體外診斷試劑參考區(qū)間審評關注點及應用實例

王豐 張威鵬 任平一 深圳市市場監(jiān)督管理局許可審查中心 （廣東 深圳 518000）

內容提要： 針對定量體外診斷試劑產品的參考區(qū)間研究資料歸納出審評關注點，并分別提供了參數(shù)法與非參數(shù)法建立參考區(qū)間的案例進行分析。以期供評審人員在技術審評過程中參考，幫助企業(yè)理解和把握整個研究資料的編寫要點。

參考區(qū)間通常由其參考上限和參考下限組成，部分產品可僅有參考上限或下限。擬上市產品在注冊申報時主要討論健康人群的參考區(qū)間?，F(xiàn)對定量體外診斷試劑參考區(qū)間研究資料的審評關注點進行歸納，并舉例說明。

1.審評關注點

1.1 確定途徑的選擇

國內外無上市同類產品應建立參考區(qū)間。國外有已上市產品可驗證原始參考區(qū)間在中國人群的適用性。國內有已上市同類產品，可選擇建立或驗證國內已注冊產品的參考區(qū)間。已經有國內共識、醫(yī)學決定水平的檢測項目，可不再建立參考區(qū)間[1]。對擬上市產品可參照圖1進行初步判斷，選擇合適的途徑。

圖1.參考區(qū)間的確定路徑圖

關注點：是否需要建立或可驗證轉移參考區(qū)間。國內外已有同類且成熟產品，可采用驗證的方法轉移其參考區(qū)間。

1.2 建立方案的確定

1.2.1 樣本的選擇

應制定納排標準，選擇“表觀健康”的適用人群入組，并按臨床決策意義、篩選個體的特征等因素進行分組。入組的參考人群分布組成直接影響著參考區(qū)間建立的科學性與適用性。根據(jù)最新公布的《體外診斷試劑參考區(qū)間確定注冊審查指導原則》[1]，建議申請人通過多中心招募的形式納入?yún)⒖既巳骸?/p>

關注點：確定待檢項目的適用人群，明確該項目“表觀健康”的參考個體，明確納排標準。可參考對比試劑說明書、臨床檢驗章程、標準及指導原則等進行判斷，考察參考個體的分布組成是否滿足以上要求。

例如：脂蛋白相關磷脂酶A2測定試劑盒，納入排除標準中應排除無動脈粥樣硬化的患者；雄烯二酮測定試劑盒要明確是否排除遺傳性腎上腺皮質增生、腎上腺皮質功能減退等疾病人群；D-二聚體測定試劑盒的排除標準應考慮產品宣稱的“彌散性血管內凝血及溶栓治療”適應證；葉酸（Folate）測定試劑盒是否排除巨幼紅細胞性貧血人群等。

1.2.2 樣本采集與處理

采樣前應確保參考個體的狀態(tài)良好，并按說明書進行樣本的采集與處理。

關注點：納入的參考個體是否處于良好的狀態(tài)；采集的樣本是否明確其來源和機構名稱；采用的樣本是否符合說明書聲稱的要求；研究報告中是否已詳細說明樣本類型、儲存方式等情況。

例如：血液樣本應區(qū)分采樣部位，如醛固酮測定試劑盒需補充仰臥位、直立位樣本的采集方法，且該項目與生理節(jié)律有關，還應明確采血時間，并相應在說明書中列明[2]；尿液樣本應明確采集時間和方式，說明是否添加防腐劑等，如尿轉鐵蛋白測定試劑盒。

1.2.3 樣本檢測

應采用產品宣稱的檢測系統(tǒng)（含樣本前處理產品、檢測試劑、校準品、質控品、檢測設備等）進行樣本檢測。

關注點：是否與說明書宣稱的保持一致。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

檢測項目可根據(jù)臨床意義研究參考區(qū)間的單側或雙側界限。詳細的分析過程見圖2。

圖2.參考區(qū)間建立的數(shù)據(jù)分析過程

關注點：參考對比產品或同類產品的說明書。根據(jù)預期用途、專家共識等判斷采用雙側還是單側界限。

1.2.4.1 確定樣本數(shù)量

根據(jù)CLSI EP28-A3c[3]的要求，采用90%置信區(qū)間估計參考區(qū)間時，樣本量應≥120例，如需分組則每組都要≥120例。新生兒、幼兒、老年人等樣本難以獲得的人群可以少于120例[4]。

關注點：根據(jù)采用的置信區(qū)間不同，審核樣本的例數(shù)是否滿足要求。

例如：孕酮測定試劑盒應根據(jù)孕周的大小對其參考區(qū)間進行分組，如采用90%的置信區(qū)間則每組應采用至少120例樣本進行研究。

1.2.4.2 繪制分布圖

可通過繪制分布圖的方法可以直觀地了解所得數(shù)據(jù)的分布特性（如數(shù)據(jù)對稱性或正態(tài)峰）[1]?？墒褂肧PSS對參考值的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗分析，根據(jù)數(shù)據(jù)的特征進行選擇適用的檢驗方法。

關注點：判斷數(shù)據(jù)的分布特征為正態(tài)或偏態(tài)，選擇下一步分析方法及途徑。

例如：糖化血紅蛋白測定試劑盒需要補充各研究數(shù)據(jù)屬于正態(tài)分布的統(tǒng)計分析過程等。

1.2.4.3 判斷離群值

推薦使用Dixon方法和Tukey法兩種方法進行離群值的判定。

Dixon法適用于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，通常利用比值D/R≥1/3來判斷離群值[1]；Tukey法用于正態(tài)分布數(shù)據(jù)，通常取四分位間距上下限[Q3+1.5×IQR，Q1–1.5×IQR]來判斷其離群值[5,6]。

以上兩種方法確定的離群值均需要有明確原因的才可剔除，如無明確原因，應將該數(shù)據(jù)保留。

關注點：離群值的判斷是否正確，是否需要剔除，剔除后需補齊樣本數(shù)重新進行判定。

1.2.4.4 分組比較

參考區(qū)間的分組比較應根據(jù)以下準則：是否對臨床決策有意義或是否具有明確的生理學意義。應結合數(shù)據(jù)的分布特征選擇分析方法，如數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布、且兩組間的比較時，申請人可采用Z檢驗，而多組間比較可采用F檢驗等。不存在統(tǒng)計學意義的組間可以合并參考區(qū)間[7]。

關注點：根據(jù)臨床意義進行分組（可參考對比試劑），分組后每組的樣本量都要滿足要求。

例如：脂蛋白相關磷脂酶A2測定試劑盒的參考區(qū)間與年齡有高度相關性，應確保每個年齡段有一定的樣本量，并分別統(tǒng)計分析。

1.2.4.5 建立參考區(qū)間

主要分為參數(shù)法和非參數(shù)法。①參數(shù)法亦稱正態(tài)分布法。采用該方法要求數(shù)據(jù)接近正態(tài)分布或經轉換后呈正態(tài)分布，樣本量見表1。該方法建立參考區(qū)間的結果比較穩(wěn)定，不易受到兩端數(shù)據(jù)的影響[1]。②非參數(shù)法亦稱百分位數(shù)法。如參考值數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，可采用非參數(shù)法確定參考區(qū)間，樣本量見表1。該方法容易受到兩端數(shù)據(jù)的影響，不適用于樣本含量較小時[1]。

表1.采用參數(shù)法/非參數(shù)法的樣本數(shù)量、置信區(qū)間及參考區(qū)間上限和下限

關注點：分析方法是否適宜，樣本量是否滿足所宣稱置信區(qū)間的最低要求，結果是否正確。

例如：可溶性生長刺激表達基因2蛋白檢測試劑盒，未提供樣本分布狀態(tài)的研究，應明確數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布才適用于百分位數(shù)法。

1.3 參考區(qū)間的驗證

驗證參考區(qū)間必須同時滿足：原始參考區(qū)間的研究具可信性，如有已發(fā)布實施的臨床檢測參考區(qū)間標準等；檢測系統(tǒng)需具有可比性；分析前因素需具有可比性；參考人群的適宜性，即適用人群相一致，或包含其參考人群[1]。

如不能同時滿足上述條件，則需要建立自己的參考區(qū)間。參考區(qū)間建立及驗證流程可見圖3。

圖3.參考區(qū)間建立及驗證流程

關注點：以上四個條件缺一不可。

1.3.1 比對評估研究

可參照《免于臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價技術指導原則》[8]，通過方法學比對的方法，對申報產品與原始參考區(qū)間建立時的檢測系統(tǒng)的可比性進行研究。通過列表的方式，對比參考人群分布的地理位置、生物特征、參考區(qū)間研究分析前的因素等[1]。

注意，采用驗證方法轉移參考區(qū)間時，應首選轉移注冊申報中臨床試驗或臨床評價所選擇的對比試劑的參考區(qū)間。

關注點：注意方法學比對的樣本量能否滿足統(tǒng)計學要求，兩檢測系統(tǒng)的檢測結果應高度一致。

例如：超敏C反應蛋白測定試劑盒在直接驗證并轉移參考區(qū)間過程中，申報試劑與比對試劑方法學、工藝不同，參考值不應直接進行轉移，應對檢測結果進行統(tǒng)計分析后得出自己的參考值范圍。

1.3.2 驗證參考區(qū)間

1.3.2.1 小樣本量的驗證

依照CLSI/NCCLS C28-A2[3]、WS/T 402-2012[9]的要求，小樣本量的驗證應選擇至少20例參考個體進行研究。建議制造商、用戶（如醫(yī)院）或接收實驗室采用小樣本量驗證并轉移已建立的參考區(qū)間。驗證通過法則：原始參考區(qū)間外的觀察值不超過2例（即10%）。如超過了2例（即10%），應另選至少20例重新進行驗證[9]。

1.3.2.2 大樣本量的驗證

應選擇至少60例參考個體，參照小樣本量的方法進行驗證。驗證并轉移原始參考區(qū)間時，建議采用大樣本量。

關注點：樣本例數(shù)（含不同組別）是否滿足驗證的要求。驗證前應先做對比評估研究，評估原始參考區(qū)間能否轉移。

例如：尿免疫球蛋白G測定試劑盒直接驗證參考區(qū)間的研究試驗中，樣本例數(shù)應不低于60例。

1.4 其他關注點

在參考區(qū)間研究資料的技術審評過程中，還存在以下常見的問題點，同樣需要引起關注。①參考區(qū)間確定的方法和依據(jù)不詳細；②參考區(qū)間研究樣本的來源不明確；③未對參考區(qū)間試驗資料詳細地總結歸納[10]；④關于非同源樣本，如尿液、血液樣本，應分別建立其參考區(qū)間；如不能證明同源樣本（如血清、血漿、全血）之間的一致性，應分別建立參考區(qū)間；⑤校準品和質控品不需要提交該項研究資料。

例如：肌紅蛋白測定試劑盒在建立參考區(qū)間時，對比試劑肝素血漿、血清與EDTA血漿參考值差異較大，而申報試劑不同樣本類型無差異，應應分別進行不同樣本類型參考值研究；生長激素測定試劑盒宣稱可用于新生兒，則需證明臍帶血樣本與靜脈血樣本之間是否可比，針對每個年齡段、不具可比性樣本應采用至少120例樣本對參考區(qū)間進行研究。

2.案例分析

2.1 案例一：參數(shù)法建立參考區(qū)間

抗凝血酶Ⅲ活性測定試劑盒臨床上主要用于輔助診斷血栓形成性疾病[11]。研究中共篩選了240例經臨床診斷無心血管疾病史或凝血疾病史、未處于妊娠或哺乳期的健康人群，年齡范圍為10～80歲，男女均等。檢驗結果按男女分為兩個亞組經Z檢驗顯示，兩組均值間不存在統(tǒng)計學上的顯著差異（Z0.05）。檢驗結果經K-S和S-W正態(tài)性檢驗呈正態(tài)分布（P均>0.05），可采用參數(shù)法。經查95%參考區(qū)間的參考上下限為X±1.96SD，最終計算95%的參考區(qū)間為：[80%，120%]。

2.2 案例二：非參數(shù)法建立參考區(qū)間

全程C反應蛋白測定試劑盒可作為非特異性炎癥指標[12]和用于評價心血管疾病風險[12]?；诋a品的預期用途，分別建立超敏C反應蛋白和常規(guī)C反應蛋白的參考區(qū)間。研究過程中分別入組400例無心血管疾病和400例無非特異性炎癥的正常人，年齡范圍為0～80歲，男女均等。統(tǒng)計分析根據(jù)年齡、性別差異分為四個亞組，采用Z檢驗對各亞組進行組間比較，經分析樣本中男性和女性、成年與未成年人的C反應蛋白檢測結果之間沒有顯著性差異。所測得的C反應蛋白濃度水平經K-S檢驗數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，可采用百分位數(shù)法。結合該項目的臨床特點取第95百分位數(shù)測試結果作為其參考上限，建立C反應蛋白參考區(qū)間：作為非特異性炎癥指標時為0.00～10.00mg/L；用于評價心血管疾病風險時為0.00～1.00mg/L。

3.小結

產品的參考區(qū)間跟臨床用途緊密聯(lián)系。產品的目標人群、使用環(huán)境、樣本類型及要求、檢測結果的預期用途等，都影響著參考區(qū)間的確立[13]。在往常的申報材料中，企業(yè)針對參考區(qū)間的研究和認識程度遠遠不夠；甚至是上市后，臨床醫(yī)生的使用過程中容易跟其他概念混淆。很多企業(yè)并不理解參考區(qū)間的建立、轉移/驗證的原則，花費了大量的時間和精力去建立常規(guī)試劑盒的參考區(qū)間；在建立入排標準、分組情況時，未能依照產品的個性化需求入組符合要求的“健康人群”；不懂統(tǒng)計方法，無法識別數(shù)據(jù)中的錯誤；更有企業(yè)納入了大量低于線性范圍的數(shù)據(jù)，導致整個驗證結果不科學等[10]。正確了解參考區(qū)間建立的準則與方法，理解和把握整個研究資料的編寫要點，有助于企業(yè)提高自身研發(fā)能力，優(yōu)化產品的臨床性能，科學合理地評價產品，加快產品上市的步伐。