觀察組動物心臟、肝臟重量較對照組小，但僅雄性動物間的差異具有統(tǒng)計學意義。血液學和臨床生化指標與對照組相比較未發(fā)現(xiàn)明顯的異常。綜合分析，在0.1g/mL的浸提比例下，銀離子敷料未引起明顯的亞慢性全身毒性，或在該實驗的實驗終點前，銀離子引起的全身毒性不明顯。

研究表明，銀離子濃度在10ppm時殺菌作用較強，且對體外細胞存活率無任何影響，在濃度為12.5～25ppm時，銀離子的細胞毒性增加非常明顯[4]。銀離子抗菌敷料在發(fā)揮殺菌特性的同時，也會產生一些不良反應。銀的不良反應包括致敏、皮膚染色、含銀敷料干擾醫(yī)療成像以及銀中毒。本研究通過對銀離子敷料的不同浸提比例浸提液進行亞慢性全身毒性研究，通過比較發(fā)現(xiàn)，低濃度的浸提液未引起動物明顯的異常反應，或僅在實驗接近終點時，對雄性動物體重增長有一定的影響。高濃度的浸提液能夠更快表現(xiàn)出對動物體重增長產生抑制作用，具有一定的毒性，符合銀離子濃度增加，細胞毒性增強的特點。然而，高濃度的浸提液遠遠超過實際臨床使用劑量，盡管能夠表明銀離子在一定濃度下對人體會造成危害，但生物學評價的目的并非證明一種物質或器械在極大的、超乎實際的接觸劑量下的危害作用，而是為臨床安全使用器械提供依據(jù)和保障[5]。合理的使用器械，把使用器械帶來的不良影響降到可接受范圍內，發(fā)揮器械臨床使用最大效益才是醫(yī)療器械生物學安全性評價的最終目的。因此，對醫(yī)療器械做生物安全性評價實驗時，要把握好實驗樣品的浸提比例和浸提時間，在合理的實驗條件范圍內對器械做安全評估，對產品臨床長期使用可能帶來的不良反應做出預測，規(guī)避風險，使高效有用的器械被采用，在安全合理的使用條件下更好地服務患者。

在本次研究中，僅在動物體重變化這一觀察指標體現(xiàn)出明顯差異，其他臨床檢測指標和組織病理學并未見明顯異常。有研究表明，在完整的皮膚表面使用銀離子敷料，在汗水和皮脂的作用下，銀離子會滲透皮膚進入體內，最終經肝腎代謝，也可經毛發(fā)和指甲生長代謝。在大鼠的開放性創(chuàng)面模型Ag標記的硝酸銀溶液應用治療研究中發(fā)現(xiàn)肝臟存在顯著的銀同位素吸收，而腎臟中存在較低水平[6]。在關于銀離子的全身毒性試驗中，可以增加動物攝食量和飲水量的檢測，以及動物血液、尿液中銀離子濃度的含量檢測[7,8]。條件允許時，可以采用同位素標記的方法，了解銀離子在動物身體中的全身吸收情況，為全身毒性研究提供更全面直接的依據(jù)。