使用無(wú)水乙醇為浸提介質(zhì)進(jìn)行血液灌流器的遺傳毒性試驗(yàn)研究

陸金健 王嘉銘 南方 楊文潤(rùn) 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要： 目的：通過(guò)試驗(yàn)探索無(wú)水乙醇作為血液灌流器遺傳毒性試驗(yàn)浸提介質(zhì)的可行性。方法：將無(wú)水乙醇作為浸提介質(zhì)使用灌注的方式充滿(mǎn)灌流器，使用浸提液分別進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)和體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)。結(jié)果：細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中與陰性對(duì)照組相比5種菌株自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)均無(wú)顯著性差異；體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)中所有組的總突變頻率與陰性對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異；體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)中染色體畸變率與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性增加。結(jié)論：無(wú)水乙醇作為浸提介質(zhì)時(shí)對(duì)試驗(yàn)體系中的細(xì)菌、細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，且在本試驗(yàn)條件下無(wú)致突變性，選擇無(wú)水乙醇作為浸提介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)是可行的。

血液灌流是通過(guò)血液灌流器吸附作用來(lái)清除血液中的內(nèi)源性或外源性毒素，并將凈化了的血液回輸?shù)襟w內(nèi)的一種血液凈化的方法，可有效清除血液中的中大分子物質(zhì)，代謝廢物以及毒素[1]。血液灌流器在醫(yī)療領(lǐng)域主要應(yīng)用于急性藥物和毒物中毒、尿毒癥毒素的清除、降脂的新療法、提高移植腎的存活率及治療皮膚病等。屬于血液循環(huán)短期接觸的外部接入醫(yī)療器械，根據(jù)GB/T 16886.1-2022《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過(guò)程中的評(píng)價(jià)與試驗(yàn)》[2]的要求需進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)。遺傳毒性試驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)器械及其浸提液引起的基因突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變以及其他DNA或基因毒性。本試驗(yàn)采用GB/T 16886.3-2019《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)》[3]中推薦的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)和體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)的組合。

由于血液灌流器主要是通過(guò)其吸附性對(duì)血液進(jìn)行凈化，當(dāng)使用含血清培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)時(shí)，會(huì)吸附血清蛋白等其他一些未知的營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致含血清培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，使得試驗(yàn)無(wú)法正常進(jìn)行[4]。本試驗(yàn)采用無(wú)水乙醇做為浸提介質(zhì)，采用灌注的方式進(jìn)行浸提，探究無(wú)水乙醇做為血液灌流器浸提介質(zhì)進(jìn)行遺傳毒性實(shí)驗(yàn)的可行性。

1.材料與方法

1.1 一般材料

本試驗(yàn)起止時(shí)間：2022年7月18日～2022年8月25日。

菌株：鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷性菌株TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535（MOLTOX公司），購(gòu)自上海寶錄生物科技有限公司。使用前經(jīng)組氨酸缺陷型、脂多糖缺陷、R因子、四環(huán)素、uvrB修復(fù)缺陷性和自發(fā)回復(fù)突變鑒定合格，且傳代次數(shù)均在5代以?xún)?nèi)[5]。

細(xì)胞株：小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Y TK+/－3.7.2C）、中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（CHL），均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供，小鼠淋巴瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)THMG進(jìn)行自發(fā)突變清除，自發(fā)突變頻率在50×10-6～170×10-6之間[6,7]。

主要試劑：胎牛血清、熱滅活牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗購(gòu)自GIBCO公司，無(wú)水乙醇、組氨酸、生物素、氯化鈉、三氟胸苷購(gòu)自、甲磺酸甲酯、絲裂霉素C、秋水仙素均購(gòu)自Sigma公司，葡萄糖-6-磷酸、輔酶Ⅱ、環(huán)磷酰胺購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司，技術(shù)瓊脂粉購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，PBS、底層培養(yǎng)基購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司，甲醇、冰醋酸購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。0.9%氯化鈉注射液購(gòu)自廣東科倫藥業(yè)有限公司，S9（MOLTOX公司）現(xiàn)配現(xiàn)用。

主要儀器：生物安全柜（新華醫(yī)療）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）、空氣浴培養(yǎng)搖床（德國(guó)IKA）、恒溫水浴鍋（德國(guó)JULABO）、渦旋儀（汗諾儀器）、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Life Technologies）、倒置顯微鏡（olympus）、顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)（徠卡）、臺(tái)式離心機(jī)（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

1.2.1.1 試驗(yàn)液制備

試驗(yàn)組：無(wú)菌操作，取樣品整體加入無(wú)水乙醇灌滿(mǎn)，在37?C下浸提72h。陰性對(duì)照組：無(wú)菌操作，取樣品整體加入0.9%氯化鈉注射液灌滿(mǎn)，在37?C下浸提72h。陽(yáng)性對(duì)照：加S9：TA97、TA98、TA100、TA1535 0.1mg/mL 2-氨基芴，TA102 0.5mg/mL 1，8-二羥基蒽醌；不加S9：TA97、TA98、TA102 1.0mg/mL敵克松，TA100、TA1535 1.0mg/mL疊氮化鈉。

1.2.1.2 試驗(yàn)方法

取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無(wú)菌小三角瓶或無(wú)菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，在37?C、120r/min振蕩培養(yǎng)12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活菌數(shù)不少于1×109CFU/mL。融化頂層培養(yǎng)基分裝于無(wú)菌小試管，每管2mL，在45?C水浴中保溫。

在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入樣品液0.1mL、新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物0.1mL和10%S9混合液0.5mL。無(wú)活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。試管內(nèi)容物混合后鋪至最低瓊脂營(yíng)養(yǎng)平板的表面。在培養(yǎng)前待頂層瓊脂固化。樣品組分別設(shè)三個(gè)平行皿。

陰性對(duì)照組分別加入0.1mL同批浸提介質(zhì)和新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物0.1mL，活化組再加10% S9混合液0.5mL，無(wú)活化組加0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入誘變劑0.1mL和新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物0.1mL，活化組再加10% S9混合液0.5mL，無(wú)活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。陰性及陽(yáng)性對(duì)照組分別設(shè)3個(gè)平行皿。全部平皿置37?C倒置培養(yǎng)72h觀察各個(gè)皿內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況并對(duì)各個(gè)皿的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)

1.2.2.1 試驗(yàn)液制備

試驗(yàn)組：無(wú)菌操作，取樣品整體加入無(wú)水乙醇灌滿(mǎn)，在37?C下浸提72h。陰性對(duì)照：無(wú)菌操作，取樣品整體加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基灌滿(mǎn)，在37?C下浸提72h，試驗(yàn)前加入終濃度為10%的胎牛血清。陽(yáng)性對(duì)照：無(wú)活化組為甲磺酸甲酯，活化組為環(huán)磷酰胺。

1.2.2.2 試驗(yàn)方法

取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106/mL。無(wú)活化系統(tǒng)組取10mL細(xì)胞懸液與0.2mL試驗(yàn)液或?qū)φ掌芬约癙BS 1mL混合，加入含血清培養(yǎng)基至終體積為20mL；有活化系統(tǒng)組取10mL細(xì)胞懸液，加入0.2mL試驗(yàn)或?qū)φ諛悠芬约癝9混合液1mL，加入含血清培養(yǎng)基至終體積為20mL。

將上述混合液置于37?C，5% CO2，飽和濕度條件下處理4h（有和無(wú)活化系統(tǒng)）和24h（無(wú)活化系統(tǒng)）。處理結(jié)束后離心，棄上清液，用磷酸緩沖鹽溶液或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2遍，重新懸浮細(xì)胞于含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，并調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL。

PE0平板：PE0（0天的平板接種效率）測(cè)定：取適量細(xì)胞懸液，作梯度稀釋至8個(gè)細(xì)胞/mL，接種96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6個(gè)細(xì)胞/孔），每個(gè)劑量作2塊板，37?C，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。

PE2平板：第2天表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，按PE0接種。每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在106/mL以下。

TEF拮抗平板：第2天表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，加入TFT（三氟胸苷，終濃度為3μg/mL），混勻，接種96孔板（每孔加0.2mL，即平均2000個(gè)細(xì)胞/孔），每個(gè)劑量作2塊板，37?C，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d。

對(duì)PE0，PE2平板計(jì)算無(wú)集落生長(zhǎng)的孔數(shù)，對(duì)TFT抗性拮抗平板應(yīng)計(jì)算無(wú)小集落孔數(shù)、無(wú)集落孔數(shù)。每個(gè)劑量組數(shù)據(jù)求平均數(shù)，計(jì)算平板效率PE=-ln（EW/TW）/1.6、相對(duì)存活率RS=PE0(樣品組)/PE0(對(duì)照組)×100%、TFT抗性突變頻率T-MF=[-ln(EW/TW)/n]/PE2和小集落突變百分率SCM(%)=(S-MF)/(T-MF)，同時(shí)對(duì)每組平板突變頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

1.2.3.1 試驗(yàn)液制備

試驗(yàn)組：無(wú)菌操作，取樣品整體加入無(wú)水乙醇灌滿(mǎn)，在37?C下浸提72h。陰性對(duì)照：無(wú)菌操作，取樣品整體加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基灌滿(mǎn)，在37?C下浸提72h，試驗(yàn)前加入終濃度為10%的胎牛血清。陽(yáng)性對(duì)照：無(wú)活化組為絲裂霉素C，活化組為環(huán)磷酰胺。

1.2.3.2 試驗(yàn)方法

接種一定數(shù)量細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶50%左右時(shí)吸出培養(yǎng)液，加入對(duì)照品或供試品、S9混合液（不加S9混合液時(shí)，需用PBS補(bǔ)足）、以及新鮮培養(yǎng)液，無(wú)水乙醇浸提液的終濃度為1%（V/V）。全部置于培養(yǎng)箱中。短期接觸組接觸結(jié)束后吸去培養(yǎng)皿中的液體，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組同法制備。所有試驗(yàn)組于24h內(nèi)收獲細(xì)胞，收獲前4h加入終濃度為1μg/mL秋水仙素。接觸處理結(jié)束后，加入適量胰酶將細(xì)胞消化收集取出，用5mL 0.075mol/L氯化鉀溶液低滲一次，固定液固定兩次后制片。封片晾干后在光學(xué)顯微鏡下每一試驗(yàn)組選擇200個(gè)分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體畸變分析，記錄畸變細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)。

2.結(jié)果分析

2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。72h培養(yǎng)結(jié)束后，試驗(yàn)組的五種菌株均可正常生長(zhǎng)，且在加與不加S9條件下，自發(fā)回復(fù)突變數(shù)均小于陰性對(duì)照組的2倍；陽(yáng)性對(duì)照組自發(fā)回復(fù)突變數(shù)均大于陰性對(duì)照組的3倍。

表1.細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)菌落數(shù)

2.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)

體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。與陰性對(duì)照組相比較試驗(yàn)組短期接觸組、活化組和長(zhǎng)期接觸組的相對(duì)存活率分別為96.36%、109.20%和113.73%，未出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性。突變頻率分別為69.53×10-6、66.66×10-6和53.59×10-6，無(wú)顯著性差異。

表2.體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)組各個(gè)組的相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)均不低于80%。每組觀察200個(gè)分散良好的中期分裂相，活化組陰性對(duì)照畸變率為0.5，非活化長(zhǎng)期接觸組畸變率為0.5，除陽(yáng)性對(duì)照外其余試驗(yàn)組均未發(fā)現(xiàn)畸變細(xì)胞。

表3.體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

3.討論

血液灌流器屬于血液循環(huán)短期接觸的外部介入醫(yī)療器械，是三類(lèi)醫(yī)療器械，考慮到其可瀝濾物可能進(jìn)入血液并在其移除后還會(huì)存在，因此需進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)。導(dǎo)致醫(yī)療器械產(chǎn)生遺傳毒性的原因多種多樣，單一試驗(yàn)無(wú)法檢測(cè)出所有遺傳毒性物質(zhì)，需根據(jù)實(shí)際情況選擇試驗(yàn)組合[8,9]。遺傳毒性主要表現(xiàn)為基因突變和染色體損傷，細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)可檢測(cè)出絕大部分的DNA損傷遺傳毒性物質(zhì)，但某些特定的例如鹵烴類(lèi)物質(zhì)卻無(wú)法檢出，且細(xì)菌為原核生物，采用細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)不具有代表性，需增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)和體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)可檢測(cè)出造成DNA損傷和染色體畸變的遺傳毒性物質(zhì)，本試驗(yàn)選擇體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)與細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)進(jìn)行組合[10]。遺傳毒性試驗(yàn)常用的浸提介質(zhì)有含血清培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基，0.9%氯化鈉注射液和二甲基亞砜，因不同類(lèi)型浸提介質(zhì)可浸提出的物質(zhì)不同，采用單一浸提介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，所以選擇兩種不同的浸提介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)[11]。因血液灌流器主要是利用了內(nèi)部填充物的吸附作用達(dá)到治療效果，在使用含血清培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞無(wú)法正常生長(zhǎng)導(dǎo)致試驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行的現(xiàn)象。二甲基亞砜作為一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)溶劑，可溶解絕大部分有機(jī)物，采用灌注的方式對(duì)血液灌流器進(jìn)行浸提可能會(huì)導(dǎo)致某些材料發(fā)生溶解，破壞了器械的完整性。在GB/T 16886.3-2019標(biāo)準(zhǔn)中這是不被允許的。所以含血清培養(yǎng)基和二甲基亞砜不適用于血液灌流器的浸提。而乙醇作為一種有機(jī)溶劑，可與試驗(yàn)體系混溶，且樹(shù)脂，活性炭均不溶于乙醇，且由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，用無(wú)水乙醇作為浸提介質(zhì)時(shí)在細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中，5種細(xì)菌均可正常生長(zhǎng)回復(fù)突變數(shù)無(wú)明顯變化。在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)中各試驗(yàn)組的相對(duì)存活率均在90%以上，未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)中各試驗(yàn)組的相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)均不低于80%，說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，乙醇對(duì)CHL細(xì)胞為表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。在遺傳毒性方面三個(gè)試驗(yàn)均未表現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果，由此可見(jiàn)在本試驗(yàn)條件下無(wú)水乙醇作為浸提介質(zhì)本身并不具備遺傳毒性[12]。固選擇無(wú)水乙醇作為浸提介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)是可行的。但考慮到細(xì)胞毒性的影響，且細(xì)胞生長(zhǎng)需要較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，浸提后的0.9%氯化鈉注射液和無(wú)水乙醇無(wú)法作為試驗(yàn)液直接進(jìn)行試驗(yàn)，在GB/T 16886.3-2019中的附錄A中提到采用0.9%氯化鈉注射液作為浸提介質(zhì)時(shí)需用含血清培養(yǎng)基稀釋至10%再進(jìn)行試驗(yàn)，采用無(wú)水乙醇作為浸提介質(zhì)時(shí)需用含血清培養(yǎng)基稀釋至1%再進(jìn)行試驗(yàn)。由于0.9%氯化鈉注射液和無(wú)水乙醇均采用稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，考慮到稀釋后可能導(dǎo)致毒性無(wú)法檢出，固采用無(wú)血清培養(yǎng)基浸提后補(bǔ)充10%血清作為浸提介質(zhì)與無(wú)水乙醇進(jìn)行組合，對(duì)血液灌流器進(jìn)行遺傳毒性檢測(cè)。