尖唇散白蟻胚胎發(fā)育激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

孫儀林, 王靖怡, 陸 迪, 張 琪

(沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 沈陽 110866)

白蟻屬蜚蠊目(Blattaria)白蟻科(Termitidae)，屬于半變態(tài)昆蟲(Djernaesetal., 2015)。系統(tǒng)發(fā)育分析證明白蟻是蟑螂的姊妹群因而將其從獨立的等翅目劃為蜚蠊目的等翅亞目中(Loetal., 2000; Djernaesetal., 2012, 2015; Legendreetal., 2015)。目前，已知白蟻分為9科292屬2 878種(Engel, 2011; 程冬保, 2012)，我國有白蟻41屬473種(程冬保等, 2014)。白蟻是世界范圍內的破壞性害蟲，每年對房屋建筑、農(nóng)、林、水利、交通等方面造成嚴重的危害和經(jīng)濟損失(龐正平, 2018)。全球每年要花費上百億美元對白蟻進行預防、控制管理以及維護等工作(曹海燕, 2018)。近幾年來，白蟻在我國分布較廣，已從南方向北方遷移，白蟻危害區(qū)域分布的北界已更新至吉林省公主嶺市，在遼寧南部地區(qū)如大連、丹東亦有為害(馬星霞等, 2015)。

根據(jù)早期胚帶發(fā)育類型的不同，昆蟲胚帶分為短胚帶型、中胚帶型和長胚帶型(Patel, 1994)。全變態(tài)昆蟲胚胎經(jīng)歷長胚帶類型的胚胎發(fā)生(Surkovaetal., 2018)。果蠅Drosophila的胚胎沿前后軸方向可分為頭節(jié)、三胸節(jié)和八腹節(jié)，兩末端又分化出原頭與尾節(jié)， 其中胚胎沿背部背腹軸分化為羊漿膜、背部外胚層、腹部外胚層與中胚層(Cinnamonetal., 2004)。全變態(tài)昆蟲胚胎發(fā)育經(jīng)歷卵裂胚盤形成，胚帶與胚膜形成、胚層分化3個階段(欽俊德, 1965)。全變態(tài)昆蟲卵的表面有兩層周質，卵裂時子核以射線型“彗星”狀質體向卵表面遷移，胚盤由此形成；卵黃內有1～2個消黃細胞，形成卵黃球；卵腹面的胚盤細胞增厚為胚帶；漿膜由余下的胚盤細胞發(fā)育而成，漿膜形成之后，羊膜即開始發(fā)生；隨原腸溝出現(xiàn)，胚帶分化為里、外兩層，外層將來形成外胚層，里層形成中胚層和內胚層(崔峰等, 2004)。

半變態(tài)昆蟲胚胎經(jīng)歷短胚帶類型的胚胎發(fā)生(欽俊德, 1965)。半變態(tài)的蛩蠊目、蜚蠊目胚帶均屬于短胚帶型(Uchifune and Machida, 2005; Fujita and Machida, 2017)，缺翅目昆蟲胚帶也歸類為短胚帶型(Mashimoetal., 2014)。白蟻卵的發(fā)育依賴于工蟻的梳理清潔行為，離開巢穴且缺失工蟻照顧的白蟻胚胎無法進行正常孵化，因此白蟻胚胎的產(chǎn)生與收集過程中需要大量的工蟻進行輔助。經(jīng)光學顯微鏡對白蟻胚胎外部觀察，其胚帶類型為半變態(tài)類昆蟲典型的短胚帶型(Hu and Xu, 2005)。然而，雖然該研究通過光學顯微鏡觀察其外部影像從而預測出不同的發(fā)育階段，但散白蟻胚胎具體的發(fā)育時間及其對應過程未有明確結論。

卵孔(受精孔)處于卵殼的表面，是精子進入卵的通道(孫元星等, 2019)。昆蟲卵的卵孔數(shù)目一般在1～20個之間(Kawaguchietal., 2002)。棲北散白蟻Reticulitermessperatus卵孔的有無被證實與生殖方式有關，蟻后通過產(chǎn)出無卵孔的卵進行孤雌生殖，通過產(chǎn)出有卵孔的卵進行兩性生殖(Yashiro and Matsuura, 2014)。隨著蟻后年齡增長，它們開始逐漸產(chǎn)出孤雌生殖的卵作為對兩性生殖的補充(Yashiro and Matsuura, 2014)。另一項研究表明，具有孤雌生殖能力的尖唇散白蟻Reticulitermesaculabialis的兩性卵和孤雌卵卵孔數(shù)沒有顯著性差異，相反，不具備孤雌生殖能力的黑胸散白蟻R.chinensis的卵的卵孔數(shù)有顯著性差異(談彥玲, 2016)。白蟻卵為圓柱形，其卵孔位于鈍端，卵孔呈開放漏斗形(談彥玲等, 2016)。白蟻卵的末端為盾端，前端為尖端，其中卵孔位于卵的末端表面以半圓形排列(Knower, 1900)。昆蟲卵早期在受精時就發(fā)生卵子與精子的原核結合，所形成的接合子細胞核經(jīng)過卵裂而形成很多的細胞核(Kawamura, 2001)。受精卵分裂所形成的很多細胞最初分布在卵黃球之間，并向卵周緣移動，在周緣排列成一單層的細胞，形成囊胚層；少數(shù)停留在卵黃球間的細胞核成為消黃細胞，隨后，在卵腹面的一部分囊胚層細胞發(fā)育呈柱狀，形成胚盤(或稱胚帶)。胚盤部分延長之后，分化成為胚胎；其余的囊胚層細胞組成胚外部分(Mlodzik and Gehring, 1987)。卵孔所在位置為我們指示了卵的前端和末端位置，為描述尖唇散白蟻胚胎發(fā)育過程提供了方向指示。白蟻是古老的社會性昆蟲，也是重要的經(jīng)濟昆蟲，了解白蟻胚胎發(fā)育對解釋白蟻系統(tǒng)發(fā)育和進化及有效防治具有重要意義。本研究通過每日收集尖唇散白蟻卵，對其發(fā)育狀態(tài)進行固定，采用DAPI染劑對尖唇散白蟻胚胎進行染色，通過激光共聚焦掃描顯微鏡(laser confocal scanning microscope, LCSM)成像記錄了尖唇散白蟻胚胎在不同階段的形態(tài)發(fā)展變化。

1 材料與方法

1.1 白蟻來源和飼養(yǎng)

本研究的供試白蟻種群為尖唇散白蟻R.aculabialis。該種群采集于江西省贛州市南康區(qū)(25.658497°N, 114.779166°E)。我們將采集到的白蟻在實驗室內以松木屑為食物，飼養(yǎng)于長×寬=40 cm×60 cm的塑料密閉盒中，每隔7 d補充水分并更換新鮮木屑。

1.2 白蟻卵的收集和離巢飼養(yǎng)

我們將100頭工蟻和1頭兵蟻置于配有濕潤原漿紙和松木條的培養(yǎng)皿中，用封口膜封好，置于溫度25℃、相對濕度70%～80%的養(yǎng)蟲室避光飼養(yǎng)以誘導無翅繁殖蟻。待誘導完成后大約30 d收集無翅繁殖蟻產(chǎn)出的卵。我們將卵置于含有200 μL雙蒸餾水的離心管中低速震蕩清除表面的雜質和病原菌后，轉移到含有0.2 mg/mL四環(huán)素和0.2 mg/mL多菌靈的1.5%瓊脂糖培養(yǎng)基上，用封口膜封口，放入恒溫箱避光放置，在不同發(fā)育天數(shù)取出用于拍攝發(fā)育情況。本次實驗共使用了216枚尖唇散白蟻卵。

1.3 胚胎掃描電鏡觀察

用10%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定尖唇散白蟻胚胎，再將其按照30%, 50%, 70%, 90%和100%乙醇分級進行脫水。 之后使用臨界點干燥器將卵進行干燥，噴金，使用日立S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡在15 kV時進行觀察(Mashimoetal., 2014)。

1.4 胚胎染色和激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

將收集好的不同發(fā)育天數(shù)的尖唇散白蟻卵置于-80℃冰箱冷凍處理10 min，用30%次氯酸鈉(NaClO)對卵殼進行軟化，再用1×PBS緩沖液(pH 7.4)潤洗3次后，使用10%多聚甲醛(paraformaldehyde)室溫下固定1 h，加入預先配好的染色液(DAPI∶PBS=1∶1 000, v/v)，室溫下避光染色16 h，后用1×PBS清洗3次(Tyleretal., 2013)。將染色的卵置于載玻片上以50%甘油密封，利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察胚胎發(fā)育情況。

2 結果

2.1 尖唇散白蟻卵的卵孔

本研究通過掃描電鏡對尖唇散白蟻的卵孔進行了觀察(圖1: A)，卵孔敞開呈漏斗形且四周帶有細密褶皺；通過顯微拍攝對卵孔位置的觀察，定位了卵的前后端方向(圖1: B)。

圖1 尖唇散白蟻卵孔掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 1 Scanning electron microscope photos of Reticulitermes aculabialis egg micropylesA: 卵孔Egg micropyle; B: 卵外部形態(tài)及卵孔External morphology of egg and egg micropyle. 箭頭指示卵孔。Egg micropyles are indicated by arrows.

2.2 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育階段

根據(jù)激光共聚焦掃描顯微鏡成像下DAPI染色獲得的尖唇散白蟻胚胎形態(tài)特征，本研究將尖唇散白蟻胚胎發(fā)育劃分為12個階段。

第1階段：第1和2天——卵裂期。經(jīng)過1～2次分裂后，在第1天有十余個細胞核進一步分裂并擴散到卵表面。從0-24 h到第2天的胚胎經(jīng)歷有絲分裂，細胞核自由地分布于卵黃中(圖2: A)。在第2天，大多數(shù)細胞核隨遷移同步分裂，完成解離階段(圖2: B)。第2天開始，隨著分裂的進行，均勻分布的細胞進一步分化并遷移到周圍形成胚層。

圖2 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第1階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 2 Photos of the 1st stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第1天卵1-day-old egg; B: 第2天卵2-day-old egg. 白色箭頭指示卵核。Egg nucleus is indicated by white arrows.

第2階段：第3天——準備期。數(shù)十個細胞核從整個卵分離到后邊緣的凸面，形成一個由細胞濃縮而成的合胞胚層。濃縮的合胞胚層形成于后周的背側，即胚胎區(qū)，卵黃中只剩下少量卵黃細胞(圖3)。

圖3 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第2階段第3天卵DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 3 Photos of the 3-day-old egg of the 2nd stage of the embryonic development of Reticulitermesaculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI staining白色箭頭指示卵核。Egg nucleus is indicated by white arrows.

第3階段：第4和5天——胚層形成。胚層由非常薄的一層密集細胞構成，多個胚胎原基排列成球狀結構作為胚胎盤，一個高密度的胚泡被濃縮，并在后端融合成一個近圓盤狀結構(圖4: A)。胚盤細胞變扁收縮向卵內遷移；濃縮的胚盤細胞在卵的后部增殖并形成胚層，使?jié){膜細胞和次級卵黃細胞向各個方向分離；密集的胚盤從卵末端向中間移動；由細胞組成的胚層大小均勻地分布在卵內(圖4: B)。

圖4 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第3階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 4 Photos of the 3rd stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第4天卵4-day-old egg; B: 第5天卵5-day-old egg. 白色箭頭指示胚層。Germ layer is indicated by white arrows.

第4階段：第6天——早期胚帶形成。細胞聚集到后端形成早期胚帶(圖5: A)。新形成的胚盤在卵的后端沿末端內表面拉長；原始胚帶的前端朝向卵的后軸代表頭葉，后延伸至卵的前極作為腹部；早期胚帶被覆蓋，并沿卵末端向前端進一步伸長(圖5: B)。

圖5 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第4階段第6天卵DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 5 Photos of the 6-day-old egg of the 4th stage of the embryonic development of Reticulitermesaculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 細胞聚集到卵后端形成早期胚帶Cells gathered at the back end of the egg to form early germ band; B: 早期胚帶被覆蓋，并沿卵末端向前端進一步伸長The early germ band was covered and further elongated along the front end of the egg. 白色箭頭指示早期胚帶。Early germ band is indicated by white arrows.

第5階段：第7天——開始分裂。胚胎出現(xiàn)短生殖帶，后端沿著漿膜向卵的前極移動；在分裂過程中發(fā)生胚胎內陷，縱向原腸溝出現(xiàn)；胚帶隨拉長和加厚逐漸清晰，可分化為胚胎的頭區(qū)和原球莖區(qū)(圖6)。

圖6 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第5階段第7天卵DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 6 Photo of the 7-day-old egg of the 5th stage of the embryonic development of Reticulitermesaculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI staining白色箭頭指示胚芽。Germ anlage is indicated by white arrows.

第6階段：第8和9天——胚帶的伸長與分節(jié)。胚帶沿著內表面在卵黃中繼續(xù)向上伸長。當1/3的胚帶向上伸長時，在卵的背側成U形(圖7: A)；胚帶從卵的外層與原始生殖層中分化出來(圖7: B)；胚胎開始拉長，主頭葉顯著伸展；胚胎末端向卵前極伸長，腹部開始分節(jié)(圖7: C)。

圖7 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第6階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 7 Photos of the 6th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第8天卵8-day-old egg; B: 第9天卵9-day-old egg; C: 第9天卵胚帶Germ band of the 9-day-old egg. 白色箭頭指示胚帶，桔色箭頭指示主頭葉，紅色箭頭指示胚帶末端。Germ band is indicated by white arrows, head lobe by orange arrow, and caudal end of germ band by red arrows.

第7階段：第10-12天——腹部分節(jié)，出現(xiàn)雙曲結構。胚帶逐漸變寬和增厚且長度超過卵的全長，胸部腹部開始分節(jié) (圖8: A)；胚帶彎曲，出現(xiàn)上頜骨、下唇、前、中、后胸、上頜、前、中、后足結構(圖8: B)；胚帶出現(xiàn)明顯彎曲結構，前后軸未逆轉。(圖8: C)。

圖8 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第7階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 8 Photos of the 7th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第10天卵10-day-old egg; B: 第11天卵11-day-old egg; C: 第12天卵12- day-old egg. 黃色箭頭指示胸部分節(jié)，藍色箭頭指示腹部分節(jié)，白色箭頭指示胚帶，紅色箭頭指示彎曲結構。Thoracic segment is indicated by yellow arrows, abdominal segmentation by blue arrows, germ band by white arrows, and caudal flexure by red arrows.

第8階段：第13-15天——分節(jié)和生長和兩次旋轉。胚胎完全浸沒在卵中并進一步生長，在腹部末端形成刷狀結構。頭部進一步擴大并向后彎曲，背側閉合 (圖9: A)。胚帶伸長，分節(jié)范圍進一步擴大；頭囊迅速分化，觸角和口器開始形成；頭葉向后彎曲至末端并開始內卷，隨著頭葉變寬，觸角逐漸明顯；尾部在卵后端向內彎曲變寬；此階段胚胎完成伸展，胸腹開始分節(jié)；胚胎縮短變粗，觸角被拉長并開始分節(jié)；頭部從后極轉向前極 (圖9: B)。頭部和腹部同時伸展，頭部的方向由后極向前極發(fā)生了反向變化(圖9: C, D)。

圖9 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第8階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 9 Photos of the 8th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第13天卵13-day-old egg; B: 第14天卵14-day-old egg; C, D: 第15天卵15-day-old egg. 白色箭頭指示頭部，紫色箭頭指示觸角，桔色箭頭指示腹部。Head is indicated by white arrows, antenna by purple arrows, and abdomen by orange arrows.

第9階段：第16和17天——快速發(fā)育。胚胎沿著卵背側并向卵前端進一步伸長。末端呈彎鉤狀(圖10: A)。背側發(fā)生閉合并隨著胚胎下降而向后彎曲；胚胎高度收縮，頭部呈朝上且向后狀態(tài)，頭和胸部在第16天到達卵末端；隨著頭和腹部位置的改變，胚胎從第16天到第17天進一步擴大生長，頭部和胸部向后彎曲并延伸到背側，上頜與附肢在后極處面向卵內；腹部向卵的中間區(qū)域略微下沉，隨著胚胎進一步變寬伸長，腹部明顯地向腹面卷曲(圖10: B)。胚胎幾乎占據(jù)卵體積的一半。

圖10 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第9階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 10 Photos of the 9th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under of laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第16天卵16-day-old egg; B: 第17天卵17-day-old egg. 白色箭頭指示頭部，綠色箭頭指示觸角，桔色箭頭指示腹部，紫色箭頭指示附肢，藍色箭頭指示上顎。Head is indicated by white arrows, antenna by green arrows, abdomen by orange arrows, appendage by purple arrows, and maxilla by blue arrows.

第10階段：第18-20天——附肢發(fā)育明顯。胚胎占據(jù)卵中大部分空間；背側閉合完全，頭葉進一步擴大，變成球狀并向后彎曲(圖11: A)。與前一階段相比胸部明顯伸長 (圖11: B)。頭部向后彎曲近乎45°；以下頜區(qū)面向卵后端；腹部分節(jié)清晰可見，胚胎呈直線狀，位置靠近卵的內側(圖11: C)。

圖11 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第10階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 11 Photos of the 10th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第18天卵18-day-old egg; B: 第19天卵19-day-old egg; C: 第20天卵20-day-old egg. 白色箭頭指示頭部，綠色箭頭指示觸角，桔色箭頭指示腹部，紫色箭頭指示附肢，藍色箭頭指示下顎。Head is indicated by white arrows, antenna by green arrows, abdomen by orange arrows, appendage by purple arrows, and mandible by blue arrows.

第11階段： 第21-24 天——內部器官迅速發(fā)育。 隨著胚胎生長的進一步發(fā)展，胚胎占據(jù)卵的全部空間，其中頭部和腹部分別延伸到卵的末端和前端(圖12: A)。內部器官發(fā)育良好，頭囊完整，頭葉增大，唇延伸覆蓋下頜；最終形成頭部向卵的腹側彎曲形態(tài)；觸角鞭毛繼續(xù)拉長并進一步細分(圖12: B, C, D)。

圖12 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第11階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 12 Photos of the 11th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第21天卵21-day-old egg; B: 第22天卵22-day-old egg; C: 第23天卵23-day-old egg; D: 第24天卵24-day-old egg. 白色箭頭指示頭部，綠色箭頭指示觸角，桔色箭頭指示腹部，紫色箭頭指示足，藍色箭頭指示下顎。Head is indicated by white arrows, antenna by green arrows, abdomen by orange arrows, leg by purple arrows, and mandible by blue arrows.

第12階段：第25-30天——完成發(fā)育并孵化。胚胎進一步發(fā)育使頭部完全融合在背部區(qū)域，下頜拉長并加寬，觸角進一步拉長(圖13: A, B)。下顎清晰可見，幼蟲表皮發(fā)育完全，腹部有剛毛(圖13: B, F)。胚胎在卵包膜內移動；胚胎的折疊方向為腹彎或背伸(圖13: C, D, E)。胚胎頭部擠壓卵殼，并于被中縫處將其擠破，胚胎發(fā)育過程全部完成。胚胎在工蟻的幫助下，整個身體從卵殼中孵化而出(圖13: F)。同時，尖唇散白蟻胚胎發(fā)育后期的觸角、剛毛、觸角分節(jié)，腹部剛毛、腹部分節(jié)、前中后足、上顎、下顎以局部放大形式展現(xiàn)，可以準確識別其發(fā)育歷期及各部分的發(fā)育特征(圖14)。

圖13 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育第12階段DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 13 Photos of the 12th stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第25天卵25-day-old egg; B: 第26天卵26-day-old egg; C: 第27天卵27-day-old egg; D: 第28天卵28-day-old egg; E: 第29天卵29-day-old egg; F: 第30天卵30-day-old egg. 白色箭頭指示頭部，綠色箭頭指示觸角，桔色箭頭指示腹部，紫色箭頭指示足，藍色箭頭指示下顎。Head is indicated by white arrows, antenna by green arrows, abdomen by orange arrows, leg by purple arrows, and mandible by blue arrows.

圖14 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育末期胚胎DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡局部放大照片F(xiàn)ig. 14 Enlarged photos of partial embryo in the late stage of the embryonic development of Reticulitermes aculabialistaken under laser confocal microscope after DAPI stainingA: 第22天卵22-day-old egg; B: 第27天卵27-day-old egg; C: 第30天卵30-day-old egg. 白色箭頭指示觸角，桔色箭頭指示腹部剛毛，綠色箭頭指示腹部分節(jié)，藍色箭頭指示前中后足，紅色箭頭指示上顎，紫色箭頭指示下顎。Antenna is indicated by white arrows, abdominal seta by orange arrows, abdominal segmentation by green arrows, fore, mid and hind legs by blue arrows, maxilla by red arrows, and mandible by purple arrows.

我們通過整合各個階段的發(fā)育特征圖片將尖唇散白蟻胚胎動態(tài)發(fā)育全過程整體地展示了出來(圖15)。通過此項研究，我們完整地描述了尖唇散白蟻胚胎從細胞分化到發(fā)育完成全過程并對各個發(fā)育階段進行了清晰的圖片采集和形態(tài)展示(圖15)。

圖15 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育全過程DAPI染色后激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 15 Photos of the whole process of the embryonic development of Reticulitermes aculabialis taken under laser confocal microscope after DAPI staining

圖16 尖唇散白蟻胚胎發(fā)育12個階段全過程示意圖Fig. 16 Schematic diagrams of the 12 stages of the embryonic development of Reticulitermes aculabialisA: 第1階段The 1st stage; B: 第2階段The 2nd stage; C: 第3階段The 3rd stage; D: 第4階段The 4th stage; E: 第5階段The 5th stage; F: 第6階段The 6th stage; G: 第7階段The 7th stage; H: 第8階段The 8th stage； I: 第9階段The 9th stage; J: 第10階段The 10th stage; K: 第11階段The 11th staget; L: 第12階段The 12th stage.

3 討論與結論

3.1 蜚蠊目及其近緣昆蟲胚胎的發(fā)育階段及其特征

在模式昆蟲果蠅中，研究者按照不同發(fā)育階段將胚胎發(fā)育全程形態(tài)學變化分為10～14個階段(Gaoetal., 1996)。 西伯利亞蝗Gomphocerussibiricus的胚胎發(fā)育被分為12個階段(閆蒙云等, 2018)。作為與白蟻親緣關系較近的蜚蠊目蟑螂的胚胎發(fā)育階段分為12個(Djernaesetal., 2015; Fujita and Machida, 2017)。古老而稀有的缺翅目昆蟲胚胎發(fā)育也按照形態(tài)學變化分為了12個階段(Mashimoetal., 2014)。以上研究為本項目在尖唇散白蟻胚胎發(fā)育階段的劃分提供了依據(jù)與借鑒。

針對白蟻的胚胎發(fā)育研究首次由Knower對里佩特象白蟻Nasutitermesrippertii開展，該研究主要針對白蟻卵的卵孔形態(tài)，位置及胚胎的胚帶進行了描述。同時，該研究者還將后麻頭堆砂白蟻Cryptotermesbrevis的發(fā)育和胚胎變化進行了解剖圖解(Knower, 1900)。之后，人們運用光學顯微鏡對北美散白蟻Reticulitermesflavipes的胚胎動態(tài)變化進行外部形態(tài)觀察，將胚胎發(fā)育分成了卵裂和囊胚的形成、胚盤和胚帶的形成、伸長和分節(jié)、形成尾彎、旋轉和閉合、孵化6個階段(Hu and Xu, 2005)。盡管該研究對白蟻胚胎進行了外部形態(tài)的觀察，但并未對白蟻胚胎的發(fā)育進行細胞水平的觀察及對其發(fā)育的動態(tài)過程進行詳細解釋。我們的研究對白蟻胚胎發(fā)育進行了更為深入的觀察和描述，在囊胚層形成前我們發(fā)現(xiàn)數(shù)十個細胞從卵分離到后邊緣的凸面，形成合胞胚層(圖3: A)。

3.2 昆蟲胚盤及胚帶發(fā)育類型

昆蟲的胚胎發(fā)生經(jīng)歷精子和卵子的原核結合和有絲分裂 (Kawamura, 2001)。在一些昆蟲(如果蠅)中，這種早期胚盤是合胞體，由圍繞卵黃的一層細胞核組成，最終，這個胚盤將細胞化，形成一個細胞胚盤，其本質上是一層細胞；在其他昆蟲(如蝗蟲)中，合胞體胚盤沒有延長，細胞核在到達卵的表面后立即或很快細胞化(Sander, 1983)。此時，胚盤的一部分被指定為胚胎原基，而其余部分形成了胚外組織。在本研究的尖唇散白蟻中，受精卵核分裂后聚集形成合胞體胚盤，合胞體胚盤未發(fā)生延長，細胞分裂與細胞胚層分化完成后形成漿膜，胚胎延伸至卵的腹面后進行生長與分化(圖4)。

關于胚胎分節(jié)的模式化時間和方式，研究者將昆蟲胚帶分為3種胚胎發(fā)生模式：短胚帶型、中胚帶型和長胚帶型胚胎發(fā)生(Patel, 1994)。短胚芽、中胚芽和長胚芽現(xiàn)在被用來描述胚芽原基的初始大小和胚胎發(fā)生的差異(Sander, 1983)。那些尚未從胚芽原基的短后部區(qū)域(片段形成區(qū)或生長區(qū))中指定的片段亦在發(fā)育過程中經(jīng)歷了大量生長。因此，盡管在腹前原基的生長期內的整個胚胎分節(jié)都是由低比例的亞分節(jié)完成的，但短胚帶型昆蟲的分節(jié)需要一個次級生長階段，再加上更多后續(xù)的指定過程才可完成發(fā)育(Shimizu, 2013)。

蜚蠊胚胎經(jīng)歷短胚帶類型的胚胎發(fā)生，并在卵的腹側伸長至其全長。一種沒有分裂跡象的小型心形胚胎形成，隨著從前到后連續(xù)分裂，胚帶隨生長而拉長，這是一種典型的短胚帶胚胎發(fā)生類型(Fujita and Machida, 2017)，在其他蜚蠊中也有發(fā)現(xiàn)：例如美洲大蠊Periplanetaamericana(Lenoir-Rousseaux and Lender, 1970)和德國小蠊Blattellagermanica(Wheeler, 1889)。這種發(fā)育類型在無翅目昆蟲和古翅目昆蟲中占主導地位(Djernaesetal., 2012, 2015)，是該譜系的一個基本特征。而白蟻的胚胎發(fā)育模式與直翅目相似(Knower, 1900)。首先，白蟻和直翅目昆蟲均屬于短胚帶型，胚胎從一個圓盤狀的雛形開始延伸，發(fā)育過程僅發(fā)生在其尾部的前后序列。而蜚蠊胚胎則沿著其胚胎雛形發(fā)育而來，在兩端進行延伸(Fujita and Machida, 2017)。第二，白蟻和直翅目及蜻蜓目，在胚帶伸長過程中均形成尾部彎曲，但蜚蠊在發(fā)育過程中則沒有這個階段(Knower, 1900)。第三，白蟻和某些蝗蟲的胚胎發(fā)育通過圍繞一個或兩個卵軸旋轉來改變其胚胎位置(囊胚形成)，而蜚蠊胚胎則保持相同的位置不變，直到整個發(fā)育階段結束 (Kawanishi, 1975)。

3.3 蜚蠊目昆蟲胚胎發(fā)育過程中的兩極反轉

蜚蠊的胚胎在發(fā)育過程中前后軸從未發(fā)生逆轉，為非逆轉型(Fujita and Machida, 2017)。蜚蠊的胚胎由成對的胚盤區(qū)域融合而成，在卵的腹側有較高的細胞密度，其胚胎發(fā)育具有如下4個重要特征：(1)胚胎是由具有較高細胞密度的配對胚層區(qū)域融合形成的；(2)胚胎經(jīng)歷短胚帶類型的胚胎發(fā)生，節(jié)段向后依次分化；(3)胚胎在卵表面拉長到完整長度；(4)發(fā)生背側閉合，最后胚胎獲得其確定形式，在卵的前后軸保持其原始位置而非腹側(Fujita and Machida, 2017)?！熬奂诼迅箓鹊穆芽住笔球泱古咛グl(fā)育的共同特征(Fujita and Machida, 2014)。白蟻的卵孔位于卵的“背側”(Mukerji, 1970)。白蟻的胚胎雛形位于卵后凸區(qū)的胚帶，胚盤延長伴隨著前后序列的連續(xù)節(jié)段形成，胚帶的末端沿著后極周圍的邊緣向卵的前極前進。胚胎的持續(xù)延長導致卵在前極出現(xiàn)特征性的雙尾彎曲，完成體節(jié)分節(jié)后發(fā)生旋轉(囊胚運動)，并在此過程中觀察到兩個連續(xù)的旋轉(Hu and Xu, 2005)。我們觀察到在白蟻胚胎發(fā)育的第8階段胚胎頭部首先擴大，伸長，向后彎曲至極末端并開始內卷，后隨著胚胎的縮短變粗，頭部沿卵的內壁，由后極向前極改變位置(圖9)。

一般來說，來自不同科的白蟻具有相似的胚胎發(fā)育模式(Mukerji, 1970)。半變態(tài)昆蟲有較短的胚帶類型，占據(jù)更多的運動空間使其在胚胎發(fā)育過程中顯示出明顯的囊胚形成運動(Kristensen, 2009)。進化等級較低的白蟻(如木白蟻科和草白蟻科)的卵相對較大，它們的胚胎圍繞兩個軸經(jīng)歷了一個連續(xù)進化的運動(Geigy and Striebel, 1959)。此外，在整個發(fā)育過程中，它們的胚胎仍保持在卵表面的位置。相比之下，進化等級較高的白蟻(白蟻科)的卵相對較小，只繞短軸旋轉一次，胚胎的腹部區(qū)域在旋轉之前進入卵黃細胞中(Jaeger, 2011)。

3.4 結論

本研究依據(jù)Matsuura和Kobayashi(2007)將白蟻胚胎分離消毒并置于含0.2 mg/mL四環(huán)素的瓊脂糖平板上對白蟻卵殼抑菌處理，成功完成了人工離巢飼養(yǎng)，通過減少實驗中工蟻的用量而創(chuàng)新地優(yōu)化了實驗方法。根據(jù)本實驗的結果，尖唇散白蟻胚胎發(fā)育的過程中，除最后的孵化過程需要工蟻將卵咬破，才可使已經(jīng)成型的胚胎正常孵化之外，其余人工離巢飼養(yǎng)的尖唇散白蟻胚胎與正常巢穴發(fā)育的尖唇散白蟻胚胎發(fā)育歷期一致。

此外，本研究研制出了一套可以對白蟻胚胎的不同發(fā)育階段進行全胚胎染色的方法，通過激光共聚焦顯微鏡觀察并記錄了白蟻胚胎發(fā)育的全過程，明確揭示了白蟻胚胎發(fā)育各個階段的主要特征。我們將全過程分為12個階段(圖16)——卵裂期、準備期、胚層形成、早期胚帶形成、開始分裂、胚帶伸長與分節(jié)、腹部分節(jié)并出現(xiàn)雙曲結構、發(fā)生兩次旋轉、快速發(fā)育、附肢發(fā)育明顯、內部器官迅速發(fā)育和發(fā)育完成,并對全部過程進行了描述。

綜上所述，本研究通過觀察對尖唇散白蟻R.aculabialis卵的產(chǎn)生收集與胚胎發(fā)育，探索出更加系統(tǒng)的尖唇散白蟻胚胎體外人工培養(yǎng)、卵殼軟化與觀察方法，系統(tǒng)地了解了胚胎發(fā)育的毎日変化，并將其與其親緣關系相近的物種進行了發(fā)育過程中各個階段的比較，為揭示白蟻的胚胎發(fā)育提供理論依據(jù)。